Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 17
1.1. Дыхательные расстройства новорожденных в современной перинатальной патологии 17
1.2. Бактериальные осложнения и их роль в перинатальной патологии 21
1.3. Апоптоз иммунокомпетентных клеток, его значимость в развитии критических состояний и бактериальных осложнений 24
1.4. Медикаментозная коррекция апоптоза как терапевтическая стратегия... з 1
1.5. Рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в терапии критических состояний 37
1.6. Ингаляционный оксид азота в терапии критических состояний 41
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 47
2.1. Методы исследования 47
2.2. Клиническая характеристика пациентов ,
ГЛАВА III. Клинико-диагностическое значение активации апоптоза лимфоцитов у новорожденных с респираторной патологией 81
3.1. Клинико-диагностическое значение относительного содержания лимфоцитов в апоптозе у новорожденных с респираторной патологией при поступлении в ОРИТ 81
3.2. Влияние активности апоптоза лимфоцитов на частоту развития сепсиса, летального исхода, продолжительность проведения ИВЛ и пребывания в ОРИТ у новорожденных с респираторной патологией 96
3.3. Клинико-диагностическое значение активности апоптоза лимфоцитов в динамике заболевания у новорожденных с респираторной патологией, получавших традиционную интенсивную терапию
3.4. Клинико-диагностическое значение активности апоптоза лимфоцитов в зависимости от исходов заболевания у новорожденных с респираторной патологией, получавших стандартную интенсивную терапию 123
3.5. Клинико-диагностическое значение активности апоптоза лимфоцитов в развитии неонатального сепсиса у новорожденных с респираторной патологией, получавших стандартную интенсивную терапию 1
3.6. Построение классификатора развития сепсиса в среде статистического анализа данных (пакет R)
ГЛАВА IV. Коррекция апоптоза лимфоцитов филграстимом у новорожденных с респираторной патологией 153
4.1. Стратегия коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом у
новорожденных с респираторной патологией, находящихся на ИВ Л
4.2. Оценка эффективности коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом по частоте развития бактериального сепсиса и летального исхода в изучаемой популяции
4.3. Оценка эффективности коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом по длительности ИВЛ и продолжительности госпитализации
4.4. Изменение показателей клинико-биохимического мониторинга при проведении коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом
4.5. Гематологические изменения при коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом
4.6. Изменение плазменной концентрации изучаемых цитокинов и оксида азота при коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом 1
4.7. Изменение субпопуляционного и популяционного состава лимфоцитов при коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом 1 ,
4.8. Фармакоэкономическая оценка коррекции апоптоза филграстимом lol
ГЛАВА V. Коррекция апоптоза лимфоцитов ингаляционным оксидом азота у новорожденных с респираторной патологией 183
5.1. Стратегия коррекции апоптоза лимфоцитов HNO 183
5.2. Оценка эффективности коррекции апоптоза лимфоцитов HNO ПО частоте развития бактериального сепсиса и летального исхода в изучаемой популяции 187
5.3. Оценка эффективности коррекции апоптоза лимфоцитов HNO ПО длительности ИВЛ и продолжительности госпитализации 193
5.4. Изменение показателей клинико-биохимического мониторинга при проведении коррекции апоптоза лимфоцитов HNO 195
5.5. Гематологические изменения при коррекции апоптоза лимфоцитов иШ 203
5.6. Изменение плазменной концентрации изучаемых цитокинов и оксида азота при коррекции апоптоза лимфоцитов HNO „,
5.7. Изменение субпопуляционного и популяционного состава лимфоцитовпри коррекции апоптоза лимфоцитов HNO 1
5.8. Изменение активности ПОЛ, АОС, апоптоза лимфоцитов и синтеза эндогенного N0 при коррекции апоптоза лимфоцитов HNO
5.9. Фармакоэкономическая оценка коррекции апоптоза лимфоцитов иШ 224
Заключение 226
Список сокращений 242
Указатель литературы
2
- Апоптоз иммунокомпетентных клеток, его значимость в развитии критических состояний и бактериальных осложнений
- Клиническая характеристика пациентов
- Клинико-диагностическое значение активности апоптоза лимфоцитов в зависимости от исходов заболевания у новорожденных с респираторной патологией, получавших стандартную интенсивную терапию
- Изменение показателей клинико-биохимического мониторинга при проведении коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом
Введение к работе
Актуальность проблемы
Начало XXI века совпало со стремительным развитием медицинской науки и впечатляющими успехами в снижении перинатальной смертности (Володин Н.Н. и соавт., 2014; Байбарина Е.Н., Дегтярев Д.Н., 2016; Шабалов Н.П., 2016). Но вероятность развития бактериальных осложнений у новорожденных с дыхательными расстройствами, находящихся на ИВЛ, составляет 24-50% (Антонов А.Г. и соавт., 2011; Лекманов А.У., Миронов П.И., 2013; Гомелла Т.Л., Каннингам М.Д., Эяль Ф.Г., 2015; Dellinger R.P., Levy М.М. et al., 2013). Эти обстоятельства подтверждают необходимость разработки новых, эффективных методов профилактики и интенсивной терапии сепсиса.
Результаты ряда научных исследований, в том числе, собственных, указывают на высокую активность апоптоза лимфоцитов при развитии нейтропении и бактериальных осложнений у данного контингента пациентов (Самсыгина Г.А., 2003; Эстрин В.В., Пухтинская М.Г., Ефанова Е.А., 2007; Савельев B.C., Гельфанд Б.Р., 2011; ДудареваМ.В., 2013).
Дальнейшее изучение патогенеза апоптоза лимфоцитов чрезвычайно актуально не только с академической точки зрения. Такие исследования позволят уточнить его клинико-диагностическое значение и разработать новый метод интенсивной терапии, основанный на принципе коррекции активности апоптоза лимфоцитов.
С точки зрения существующих правовых, врачебных и этических норм, при оценке возможности медикаментозной коррекции апоптоза лимфоцитов необходимо учитывать степень обоснованности и безопасности подобного терапевтического вмешательства. Таким образом, возможность управления активностью апоптоза ограничена отсутствием точных знаний и детального понимания происходящих процессов.
Степень разработанности научной темы исследования
Изучению характера ответа лимфоцитов на активационный сигнал у новорожденных посвящена серия работ В.Ю. Талаева (Талаев В.Ю. и соавт., 1997-2000). Активация апоптоза лимфоцитов при развитии нейтропении и реализации бактериальных осложнений у новорожденных с респираторной патологией, находящихся на ИВЛ, подтверждена результатами научных исследований (Эстрин В.В. и соавт., 2007). Доказано, что у новорожденных повышена экспрессия молекул CD95, участвующих в реализации апоптоза зрелых лимфоцитов (Algecira-Schimnich A. et al., 1999; Aydin С. et al., 2007; Adams С. et al, 2008; Buneker С et al, 2009; Дударева M.B., 2013).
