Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 15
1.1. Вирусные менингиты у детей 15
1.2. Острофазовые белки и острофазовая реакция при инфекционных заболеваниях
1.2.1. Характеристика некоторых белков острой фазы 22
1.2.2. Клиническое значение белков острой фазы при инфекционных заболеваниях 29
1.3. Клиническое значение роли цитокинового звена при вирусных инфекциях у детей 33
1.3.1 Роль цитокиновой регуляции в патогенезе вирусных менингитов 37
1.4. Иммунокоррегируящая терапия вирусных менингитов у детей 41
ГЛАВА II. Материал и методы исследования 45
ГЛАВА III. Собственные исследования. Характеристика обследованных больных 52
ГЛАВА IV. Этиологическая структура нейроинфекций у детей в Астраханской области 58
4.1 Клинико–эпидемиологическая характеристика энтеровирусных менингитов 59
4.2 Клинико–эпидемиологическая характеристика арбовирусных менингитов 66
4.2.1. Лихорадка Западного Нила с поражением центральной нервной системы 66
4.2.2. Арбовирусный менингит, вызванный штаммом «Астрахань-12» 74
4.2.3. Арбовирусный менингит, вызванный штаммом«913=64» 78
4.3. Поражение центральной нервной системы при паротитной инфекции 87
4.4. Герпесвирусные менингоэнцефалиты у детей
4.4.1. Герпетические менингоэнцефалиты 94
4.4.2. Цитомегаловирусный менингоэнцефалит 101
4.4.3. Энцефалиты при ветряной оспе 107
4.5. Поражение центральной нервной системы при острых респира торных вирусных инфекциях 112
4.6. Исходы вирусных менингитов у детей 119
ГЛАВА V. Клиническое значение белков острой фазы при вирусных менингитах у детей 127
5.1. Клинико-диагностическое значение показателей белков острой
фазы, сыворотки крови, в зависимости от этиологии и клиники вирусных менингитов 127
5.2. Диагностическое и прогностическое значение лактоферрина, ферритина, трансферрина и фибриногена при вирусных менингитах 141
ГЛАВА VI. Клиническое значение фибронектина плазмы крови при вирусных менингитах у детей 146
ГЛАВА VII. Клиническое значение катионных белков и миелопероксидазы нейтро филов при вирусных менингитах у детей 153
ГЛАВА VIII . Клинико-диагностическое значение цитокиновой регуляции при вирус ных менингитах у детей 178
ГЛАВА IX. Особенности цитокиновой регуляции у больных вирусными менингита ми детей в зависимости от этиологического фактора 190
9.1. Особенности цитокиновой регуляции при энтеровирусных менингитах 190
9.2. Особенности цитокиновой регуляции при арбовирусных менингитах 193
9.3 Особенности цитокиновой регуляции при герпесвирусных менингоэнцефалитах 196
ГЛАВА Х. Клинико-лабораторная эффективность иммуноглобулинов для внутри венного введения при вирусных менингитах у детей 201
Заключение 217
Выводы 249
Практические рекомендации 251
Литература
- Острофазовые белки и острофазовая реакция при инфекционных заболеваниях
- Клинико–эпидемиологическая характеристика арбовирусных менингитов
- Диагностическое и прогностическое значение лактоферрина, ферритина, трансферрина и фибриногена при вирусных менингитах
- Особенности цитокиновой регуляции при арбовирусных менингитах
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Вирусные менингиты (ВМ) у детей составляют более 60% от общего числа нейроинфекций. Тяжелые формы ВМ сопровождаются развитием неотложных состояний, угрожающих жизни больного. Исходы ВМ (гидроцефалия, эпилепсия, очаговая симптоматика) могут определять последующее развитие ребенка и его социальную адаптацию [С. А. Бузунова, 2007; Л. А. Гульман, 2009; А. В. Чура-кова, 2010; Л.В. Крамарь, 2013; Е. А. Мурина, 2013; C. Archimbaut, 2009].
В последние годы в развитии нейроинфекций активно изучается роль острофазовых белков и цитокинового статуса крови, которые могут использоваться для оценки тяжести, эффективности лечения, прогноза заболевания, развития осложнений и т. д. [Ф. И. Ешмолов,2004; С. А. Бузунова, 2007; Н. В. Скрипченко, 2009; А. А. Вильниц, 2010]. Увеличение концентрации белков острой фазы (БОФ) крови, по сравнению с нормой, представляет собой маркер острого воспаления при многих вирусных и бактериальных инфекциях [О. В. Назарочкина, 2005, 2006; M. Paradovwski, 1999; M. Zanetti, 2004].