И, тем не менее, в сфере изучения процесса апоптоза ИКК остается невыясненным ряд весьма значимых вопросов, от решения которых зависит не только формирование основополагающих теоретических представлений, но и эффективность работы клиницистов. Прежде всего, речь идет об уточнении клинико-диагностической значимости активности апоптоза лимфоцитов; о
существовании или отсутствии взаимосвязи между частотой развития нейтропении, бактериальных осложнений, летального исхода заболевания, продолжительностью проведения ИВЛ, длительностью госпитализации в ОРИТ и содержанием лимфоцитов, коммитированных к апоптозу и находящихся в апоптозе. Наконец, о возможности, эффективности и безопасности медикаментозного управления этим процессом.
Кроме того, дальнейшие исследования позволят определить высокочувствительные маркеры превентивной диагностики бактериальных осложнений, летального исхода заболевания; изучить возможность внедрения в клиническую практику нового метода профилактики и терапии неонатального сепсиса, основанного на принципе регуляции активности апоптоза.
Уместно упомянуть, что в экспериментальных исследованиях были получены положительные результаты ингибирования апоптоза лимфоцитов при сепсисе с улучшением прогноза заболевания (Oberholzer С, Oberholzer А., Clare-Salzler М., Moldawer L.L., 2001). Однако в научной литературе отсутствуют данные о медикаментозной коррекции апоптоза иммунокомпетентных клеток у новорожденных в критических состояниях.
Таким образом, необходимость решения обозначенных проблем определила актуальность настоящего исследования, его целей и задач.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось повышение эффективности интенсивной терапии у новорожденных с респираторной патологией, находящихся на ИВЛ, путем коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом и ингаляционным оксидом азота, основанной на изучении патогенетических механизмов клеточной альтерации.
Для достижения поставленной цели решались оперативные задачи:
1. Определить клинико-диагностическое значение относительного
содержания лимфоцитов в апоптозе при поступлении новорожденных с
респираторной патологией, находящихся на ИВЛ, в ОРИТ.
-
Оценить влияние активности апоптоза лимфоцитов на частоту развития сепсиса и летальных исходов заболевания; длительность проведения ИВЛ, продолжительность госпитализации у пациентов, получавших традиционную интенсивную терапию.
-
Исследовать изменение активности апоптоза, популяционного состава лимфоцитов, цитокинового баланса, концентрации оксида азота в динамике заболевания у новорожденных с респираторной патологией, находящихся на ИВЛ, с позиции изучения патогенетических механизмов клеточной альтерации, развития нейтропении, сепсиса, исхода заболевания.
4. Обосновать возможность медикаментозной коррекции апоптоза
лимфоцитов у изучаемого контингента пациентов, опираясь на результаты
изучения патогенетических механизмов клеточной альтерации.
5. Разработать информативные критерии, позволяющие прогнозировать
развитие нейтропении, сепсиса и неблагоприятного исхода заболевания у
пациентов с респираторной патологией и аппаратным протезированием дыхания.
-
Провести контролируемое рандомизированное клиническое испытание коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом у новорожденных с респираторной патологией и относительным содержанием лимфоцитов, экспрессирующих AnnexinV-FITC+Pr свыше 10,6% и AnnexinV-FITC+PI+ свыше 0,56%.
-
Провести контролируемое рандомизированное клиническое испытание коррекции апоптоза лимфоцитов ингаляционным оксидом азота у новорожденных с респираторной патологией и относительным содержанием лимфоцитов, экспрессирующих AnnexinV-FITC+Pr менее 10,6% и AnnexinV-FITC+PI+ менее 0,56%.
8. Изучить влияние ингаляционного оксида азота на изменение
активности перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и
эндогенного синтеза N0 в динамике заболевания у новорожденных с
респираторной патологией, находящихся на искусственной вентиляции легких.
9. Разработать критерии проведения коррекции апоптоза лимфоцитов
филграстимом и ингаляционным оксидом азота у изучаемого контингента
пациентов.
Научная новизна исследования
В исследовании впервые установлено, что у доношенных новорожденных с респираторной патологией, находящихся на искусственной вентиляции легких:
относительное содержание лимфоцитов, экспрессирующих AnnexinV-FITC+PI" свыше 10,60% и AnnexinV-FITC+PI+ свыше 0,56%, является биологическим маркером тяжелой иммунологической дисфункции и снижения противоинфекционной резистентности; указывает на высокую вероятность развития нейтропении, сепсиса, летального исхода заболевания, длительного проведения ИВЛ и продолжительной госпитализации в реанимации;
активация апоптоза лимфоцитов в динамике заболевания обусловлена превалированием процессов альтерации иммунокомпетентных клеток над пролиферацией и сопровождается значительными изменениями цитокинового и субпопуляционного состава: снижением концентрации эндогенного NO, G-CSF, ФРФ, sFAS, стволовых клеток (CD34 ); увеличением концентрации TNF-a, экспрессией CD69+, CD71+, CD95+на лимфоцитах;
- с относительным содержание в дебюте заболевания лимфоцитов,
экспрессирующих AnnexinV-FITC+Pr свыше 10,60% и AnnexinV-FITC+PI+
свыше 0,56%, в динамике происходит неконтролируемое нарастание апоптоза
лимфоцитов с развитием к 3-5 суткам нейтропении и формированием тяжелого
апоптогенного иммунодефицитного состояния;
- основой патогенеза развития нейтропении являются: низкое содержание
плюрипотентных стволовых клеток (CD34 ), эндогенного оксида азота (NO),
ростового G-CSF, провоспалительного IL-8, пролиферативного ФРФ (FGF) и
антиапоптогенного sFas; сопровождается высоким содержанием лимфоцитов, коммитированных и находящихся в апоптозе;
в первые дни жизни сохраняется достаточный костно-мозговой резерв плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток, который истощается к 3-5 суткам госпитализации;
в дебюте заболевания определяется низкая концентрация оксида азота в плазме;
- снижение плазменной концентрации эндогенного N0 менее 7,3
мкмоль/литр является биологическим маркером развития неонатального
сепсиса;
- ингаляция оксидом азота в дозе 10 ррт с экспозицией 48 повышает
концентрацию супероксиддисмутазы, глютатионпероксидазы, эндогенного
оксида азота, снижает концентрацию Oxy-Stat, индуцибельной, эндотелиальной
нос-синтаз и ADMA.
Впервые у доношенных новорожденных с респираторной патологией, находящихся на искусственной вентиляции легких:
проведена эффективная и безопасная коррекция апоптоза лимфоцитов, экспрессирующих AnnexinV-FITC+Pr свыше 10,60% и AnnexinV-FITC+PI+ свыше 0,56%, филграстимом в дозе 10 мкг/кг/сутки в течение 3-х дней;
проведена эффективная и безопасная коррекция апоптоза лимфоцитов, экспрессирующих AnnexinV-FITC+Pr менее 10,60% и AnnexinV-FITC+PI+ менее 0,56%, ингаляционным оксидом азота в дозе 10 ррт с экспозицией 48 часов;
доказано, что коррекция апоптоза лимфоцитов в рамках сопроводительной терапии по жизненным показаниям на фоне стандартной интенсивной терапии снижает частоту развития сепсиса, летальных исходов заболевания и финансовые затраты на терапию;
- разработаны критерии проведения коррекции апоптоза лимфоцитов
филграстимом и ингаляционным оксидом азота;
Впервые разработаны способы ранней диагностики летального исхода:
сепсиса на основании экспрессии CD95 на лимфоцитах (патент № 2246729 от 20.02.2005);
респираторной патологии на основании концентрации FGF (патент № 2311645 от 27.11.2007);
концентрации G-CSF (патент № 2308724 от 20.09.2007);
- экспрессии AnnexinV+PI+ на лимфоцитах (патент № 2318445 от
10.03.2008).
Впервые разработаны способы терапии:
сепсиса на основании относительного содержания лимфоцитов с экспрессией AnnexinV+PI+ на лимфоцитах (патент № 2403912 от 20.11.2010);
респираторной патологии на основании относительного содержания лимфоцитов с экспрессией AnnexinV+PI+, CD3+CD69+ и CD14+ (патент № 2434653 от 27.11.2011).
Теоретическая и практическая значимость исследования
1. Расширены теоретические представления об апоптозе лимфоцитов, как
фундаментальном патогенетическом механизме альтерации лимфоцитарного
звена иммунной системы, определяющем развитие бактериальных осложнений
и неблагоприятного исхода заболевания; о патогенетической значимости
низкой концентрации G-CSF и эндогенного оксида азота; о медикаментозной
коррекции апоптоза лимфоцитов рекомбинантными аналогами G-CSF и
ингаляционным оксидом азота в качестве сопроводительной терапии на фоне
традиционной интенсивной терапии; о компенсаторных возможностях костно
мозгового резерва плюрипотентных стволовых клеток у новорожденных с
респираторной патологией; о проведении медикаментозной коррекции апоптоза
лимфоцитов в наиболее ранние сроки.
Проведенными рандомизированными контролируемыми клиническими испытаниями подтверждена эффективность и безопасность коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом и hNO. Доказана финансовая целесообразность применения указанных методов.
Результаты клинического применения ингаляционного оксида азота у доношенных новорожденных могут использоваться в качестве научного обоснования отмены статуса «off-label» для ингаляционного оксида азота.
2. Практическая значимость работы заключается в снижении частоты
заболевания сепсисом в 6,5 раз; частоты летальных исходов заболевания в 5,5
раз; финансовых затрат на терапию в 1,5 раза при проведении медикаментозной
коррекции апоптоза лимфоцитов в составе традиционной интенсивной терапии
респираторной патологии; в разработке и внедрении в стандартное
обследование ОРИТ критериев ранней диагностики развития нейтропении,
сепсиса, неблагоприятного исхода заболевания.
Методология и методы исследования
Методологической основой исследования стало проведение рандомизированных контролируемых клинических испытаний эффективности, безопасности коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом и hNO с проведением рандомизации методом конвертов, применением критериев стратификации, включения в исследование и исключения из него при соблюдении прав пациентов Хельсинкской декларации 1975 года с поправками от 2005 года.
Для решения поставленных задач на базе детского реанимационного отделения ФГБУ РНИИАП Минздрава РФ было обследовано 200 доношенных новорожденных с респираторной патологией и перинатальным поражением ЦНС, поступивших на ИВ Л из родильных домов г. Ростова-на-Дону и Ростовской области. Проведение контролируемых, рандомизированных клинических испытаний было одобрено локальным комитетом по этическим вопросам и биоэтике ФГБУ РНИИАП Минздрава РФ (протокол 18/1 от 26.11.2008 и №20/1 от 14.01.2009).
Пациенты включались в исследование с письменного разрешения родителей или иных законных представителей, если при поступлении в отделение реанимации: имели респираторную патологию (MAC, ателектазы легких) и перинатальное поражение ЦНС; гестационный возраст>37 недель; вес при рождении не менее 2500 граммов; поступали в отделение реанимации на ИВ Л не позднее 7-х суток жизни; при поступлении не имели клинических признаков бактериального инфицирования.
Пациенты не включались в исследование в случае наличия: подозреваемых или подтвержденных врожденных аномалий дыхательных путей или легких; подтвержденной врожденной диафрагмальной грыжи; подтвержденного сложного врожденного порока сердца (перерыв дуги аорты, коарктация аорты, стеноз аорты, гипоплазия левых отделов сердца, тотальный аномальный дренаж легочных вен); тяжелой дисфункции левого желудочка; пневмоторакса; подозреваемой или подтвержденной хромосомной аномалии или генетической аберрации; генетического нарушения гемопоэза.
При поступлении в отделение все пациенты, вошедшие в исследование (п=200), были разделены на две группы в зависимости от относительного содержания лимфоцитов в стадии раннего (AnnexinV-FITC РГ) и позднего (AnnexinV-FITC PI ) апоптоза по результатам иммунофенотипирования. Основанием для создания дизайна стали результаты собственных исследований, указывающих на развитие нейтропении и бактериальных осложнений при увеличении относительного содержания лимфоцитов с экспрессией AnnexinV-FITC+Pr>10,6% и AnnexinV-FITC+PI+>0,56% (Эстрин В.В., Пухтинская М.Г., Ефанова Е.А., 2007).
Таким образом, I группу (п=103) составили пациенты с относительным содержанием лимфоцитов с экспрессией AnnexinV-FITC+Pr и AnnexinV-FITC+PI+ свыше 10,6% и 0,56% (соответственно). II группу исследования (п=97) составили пациенты, у которых относительное содержание лимфоцитов с экспрессией AnnexinV-FITC+Pr и AnnexinV-FITC+PI+ не превышало 10,6% и 0,56% (соответственно).
Далее пациенты I и II групп методом рандомизации (конверты) были разделены на две подгруппы: А и В. Все пациенты получали стандартную интенсивную терапию. Кроме того, пациентам 1-А подгруппы проводили коррекцию активности апоптоза лимфоцитов филграстимом (Нейпоген, «Ф. Хоффманн-ля Рош Лтд», Швейцария); пациентам подгруппы П-А -ингаляционным (hNO). Пациентам I-B и П-В коррекцию апоптоза не проводили.
Критерии назначения филграстима: четный личный номер, полученный в результате рандомизации; наличие письменного согласия родителей ребенка.
Противопоказания к назначению филграстима: тромбоцитопения менее 50,0x10 /литр; если к ним уже применялась гранулоцитарная трансфузия или проводилось предшествующее лечение цитокинами.
Критерии досрочного прекращения введения филграстима: гиперлейкоцитоз свыше 25,0x10 \л.; любое изменение состояния,
представляющее собой угрозу жизни для пациента или приводящее к продлению госпитализации.
Критерии назначения hNO: четный личный номер, полученный в результате рандомизации; наличие письменного согласия родителей ребенка.
Противопоказания к назначению hNO: метгемоглобинемия (врожденная и
приобретенная); гипокоагуляция, подтвержденная лабораторно;
тромбоцитопения менее 50,0x10 /литр; внутрижелудочковые кровоизлияния III - IV степени (МРТ).