Железосодержащие белки, в т.ч. ферритин (ФР), лактофер-рин (ЛФ), трансферрин (ТФ), оказывают бактерицидное и бактерио-статическое действие, влияют на фагоцитоз и обеспечивающие его завершенный характер микробицидные системы лейкоцитов: кати-онные белки (КБ) и миелопероксидазу (МП) [З. А. Хохлова, 2009; Г. А. Харченко, 2010]. Многообразие функций лейкоцитов отражено в работах [И. С. Фрейдлин, 2001; Н. А. Алексеев, 2002; О.В. Белова, 2003; R. M. Rakita, 1999; C.Briggs, 2001], а цитохимические методы исследования нейтрофилов используются в настоящее время в различных ской практики [В. Ю. Делян, 2000; И. Л. Волкова, 2003; Н. И. Ильина, 2004; Б. С. Нагоев, 2011; M. Wist, 1998; C. Hammarguist, 2001].
Клиническое значение изменений показателей БОФ и их связь с развитием воспалительного процесса у больных ВМ до конца не изучены. В частности, не уточнена их роль в плане прогнозирования течения и исходов ВМ у детей [Е. В. Михайлова,2008; А.Л. Бондаренко 2011; О. С. Заводнова, 2011; В. А. Мартынов, 2013].
Интерлейкины (ИЛ) способны регулировать специфические иммунные процессы и отражают индивидуальную первичную реакцию на вирусный агент, позволяя оценивать характер течения, прогноз заболевания [Мазанкова Л.Н., 2004; А.Л. Бондаренко, 2011; Л. М. Алимбарова, 2011; Н. А. Каплина, 2011]. Большинство исследований цитокинового статуса при нейроинфекциях посвящено изучению противовоспалительных цитокинов [О. В. Назарочкина, 2006; Н. О. Мишакина, 2012]. Высокие уровни противовоспалительных цитокинов рассматриваются одними авторами, как фактор, направленный на ограничение воспаления [В. В. Фомин, 2010; R. Mittal, 2010], другими, - как снижающий противоинфекционную защиту и приводящий к затяжному течению заболевания [Г. А. Харченко, 2010; D.Davidson, 2013].
Несмотря на применение в лечении ВМ у детей противовирусных препаратов, частота резидуальных проявлений остается высокой, что определяет актуальность совершенствования патогенетической терапии данной патологии [М. В Дегтярева, 2005; А. Н. Та-наева, 2007; Л. А. Гульман, 2009; Л.Н. Мазанкова, 2011; А.В. Горелов, 2012].
В настоящее время в лечении тяжелых форм вирусных и бактериальных менингитов используются иммуноглобулины для внутривенного введения, обладающие широким спектром терапевтического воздействия от нейтрализации антигенов и их элиминации, до модуляции воспалительного процесса и стимуляции фагоцитоза [М. В Дегтярева, 2005; Н. В. Скрипченко, 2009; О. В. Казанова, 2010; S.A. Berkan, 1990].
Приведенные данные свидетельствуют, что оптимизация диагностики, лечения и прогнозирования исходов ВМ у детей является важной проблемой педиатрии, решение которой направлено на снижение смертности, сохранение здоровья и качества жизни пациентов, перенесших вирусный менингит.
Цель исследования
Разработать и оптимизировать критерии диагностики, лечения и прогнозирования исходов вирусных менингитов у детей на основе комплексного анализа иммунобиохимических и цитохимических данных.
Задачи исследования
Научная новизна исследования
-
Установить этиологическую структуру ВМ у детей в Астраханской области. Определить спектр потенциальных возбудителей для этиологической диагностики ВМ у детей на основе их распространенности и доказательной ассоциации с клиническими проявлениями заболевания.
-
Провести сравнительную характеристику клинических проявлений ВМ различной этиологии. Определить частоту встречаемости отдельных синдромов в различные периоды заболевания и их значение в оценке степени тяжести патологического процесса, исходов ВМ у детей.
-
Определить концентрации иммунохимических маркеров воспаления (ЛФ, ФР, ТФ), фибриногена (ФБР), показателей мик-робицидной системы лейкоцитов (КБ, МП), фибронектина (ФН) плазмы крови, провоспалительных (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, фактора некроза опухоли - (ФНО-), интерферона- и – (ИНФ-, ИНФ-) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов в сыворотке крови в зависимости от этиологии, степени тяжести и периода ВМ у детей.