Критерии досрочного прекращения hNO: увеличение уровня метгемоглобина крови свыше 2,5%; любое изменение состояния, представляющее собой угрозу жизни для пациента или приводящее к продлению госпитализации.
Безопасность оценивалась документальным протоколированием всех побочных эффектов, динамикой клинических и лабораторных данных. Легкие случаи неблагоприятных эффектов определялись, как любое изменение существующего состояния пациента, происходящее во время терапии hNO или филграстимом. Серьезное неблагоприятное воздействие, как любой опыт, предполагающий угрозу жизни или приводящий к продлению госпитализации.
В качестве конечных точек оценки клинической эффективности коррекции апоптоза hNO и филграстимом были приняты: частота развития сепсиса, летального исхода, длительность ИВЛ, продолжительность госпитализации. Относительное содержание лимфоцитов в апоптозе являлось дополнительным критерием оценки.
Всем пациентам І (1-А, I-B) и II (П-А, П-В) групп осуществлялось динамическое клинико-лабораторное и иммунологическое обследование при поступлении, на 3-5-е сутки, 20-е сутки или в исходе заболевания.
У пациентов определяли: количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и дифференцированный подсчет лейкоцитов (лимфоциты, гранулоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы), гематокрит цельной периферической крови на автоматическом гематологическом анализаторе "CelltacF" MEK-8222J/K, (Япония) ежедневно и по показаниям; показатели кислотно-щелочного состояния капиллярной крови на аппарате КЩС «ABL800» (Дания) ежедневно три раза в сутки и по показаниям; общий белок, глюкоза, мочевина, билирубин, креатинин крови на биохимическом программируемом полуавтомате «HUMALYZER 2000, HUMAN» (Германия) ежедневно; общий анализ мочи на автоматическом анализаторе мочи UroMeter 120 (Корея) ежедневно; клиренс эндогенного креатинина для оценки уровня клубочковой фильтрации по стандартной методике Реберга-Тареева через день; параметры центральной гемодинамики (пульс, систолическое, диастолическое и среднее артериальное давление, сатурация) осциллометрическим методом на мониторах «Neonatal» (США), «SW» (Дания), «МРиА» (Россия), «Nihon Kohden» (Япония) в режиме реального времени, непрерывно; протромбиновое, тромбиновое время, уровень фибриногена, активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновый индекс, международное
нормализованное отношение, растворимые фибрин-мономерные комплексы на анализаторе «ACL-9000» (Дания) через день и по показаниям;
многопробное комплексное бактериологическое обследование посевов крови, ликвора (при необходимости), мочи, мазков из пупочной ранки, глаз, носа, зева и кала с идентификацией выявленных микроорганизмов и определением антибиотикочувствительности; видовую идентификацию проводили с помощью компьютерной программы и идентификационных наборов фирмы «Becton Dickinson», а также мини-тестов фирм: «Мерье» (Франция), «Orion Diagnostica» (Финляндия), «Sanofi diagnostics Pasteur» (Франция);
амплификацию специфических фрагментов ДНК возбудителей Chlamydia trachomatis, Ur. Urealiticum, Міс. Hominis, Міс. Genitalium., Neisseria gonorrhoae, Trichomonas vaginalis, Herpes Simplex 1 и 2, Cytomegalovirus, Ebstein-Barr Virus методом полимеразной цепной реакции из образцов мочи, крови и ликвора (при необходимости) при поступлении и в динамике;
концентрацию цитокинов в сыворотке крови (IL-1B, IL-6, IL-8, TNF-a, G-CSF, sFas, FGF) и NO определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА=ЕЫ8А) с пероксидазой хрена (в качестве индикаторного фермента) по прилагаемым инструкциям с использованием тест-систем фирм Biosource (США), Bender Medsistems (Австрия), R&D Systems (США) на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с компьютером и программным обеспечением Multilabel Counter Victor-21420 (Финляндия); результаты (пг/мл и мкмоль/л для N0) оценивали построением калибровочной кривой зависимости оптической плотности (ОП) от концентрации исследуемого цитокина.
Для профилактики выброса цитокинов лейкоцитами крови «ex vivo» использовали методику (Griffith D.E., Miller Е., Gray L.D., 1994; Redl Н., Bahrami S., Leichtfried G., Schlag G., 1992). Оптическую плотность определяли на многофункциональном фотометре "Viktor" (Финляндия) при длине волны 450 нм. Анализ результатов проводился автоматически с помощью программы «Viktor- Wallak».
Для оценки клеточного звена иммунитета определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов CD3+CD19", CD3+CD4+, CD3+CD8+, уровень экспрессии маркеров активации лимфоцитов (CD3 CD69 , CD3 CD71 , CD3+HLA-DR+, CD3+CD95+), а также CD3"CD19+, CD14+, CD3"CD56+ методом одно- и двухпараметрического иммунофенотипирования, используя комбинации моноклональных антител к дифференцировочным и активационным маркерам фирмы IQ Products (Нидерланды), Caltag (США), Immunotex (Франция), HyCultbiotechnology (Нидерланды): FITC (изотиоцианат флуоресцеина) и РЕ (фикоэритрин)-меченые.
Содержание лимфоцитов, вступивших в апоптоз, выявляли с использованием диагностического набора, включающего Аннексин-V , меченый FITC и пропидиума йодид (PI ), меченый РЕ (Caltag, США). Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили с использованием
лизирующего раствора «OptiLyse С» фирмы Immunotex (Франция) по прилагаемому протоколу. Результаты учитывали на проточном цитометре «Beckman Coulter Epics XL-II» (США) по стандартным протоколам.
Кроме того, у пациентов II группы (П-А и П-В) при поступлении, на 3-5-е сутки, 20-е сутки или в исходе заболевания методом ИФА определяли: суммарное количество перекисей в сыворотке крови «Oxystat»-TecTOM, «BIOMEDICA GRUPPE» (США); содержание в сыворотке крови индуцибельной (NOS-2) и эндотелиальной (NOS-3) NO-синтазы, «ВСМ Diagnostic» (США); содержание в сыворотке крови ADMA (ассиметричного диметиларгинина, эндогенного ингибитора NO-синтазы), «BSM diagnostic» (Германия); содержание в сыворотке крови глутатионпероксидазы, «AbFRONTIER» (Корея); содержание Cu/Zn-зависимой СОД в сыворотке крови, «Bender MedSystems» (Австрия).
Статистический анализ полученных цифровых результатов был проведен методами вариационной статистики с использованием выборочного среднего, стандартного отклонения, средней квадратичной ошибки, доверительных интервалов, медианы и ошибки медианы. Достоверность различия отдельных выборок определялась непараметрическими критериями Вилкоксона и Манна-Уитни. Абсолютный и относительный риск развития сепсиса и летального исхода заболевания оценивался методом построения четырехпольных таблиц. Графики Каплана-Майера были построены по длительности ИВЛ и продолжительности госпитализации; достоверность результатов оценивалась критерием Гехана-Вилкоксона. Достоверность гипотез была подтверждена точным тестом Фишера-Ирвина при 5% уровне значимости в отношении двухсторонней альтернативы. Для оценки возможности прогнозирования развития нейтропении, сепсиса, летального исхода заболевания с использованием иммунологических критериев в среде Excel и «R» была реализована процедура оценки чувствительности, специфичности и точности диагностики с применением метода «деревьев решений». Для выделения точек «Cut-Off» применяли метод ROC-Lines. В исследовании использовались пакеты прикладных программ: Excel-2000, Statistica-6, «R».
Положения, выносимые на защиту
1. Высокая активность апоптоза лимфоцитов представляет собой основу
тяжелой иммунологической дисфункции с развитием нейтропении,
бактериальных осложнений и летального исхода заболевания у новорожденных
пациентов ОРИТ с респираторной патологией и необходимостью аппаратного
протезирования дыхания.
2. Новорожденные с респираторной патологией, необходимостью
аппаратного протезирования дыхания и высокой активностью апоптоза
лимфоцитов представляют собой контингент пациентов, наиболее уязвимых по
развитию бактериальных осложнений и неблагоприятного исхода заболевания;
нуждаются в длительной респираторной поддержке и продолжительной
госпитализацией в ОРИТ.
-
Нарастание активности апоптоза лимфоцитов в динамике заболевания сопровождается снижением концентрации G-CSF и эндогенного оксида азота, что является патогенетическим подтверждением возможности создания новой терапевтической стратегии, основанной на коррекции апоптоза лимфоцитов рекомбинантными аналогами чр-ГКСФ и ингаляционным оксидом азота.
-
У новорожденных с респираторной патологией, находящихся на ИВ Л, коррекция апоптоза лимфоцитов филграстимом повышает эффективность традиционной интенсивной терапии, снижая частоту развития сепсиса, летальных исходов, длительности ИВЛ и госпитализации в ОРИТ, финансовые затраты.
5. Коррекция апоптоза лимфоцитов ингаляционным оксидом азота
позволяет повысить эффективность традиционной интенсивной терапии у
новорожденных с респираторной патологией, находящихся на ИВЛ, снижая
частоту развития сепсиса, длительность проведения ИВЛ, продолжительность
госпитализации, финансовые затраты на терапию; обеспечивает тенденцию
снижения частоты летального исхода заболевания.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Основные положения работы представлены на: Российском конгрессе «Педиатрическая анестезиология и интенсивная терапия», Москва, 2007; I Всероссийском конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии», Москва, 2008; Российском конгрессе «Педиатрическая анестезиология и интенсивная терапия», Москва, 2009; XVI съезде педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 2009; IV ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество», Москва, 2009; V Российском конгрессе «Педиатрическая анестезиология и Интенсивная терапия», Москва, 2009; VII съезде аллергологов и иммунологов, Санкт-Петербург, 2009; Всероссийском форуме «Мать и дитя», Москва, 2007, 2009, 2010; IV региональном научном форуме «Мать и дитя», Екатеринбург, 2010; V ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины: «Современная перинатология, организация, технологии и качество», Москва, 2010; XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунопрофилактики», Москва, 2011; XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии», Москва, 2011; XII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя», Москва, 2011; X Российском конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва 2011; конгрессе «Сепсис 2011», Китай, 2011; XVI Международном конгрессе по реабилитации в медицине и респираторной аллергии, Париж, 2011; конгрессе «Сепсис 2012», Париж, 2012; Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология - практическому здравоохранению», Москва, 2012; Российском конгрессе «Педиатрическая анестезиология и интенсивная терапия», Москва, 2013; «33 International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine»,
Брюссель, 2013; «34 International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine», Брюссель, 2014; I Конгрессе анестезиологов и реаниматологов Юга России, Ростов-на-Дону, 2014; XXIV Европейском конгрессе по перинатальной медицине, Флоренция, 2014; VII Всероссийской научной конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты», Ростов-на-Дону, 2015 г.
Коррекция апоптоза лимфоцитов hNO внедрена в клиническую практику ОРИТ ФГБУ РНИИАП Минздрава России; коррекция апоптоза лимфоцитов филграстимом - в клиническую практику ОРИТ и ОПН ФГБУ РНИИАП Минздрава России.
Лабораторные методы ранней диагностики развития нейтропении, сепсиса и неблагоприятного исхода заболевания внедрены в работу клинико-диагностической лаборатории ФГБУ РНИИАП Минздрава России и областной клинической больницы №2 г. Ростова-на-Дону.
Теоретические основы активации апоптоза лимфоцитов, клинико-диагностической значимости этого процесса и медикаментозной коррекции введены в лекционный курс студентов медуниверситета, ординаторов и врачей ЮФО в рамках постдипломного образования на базе «Симуляционного центра» ФГБУ РНИИАП Минздрава России.
Результаты диссертации представлены в 69 опубликованных статьях, из них 29 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ; 1 монография; 39 - в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов; получено 9 патентов Российской Федерации, разработаны 4 медицинские технологии. Объем диссертации составляет 308 страниц компьютерного набора текста (Microsoft Word, 2010), включая 30 рисунков и 73 таблицы.
Текст диссертации состоит из разделов: «Введение» (актуальность темы исследования, степень разработанности, цели и задачи, научная новизна, теоретическая и практическая значимость, методология и методы исследования, положения, выносимые на защиту, степень достоверности, апробация результатов); основной текст диссертации состоит из 5 глав (обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение; заключение с выводами и практическими рекомендациями, список используемой литературы). Указатель литературы содержит 567 работ: 300 отечественных и 267 иностранных источников.
Апоптоз иммунокомпетентных клеток, его значимость в развитии критических состояний и бактериальных осложнений
В текущем десятилетии отечественными реаниматологами и неонатологами были достигнуты впечатляющие успехи в интенсивной терапии критических состояний новорожденных [9, 17, 22, 165, 54, 19, 272]. Однако, далеко не все проблемы решены. Прежде всего, речь идет о терапии дыхательных расстройств новорожденных с необходимостью протезирования дыхания, как об одном из сложнейших вопросов современной неонатологии [52, 55, 185, 186, 165, 18, 4].
Известно, что первый вдох и начало самостоятельного дыхания у новорожденного ребенка являются важным моментом (Володин Н.Н., 2014). Симптомокомплекс дыхательной недостаточности, развивающейся при рождении, в нашей стране врачи часто называют «респираторный дистресс» [56, 57, 58].
Респираторный дистресс-синдром (РДС) (англ. distress тяжелое недомогание, страдание; лат. respiratio дыхание; синдром - совокупность типовых симптомов) - неинфекционный патологический процесс, формирующийся в пренатальном и раннем неонатальном периоде развития ребенка и проявляющийся нарушением дыхания, обусловленным дефицитом сурфактанта [16, 112, 113, 78, 51, 52, 62, 180, 179, 177].