-
Провести сравнительную оценку данных общеклинического, иммунобиохимического и цитохимического обследования по показателям белков острой фазы (ЛФ, ФР, ТФ, ФБР, КБ, МП), про-и противоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-, ИНФ-, ИНФ-) и установить их диагностическое и прогностическое значение.
-
Разработать прогностические критерии, определяющие исход заболевания по показателям белков острой фазы, цитокиново-го статуса. Выделить основные иммунобиохимические и цитохимические показатели, позволяющие определять выраженность поражения центральной нервной системы и эффективность проводимой терапии ВМ у детей.
-
Обосновать целесообразность использования иммуноглобулинов для внутривенного введения, разработать показания и рекомендации по их применению в комплексной терапии вирусных менингитов у детей.
Впервые, на примере вирусных менингитов у детей в
Астраханской области, изучена этиологическая структура синдро-
мально схожих групп ВМ. Проведен комплексный анализ террито
риального, возрастного и временного распределения вирусных ме
нингитов у детей.
Разработана диагностическая тест система арбовирус-ного менингита, вызванного штаммом «Астрахань-12». Впервые изучены и описаны клинические формы заболеваний, вызываемых штаммами «Астрахань-12» и «913=64».
Изучены исходы, дана их характеристика, частота и сроки развития при ВМ различной этиологии у детей.
Впервые определено клиническое и прогностическое значение различий концентрации БОФ (ЛФ, ФР, ТФ, ФБР, ФН, КБ, МП), про - и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-, ИНФ-, ИНФ-), при ВМ различной этиологии, в зависимости от тяжести, периода, течения и исходов заболевания.
Установлены критерии тяжести, течения и прогноза ВМ у детей по показателям БОФ и цитокинового статуса.
Впервые установлены критерии иммунных нарушений по показателям отдельных звеньев цитокиновой регуляции, у больных вирусными менингитами детей, на основе формулы
показатель больного
( 1} х 100
показатель нор-мы
Изучены и клинико - лабораторно обоснованы показа
ния и рекомендации по использованию иммуноглобулинов для
внутривенного введения в комплексной терапии вирусных менинги
тов у детей.
Теоретическая и практическая значимость работы
Установленная роль энтеровирусов, вируса лихорадки Западного Нила, штаммов «913=64» и «Астрахань-12», как возбудителей, обуславливающих сезонный рост заболеваемости ВМ у детей
в Астраханской области, позволяет разработать систему мероприятий по снижению заболеваемости данными инфекциями.
ви-
Установленные исходы ВМ у детей необходимо учитывать при организации и проведении нейрореабилитационной помощи данным больным.
Полученные показатели белков острой фазы (ЛФ, ФР, ТФ, ФБР, КБ, МП), фибронектина плазмы крови про- (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-, ИНФ-, ИНФ-) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов у здоровых детей могут использоваться как показатели нормы.
Установленные критерии тяжести, течения и исходов ВМ у детей, по показателям БОФ и цитокинового статуса, можно использовать для своевременной коррекции лечения.
Установленные критерии выраженности иммунных нарушений, по показателям цитокинового статуса, у больных ви-русными менингитами детей, можно использовать для диагностики вторичных иммунодефицитов.
Сокращение длительности основных синдромов, стационарного лечения, частоты неблагоприятных исходов у больных ВМ получавших иммуноглобулины для внутривенного введения, по сравнению с пациентами, находившимися на базисной терапии, позволяет рекомендовать их использование в комплексной терапии русных менингитов у детей.
Методология и методы исследования
Методологической основой исследования являлись работы отечественных и зарубежных авторов по теоретическим и практическим вопросам этиологии, эпидемиологии, патогенеза, клиники и лечения вирусных менингитов у детей.
Диссертационная работа представляет собой клиническое научное исследование, решающее задачи оптимизации диагностики, лечения и прогнозирования исходов вирусных менингитов.
Исследование проводилось на клинической базе ГБУЗ АО «Областная инфекционная клиническая больница им. Н.М. Ничоги» г. Астрахани, в период с 2009 по 2015гг.
Программа исследования включала: информированное согласие пациента, анализ медицинских карт стационарного больного,
анализ и статистическую обработку клинических и лабораторных данных.
Основные положения, выносимые на защиту
Рост сезонной заболеваемости ВМ у детей в Астрахан
ской области обусловлен энтеровирусами ECHO - 20, 21, 30; Кокса-
ки А-9, В -1-6; арбовирусами - Лихорадки Западного Нила, штам
мами «913=64», «Астрахань-12».