РДС - полиэтиологическое заболевание. По статистике он развивается: у недоношенных детей в 77,3+5,4% случаев; на фоне родовой травмы в 26,1+5,4%; при асфиксии у 23,9+6,7%; при аспирационном синдроме у 23,0+5,7%; при сепсисе в 19,3+5,4% и при гемолитической болезни в 17,7+11,8% случаев [51, 10, 18, 177]. Чем меньше гестационный возраст и недостаточность системы дыхания, кровообращения, ЦНС, тем чаще развивается РДС. Необходимо упомянуть, что В.А. Неговский относит РДС к проявлениям постреанимационной болезни, так как в патогенезе заболевания определенную роль играет ятрогения: гипероксия, использование недостаточно подогретого или увлажненного кислорода, перегрузка объемом при инфузионной терапии, неудовлетворительный инфекционный контроль, полипрагмазия, длительное нерациональное парентеральное питание [171].
Респираторная патология новорожденных неизменно привлекает внимание ученых и клиницистов всего мира [169, 275, 162, 196, 292, 105, 178, 323, 361].
Термин "РДС" понимается разными специалистами различно. В своих работах К.А. Сотникова указывала, что термин "синдром дыхательных расстройств" является условным [240]. По ее определению, "под синдромом дыхательных расстройств подразумевают особое клиническое состояние новорожденного, которое характеризуется ранним возникновением (первые и вторые сутки) и стремительным нарастанием симптомов дыхательной недостаточности на фоне значительного угнетения жизненно важных функций организма" [240].
В контексте понятия «РДС» можно встретить термин "пневмопатия", который иногда еще используется в научной литературе и практической медицине до настоящего времени [187, 188]. Однако этот термин отсутствует в Международной классификации болезней 10 пересмотра. Морфологическим проявлением пневмопатии считают гиалиновые мембраны, аспирацию мекониальных околоплодных вод, диссеминированные ателектазы и массивные кровоизлияния в ткань легких.
Зарубежные исследователи говорят о существовании двух видов РДС: I -болезнь гиалиновых мембран (в структуре неонатальной смертности среди недоношенных пациентов в США - 50-70%); II тип - аспирационный синдром, диссеминированные ателектазы и кровоизлияния в ткань легкого [426]. При первом варианте развития РДС в основе лежит дефицит и незрелость сурфактанта, при втором - легочная гипертензия и вторичное нарушение синтеза сурфактанта [513, 306, 511]. Патофизиологически происходит спадение альвеол, снижение легочного комплайнса, увеличение работы дыхания, усиление легочной гипертензии и нарастание гипоксии; которая, в свою очередь, усиливает легочную гипертензию, в результате чего снижается синтез сурфактанта - возникает порочный круг [177]. Тяжесть течения РДС в раннем неонатальном периоде также обусловлена гемодинамическими нарушениями; поэтому в научной литературе можно встретить термин "кардиореспираторный дистресс-синдром" [75].
Согласно МКБ-10, (Класс XVI "Отдельные состояния перинатального периода", код Р22.0) термин "синдром дыхательных расстройств" (СДР) в настоящее время рассматривается, как синоним термина "болезнь гиалиновых мембран" (БГМ). Деление СДР на 2 типа имеет лишь историческое значение и в настоящее время в неонатологии не используется. Согласно МКБ-10, 2-й тип СДР обозначается термином "транзиторное тахипное новорождённых" (код Р22.1). В первые часы жизни может быть использован термин "дыхательное расстройство неуточненное" (код Р22.9). Но в клинической практике его допустимо применять только в качестве предварительного диагноза.
В настоящее время доказано, что при респираторной патологии медиаторы воспаления, синтезируемые альвеолярными макрофагами, проникают из легочной ткани в системный кровоток, провоцируя развитие синдрома системной воспалительной реакции [76, 54, 216]. ИВ Л неизбежно приводит к перерастяжению и многократно повторяющемуся открытию-закрытию спавшихся альвеол; дальнейшей активации альвеолярных макрофагов, вырабатывающих основные цитокины: фактор некроза опухоли (TNF-a), интерлейкин-13 (IL-1J3), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-10 (IL-10) и другие [260, 257, 510, 338, 367].
Предположение о том, что повышенная концентрация провоспалительных цитокинов в плазме больных с респираторной патологией на ИВЛ, является следствием их проникновения в системный кровоток из легких, привело к появлению термина: "вентилятор-ассоциированного системного воспаления" (ventilator-associated systemic inflammation - VASI) [326, 338]. Кроме того, гуморальное звено патогенеза респираторной патологии включает активацию системы комплемента, коагуляции, увеличение концентрации кининов, активных радикалов кислорода, нейропептидов, вазоактивных пептидов, простагландинов, оксида азота, тромбоцитарных факторов. Клеточное звено воспалительного процесса при развитии респираторной патологии состоит из процессов адгезии, хемотаксиса, активации нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов, активации апоптоза ИКК [360].
Перечисленные выше патологические процессы наглядно объясняют сложность терапии респираторной патологии и высокую летальность: от 35% до 75% [59, 19,361].
Среди доношенных пациентов ОРИТ с аппаратной респираторной поддержкой мекониально-аспирационный синдром (МАС) все еще является частой причиной развития тяжелой респираторной недостаточности [218, 79, 15, 160, 140, 217, 522, 471]. Меконий представляет собой зелено-черную, вязкую субстанцию в толстом кишечнике. Он состоит из эпителиальных клеток, слизи, амниотической жидкости, желчи, ферментов и воды [69].
В 2005 году была разработана бальная шкала оценки мекониальных околоплодных вод в зависимости от цвета и консистенции [218]. MAC происходит чаще во время родов или в конце третьего триместра беременности.
Возможность реализации MAC во время беременности подтверждена патоморфологическими исследованиями [29, 21, 35, 177, 556]. Частота отхождения мекония происходит от 4,5 до 20% [189, 271]. Средняя частота MAC, по данным разных авторов, колеблется от 2 до 3%, а роды с мекониальными околоплодными водами - у 9-15% рожениц [234, 235, 41].
Клиническая характеристика пациентов
В основной группе исследования у 118-и женщин предыдущая беременность закончилась родами, у 39-и - медабортом и у 22-х женщин предыдущая беременность перестала развиваться. Таким образом, патологическое течение предыдущей беременности негативно влияло на течение последующей, что подтверждено рядом исследований [160, 5, 109].
При анализе экстрагенитальной соматической патологии (по данным материнского анамнеза) было выявлено, что в I группе пациентов соматической патологии не выявлено у 52 (51,5%). У 51-й (49,5%) женщины спектр соматической патологии был представлен следующим образом: 24 страдали гипертонической болезнью, у 10 отмечалось ожирение П-Ш степени, хронический гастрит - у 6-й женщин, хронический пиелонефрит в стадии ремиссии - у 11-и, бронхиальная астма - у 3-х женщин, нейроциркуляторная дистония по гипотоническому типу - у 15-и; на фоне ОРВИ беременность протекала у 5-й беременных. Таким образом, сочетанной соматической патологией страдали 23 женщины.