Критериями тяжести, течения и прогноза ВМ у детей,
по показателям белков острой фазы, в сравнении с нормой, являют
ся: снижение концентрации ЛФ сыворотки крови, количества лей
коцитов, содержащих КБ и МП, фибронектина плазмы крови и уве
личение показателя ферритина.
Дисбаланс цитокинового статуса, в острый период ВМ у
детей, характеризуется: увеличением ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-
10, ФНО - и супрессией ИЛ-2, ИНФ - , ИНФ - . Сохраняется в
периоде реконвалесценции, сопровождаясь стимуляцией ИНФ - и
ИНФ - , супрессией ИЛ-2.
Критериями тяжести, течения и прогноза вирусных менингитов у детей по показателям цитокинового статуса, по сравнению с нормой, являются:
При тяжелых формах менингита - увеличение показателей ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО - ; снижение показателей ИЛ-2, ИНФ - , ИНФ - .
При затяжном течении, критических ситуациях, летальном исходе менингита - увеличение показателей ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО - , ИНФ - , ИНФ - ; снижение показателей ИЛ-2, ИЛ-10.
Критериями иммунных нарушений у больных вирусными менингитами детей по показателям цитокинового статуса на основе формулы <Г5ИЖЕ'1Ь &5'ТЬК5Г= - П х 100являются:
показатель карлы
При тяжелых формах менингита - гиперфункция III степени иммунных нарушений ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО - , ИЛ-10- I степени, гипофункция ИЛ-2, ИНФ - , ИНФ- I -II степени иммунных нарушений.
При затяжном течении менингита - гиперфункция III степени иммунных нарушений ИЛ-1, ИЛ -4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИНФ- -
II степени, ИНФ - и ФНО- - I степени, гипофункция ИЛ-2 и ИЛ-10 - I-II степени иммунных нарушений.
При критических ситуациях и летальных исходах - гиперфункция III степени иммунных нарушений ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИНФ -, ИНФ- - II степени, гипофункция ИЛ-2 и ИЛ-10 I- II степени иммунных нарушений.
Использование в комплексной терапии тяжелых форм ВМ у детей иммуноглобулинов для внутривенного введения, в сравнении с базисным лечением, сокращает длительность основных симптомов заболевания, стационарного лечения и приводит к полной нормализации состояния у 86,7% больных вирусными менинги-
тами.
Практическое использование полученных результатов
Полученные при выполнении исследования материалы используются в ГБУЗ «Областная инфекционная клиническая больница им. А. М Ничоги», «Областная детская клиническая больница им. Н. Н. Силищевой», «Городская детская клиническая больница №2» г. Астрахани, НИИ краевой инфекционной патологии ГБОУ ВПО «Астраханский ГМУ» Минздрава России.
Основные положения и выводы диссертации включены в лекционный материал по нейроинфекциям у детей, используются на практических занятиях со студентами, интернами, ординаторами, курсантами факультета последипломного образования на кафедрах инфекционных болезней, микробиологии, иммунологии, педиатрии, поликлинической педиатрии Астраханского государственного медицинского университета Минздрава России, включены в пособие для инфекционистов, педиатров «Вирусные менингиты у детей».
рахань, 2009 -2014гг.), конгрессах детских инфекционистов (Москва, 2009 -2014гг.), педиатров России с международным участием «Актуальные вопросы педиатрии» (Москва, 2009 -2014гг.), инфекционистов (Москва, 2009 - 2015гг.), Всероссийском съезде неврологов с международным участием (Н. Новгород, 2012г.), Научно-практической конференции с международным участием «Нейроинфекции в практике клинициста» (Харьков, 2011г.), Межрегиональной научно-практической конференции «Инфекционные болезни взрослых и детей. Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики» (Астрахань, 2012г.), Региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии на Дальнем Востоке» (Хабаровск, 2012г.), Научно- практической конференции «Инфекционные болезни как междисциплинарная проблема» (Барнаул, 2015г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Давиденковские чтения» (Санкт- Петербург, 2015г.).
Объем и структура работы
Острофазовые белки и острофазовая реакция при инфекционных заболеваниях
Фибриноген является фактором свертывания крови, занимающим ведущее место в коагуляционных процессах, приводящих к образованию тромба [35, 472, 365]. При ОФР показатель концентрации фибриногена в плазме крови увеличивается в 2-3 раза по сравнению с нормой и остается повышенным в течение нескольких недель [271, 403, 352, 363]. Синтезируется фибриноген в клетках печени, мегакариоцитах и т.д. [389, 361]. В процессе трансформации фибриногена в фибрин последний образует матрицу поврежденных тканей, где в последующем идут репаративные процессы [364, 414]. Образующиеся в процессе трансформации и деградации фибриногена фибринопептиды могут повышать проницаемость сосудов, усиливать хемотаксическую активность лейкоцитов и стимулировать метаболические процессы моноцитах [480, 467, 490, 479]. Есть сведения о митогенном действии фибриногена [364].