Во II группе соматически здоровыми были 47 женщин (48,5%). У 50-и настоящая беременность развивалась на фоне ожирения П-Ш степени (19), на фоне нейроциркуляторной дистонии по гипотоническому типу - у 23-х женщины, хронического пиелонефрита в стадии ремиссии - у 11-й женщин, миопии высокой степени - у 9 женщин; на фоне ОРВИ - у 4 человек. Таким образом, на фоне сочетанной соматической патологии беременность протекала у 16 женщин.
Наличие соматической патологии, сочетанной, в том числе, более чем у половины женщин в нашем исследовании совпадало с научными выводами о существовании тенденции снижения качества здоровья беременных с неизбежным увеличением числа осложненного течения беременности и родов [216].
Проведенный анализ наличия гинекологических инфекционных заболеваний во время беременности выявил ее наличие у 75% женщин (76 женщин в I группе и 74 - во II; р 0,05). В 48% случаев диагностировали бактериальный вагиноз, связанный с дисбиозом влагалищного биотопа и усилением роста облигатно-анаэробных условно-патогенных микроорганизмов, что подтверждало выводы исследований последних лет об увеличении числа сочетанных форм бактериального вагиноза у женщин фертильного возраста [11, 216].
У 45% матерей пациентов I и II группы исследования перед родами был диагностирован вульвовагинит с преимущественным определением в составе нормальной микрофлоры влагалища грибов рода Candida. Диагноз хронического сальпингита присутствовал у 12,4% женщин (4 в I группе и 4 - во II; р 0,05).
На долю хронического аднексита приходилось 4,6% генитальной патологии (8 женщин в I группе и 6 - во II; р 0,05). В 26% (52 женщины: 25 в I группе и 27 - во II; р 0,05) случаев у матерей пациентов обеих групп исследования были диагностированы инфекции, передающиеся половым путем: уреаплазмоз, микоплазмоз, хламидиоз и другие.
Необходимо отметить, что у женщин обеих клинических групп в 8% случаев имело место сочетание нескольких инфекционных возбудителей, например, хламидийной, урео-микоплазмозной инфекции, трихомониаза, гарднерелеза. Наиболее часто диагностировали уреамикоплазменную инфекцию (более 25% в I и II группе). Широкое распространение микоплазм среди здоровых женщин фертильного возраста позволило большинству исследователей считать эти микроорганизмы комменсалами, входящими в состав нормального вагинального микробиоценоза и способных вызывать заболевание лишь при определенных условиях; однако у женщин с привычным невынашиванием беременности генитальные микоплазмы обнаруживаются в 51% случаев [206, 205, 216]. Хламидийная урогенитальная инфекция (нижних и верхних половых путей) была обнаружена у 9% матерей пациентов I и II клинической группы исследования. Кроме того, у 28 % женщин обеих групп (56 человек) беременность протекала с высоким уровнем иммуноглобулина G в крови к вирусу простого герпеса (ВПГ) I, II, VI типов и Эпштейн-Барра; и у 25 женщин (12,5%) -цитомегаловируса; при этом иммуноглобулины М не были обнаружены.
Известно, что доля серопозитивных беременных женщин ВПГ может достигать 40%, так как герпетическая инфекция - одна из наиболее распространенных в человеческой популяции [80, 11]. У 11 женщин 1-й клинической группы и у 9 П-й (р 0,05) беременность протекала на фоне повышенного уровня иммуноглобулина G крови к токсоплазме при отсутствии иммуноглобулинов класса М. Патология течения беременности в группах I и II представлена в таблице (таблица 8).
Необходимо подчеркнуть, что благоприятно в этих группах беременность протекала лишь у 15-и (7,5%) женщин. Беременность, осложненная несколькими факторами, в I и II группах отмечалась в 56% случаев (у 112 женщин). Данные таблицы подтверждали, что чаще всего гестоз, ФПН, внутриутробная гипоксия плода, преэклампсия отягощали течение беременности у матерей пациентов обеих групп. Представленная структура акушерской материнской патологии подтверждает негативное влияние неблагоприятного течения беременности на состояние здоровья новорожденного ребенка и его адаптационные возможности [140].
В нашем исследовании патологическое течение родов с необходимостью проведения операции кесарева сечения в I и II клинической группе происходило более чем в 45% случаев (таблица 9).
Высокий процент оперативного родоразрешения (в нашей стране 27,9%), с нашей точки зрения, можно объяснить попыткой оптимизации исхода осложненной беременности и родов, а также наличием показаний в интересах плода [217].
Клинико-диагностическое значение активности апоптоза лимфоцитов в зависимости от исходов заболевания у новорожденных с респираторной патологией, получавших стандартную интенсивную терапию
В лейкоцитарной формуле общего анализа крови у пациентов с высокой активностью апоптоза при поступлении в ОРИТ нами было отмечено статистически значимое снижение относительного содержания нейтрофилов (NEU) и моноцитов (MON) при значимом увеличении относительного содержания лимфоцитов (LY%) по сравнению с пациентами П-й клинической группы. При этом у этих детей наблюдалось значимое снижение количества лейкоцитов (WBC), абсолютного числа нейтрофилов (ANN) и количества лимфоцитов (LYxlO /L) по сравнению с пациентами П-й группы.
Статистически значимое снижение количества лейкоцитов, абсолютного числа нейтрофилов в 1-й клинической группе не позволяло говорить о наличии нейтропении, как таковой, при поступлении в ОРИТ, однако, столь явное снижение свидетельствовало о высоком риске развития нейтропении в динамике заболевания.
Из общего числа пациентов, находящихся в ОРИТ на ИВЛ, особого внимания клиницистов заслуживают дети с нейтропенией. Снижение абсолютного числа нейтрофилов (ANN) является лабораторным признаком присоединения бактериальных осложнений с высокой вероятностью неблагоприятного исхода заболевания, в том числе, у потенциально излечимых пациентов. B.L. Манро с соавторами рассматривали нейтропению, как единственный, наиболее точный прогностический маркер развития гнойно-септических осложнений и нозокомиальных инфекций у новорожденных [470]. Помимо выраженного угнетения противоинфекционной резистентности, опасность развития нейтропении заключается в том, что терапевтические возможности клиницистов в данной ситуации достаточно ограничены: чаще всего, инфекционные осложнения вызваны антибиотикорезистентной нозокомиальной флорой, а назначение препаратов иммуноглобулинового ряда требует значительных финансовых затрат и не всегда приносит желаемый результат [313, 496].
Известно, что нейтропения развивается у новорожденных, чьи матери во время беременности страдали артериальной гипертензией, преэклампсией; ее развитие ассоциируется с тяжелой асфиксией и родовой черепно-мозговой травмой [69, 359, 374, 375].
Считают, что под нейтропенией следует понимать снижение абсолютного числа нейтрофилов (ANN) менее 1800/mm [496]. Признаком развития системной воспалительной реакции у новорожденных является также снижение общего количества лейкоцитов менее 5,0x10 /л [59].
Существует несколько предположений о патогенезе развития нейтропении. Новорожденные с осложненным течением беременности и родов могут иметь ограниченный резерв нейтрофильного пула в красном костном мозге, который быстро истощается в первые дни жизни ребенка [496, 347].
Нейтропения может развиваться вследствие недостаточной продукции нейтрофильного пула или повышенного потребления сегментоядерных лейкоцитов крови [462]. Высокий спонтанный и индуцированный апоптоз также считают одной из причин развития нейтропении у новорожденных [374, 392, 365, 403]. Однако патогенетические механизмы развития нейтропении, в том числе, у новорожденных с респираторной патологией, не выяснены и необходимо дальнейшее изучение закономерностей развития нейтрофильной недостаточности.
Помимо формирующейся нейтрофильной недостаточости в нашем исследовании активация апоптоза лимфоцитов у пациентов 1-й группы ассоциировалась с увеличением относительного содержания лимфоцитов при значимом снижении их абсолютного количества со смещением к нижнему референтному пределу возрастной нормы. Таким образом, высокая активность апоптоза лимфоцитов являлась вероятным иммунологическим предиктором развития лейкопении с угнетением гранулоцитарно-макрофагального и лимфоцитарного звеньев иммунной системы, следовательно, наиболее ранним неблагоприятным маркером снижения противоинфекционной резистентности у новорожденных с респираторной патологией, находящихся на ИВЛ.
У пациентов П-й клинической группы (с меньшей коммитированностью лимфоцитов к апоптозу) количество лейкоцитов, ANN, тносительное содержание лимфоцитов и моноцитов стремилось к верхней границе возрастной нормы. В ходе дальнейшего исследования мы попытались выяснить патогенетические механизмы активации апоптоза лимфоцитов, как предполагаемого механизма негативной активации клеток иммунной системы.
Изменение показателей клинико-биохимического мониторинга при проведении коррекции апоптоза лимфоцитов филграстимом
В настоящее время развитие неонатального сепсиса у новорожденных остается одной из основных причин летальности раннего неонатального периода [66, 366]. В значительной мере это обусловлено трудностями ранней диагностики, профилактики и лечения [221, 318].
Известные лабораторные критерии диагностики сепсиса можно условно разделить на две группы: основные и дополнительные [119, 201, 259]. К основной группе относятся максимально просто определяемые признаки, а именно: абсолютное число нейтрофилов, количество палочкоядерных форм, индекс соотношения незрелых форм нейтрофилов к их общему количеству, количество тромбоцитов, эритроцитов. Как и большинство других лабораторных тестов, используемых для диагностики неонатального сепсиса, эти показатели в большей степени позволяют исключить инфекционный процесс у новорожденных, но не выявить детей с наличием инфекции [66, 431].
К дополнительным критериям относятся показатели иммунной дисфункции организма в условиях развития септической инфекции [66, 436, 394, 435, 423]. Определение дополнительных критериев подразумевает применение более чувствительных лабораторных методов анализа и может выполняться в условиях специализированной лаборатории. Сложность лабораторного обеспечения, несомненно, существенно ограничивает широкое практическое использование дополнительных критериев. И, тем не менее, их практическую значимость в превентивной диагностике сепсиса сложно переоценить.
В нашем исследовании из 108 новорожденных с респираторной патологией, находящихся на ИВ Л и получивших лишь стандартную интенсивную терапию, развитие неонатального сепсиса было подтверждено у 39 человек.
У 9-ти пациентов заболевание закончилось летальным исходом. В ходе дальнейшего исследования мы провели сравнительный анализ динамики суб- и популяционного состава лимфоцитов и лимфоцитов, находящихся в апоптозе, у пациентов с развитием сепсиса (сепсис +; п=39) относительно детей без развития сепсиса (сепсис -; п=69) (таблица 38).
Данные таблицы демонстрировали, что уже при поступлении в отделение статистически значимые различия дисбаланса субпопуляционного и популяционного состава лимфоцитов у пациентов с последующим развитием неонатального сепсиса характеризовались снижением доли цитотоксических Т-лимфоцитов и CD3 HLA-DR -лимфоцитов; увеличением доли лимфоцитов с экспрессией раннего активационного маркера (CD3 CD69 ) и лимфоцитов, находящихся в ранней (AnnexinV-FITC+Pr) и поздней (AnnexinV-FITC+PI+) стадии апоптоза.
В процессе динамического наблюдения у всех пациентов отмечалось статистически значимое снижение к 3-5 суткам относительного содержания как общего пула Т-лимфоцитов, так и Т-хелперов, цитотоксических лимфоцитов, естественных киллеров, макрофагов/миеломоноцитов, стволовых клеток и В-лимфоцитов.
Состав лимфоцитов у пациентов с последующим развитием неонатального сепсиса характеризовался снижением цитотоксических Т-лимфоцитов и CD3 HLA-DR -лимфоцитов; увеличением доли лимфоцитов с экспрессией раннего активационного маркера (CD3 CD69 ) и лимфоцитов, находящихся в ранней (AnnexinV-FITC+Pr) и поздней (AnnexinV-FITC+PI+) стадии апоптоза.
В процессе динамического наблюдения у всех пациентов отмечалось статистически значимое снижение к 3-5 суткам относительного содержания, как общего пула Т-лимфоцитов, так и Т-хелперов, цитотоксических лимфоцитов, естественных киллеров, макрофагов/миеломоноцитов, стволовых клеток и В-лимфоцитов. (CD3 CD69 ) и с экспрессией рецептора к трансферрину, а также лимфоцитов, коммитированных к апоптозу и находящихся в апоптозе. Выраженность происходящих процессов к 3-5 суткам у новорожденных с развитием неонатального сепсиса была статистически значимо выше по большинству из представленных параметров.
К исходу заболевания у пациентов с развитием септических осложнений статистически значимо низким оставалось общее содержание Т-лимфоцитов и миеломоноцитов/макрофагов при статистически значимо высоком содержании CD3 CD69 и лимфоцитов, находящихся в стадии раннего и позднего апоптоза.
Выраженность диагностированных иммунных расстройств у этих пациентов позволяла предположить, что наиболее патогенетически обоснованным лабораторным тестом, позволяющим осуществить раннюю диагностику дисфункции иммунной системы при развитии сепсиса, являлась оценка интенсивности процесса апоптоза лимфоцитов.
Для характеристики дисбаланса в системе иммунореактивности изучалась динамика концентраций циркулирующих цитокинов и оксида азота у пациентов с развитием неонатального сепсиса относительно детей с неосложненным течением заболевания (таблица 39).
Проведенный анализ показал, что у пациентов с развитием неонатального сепсиса по сравнению с детьми, у которых основное заболевание протекало без осложнений, при поступлении в ОРИТ выявляли статистически значимо низкую концетрацию G-CSF, антиапоптогенного sFas и оксида азота. К 3-5 суткам у этих детей регистрировали статистически значимо высокую концентрацию «классических провоспалительных» цитокинов (TNF-a, IL-6, IL-8, IL-1B) при статистически значимо низкой концентрации FGF, G-CSF и оксида азота.