Содержание фибриногена в крови повышается при различных заболеваниях, сопровождающихся воспалительным процессом - заболевания печени и почек, инфаркт миокарда, опухолевый процесс, ожоги, инфекционные заболевания и так далее [472, 389]. Снижение содержания выявляется при наследст 23 венном дефиците фибриногена, ДВС-синдроме,вторичных нарушениях синтеза фибриногена в печени, а также при разнообразных патологических состояниях в результате коагулопатии потребления, патологии фибринолиза[81, 375]. Фибриноген взаимодействует с фибронектином,ускоряет активацию ф.ХIII [351].Минимально необходимый для нормального формирования сгустка уровень фибриногена плазмы - 0,5 г/л [35, 81].
Ферритин является железо запасающим протеином [271, 308, 501]. Концентрация ФР в крови при воспалительной реакцииувеличивается. Известно,что при заболеваниях не сопровождающихся поражением паренхимы печени, увеличение ФР происходит за счет повышения его синтеза в клетках рети-кулоэндотелиальной системы под действием ИЛ-1 [271, 112, 302]. Синтезируется ФРклетками печени, селезенки, костного мозга, сердечной мышцы, легких, почек, щитовидной железы, плаценты, тонкого кишечника, поджелудочной железы, а также лейкоцитами[271, 128, 117, 440]. Синтезируемый в различных органах и тканях ферритин выделяется в сыворотку и в физиологических условиях уровень сывороточного ферритина (СФ) коррелирует с запасами железа в организме [299,308].
У детей отмечается резкое возрастание уровняСФ в течение первых трех месяцев жизни, что связано с процессом развития органов и тканей, а далее, начиная с 6 мес. и до полового созревания, концентрация СФ остается неизменной, варьируя в диапазоне 34,4±4,1 мкг/л.
В клинической практике СФ используется для оценки запасов железа в организме [112, 97].В последние годы обнаружены другие физиологические функции ферритина, не связанные непосредственно с обменом железа. Оказалось, что Н-изоформы ферритина могут играть роль супрессоров в пролиферации миелоидных клеток крови [299]. Установлено, что механизм подавления пролиферации клеток прямо связан с ферроксидазной функцией ферритина и реализуется через поверхностные клеточные рецепторы лимфоцитов, направленные к ферритину [449]. Подъем уровня ферритина отмечается и при остром воспалении, что позволяет рассматривать ферритин как острофазный белок [198, 449].
Имеются работы, свидетельствующие о цитопротекторных свойствах ферритина [296, 337], его связи с фактором некроза опухоли, который индуцирует синтез Н-субъединиц ферритина в фибробластах [256].Данные литературы свидетельствуют о возможности использования показателей ферритинадля оценки выраженности системного воспалительного процесса и эфективности проводимой терапии [176, 150, 200, 286, 33, 185, 302, 58, 79, 157, 215, 237, 238, 308, 129, 499, 465, 413].
Лактоферрин – белок острой фазы воспаления, осуществляющий перенос железа в клетки и концентрирующий уровень свободного железа в крови и во внешних секреторных жидкостях [203, 204, 82, 134, 16, 294, 382, 477, 404], обладает антибактериальным, противовирусным, противогрибковым и антипаразитарным действием [271, 286, 33, 409, 410, 357, 503, 469, 378, 366, 416].
К механизмам функциональной активности ЛФ относят его способность обратимо связывать ионы железа и тем самым подавлять рост микроорганизмов, а также регулировать выделение ФНО-, интерлейкинов 1, 6 и усиливать фагоцитоз [134, 271, 201, 33, 417, 348, 335, 448].При бактериальных инфекциях концентрацияЛФ в сыворотке кровиувеличивается, при вирусных инфекциях – уменьшается за счет угнетения синтеза данного белка. ЛФ обладает бактерио-статическим действием, усиливает фагоцитоз и килинг микроорганизмов [286, 201, 290, 325, 417, 328, 494]. Бактерицидные свойства ЛФобусловлены способ-ностьюсвязывать железо, лишая бактериальную микрофлору необходимого для ее роста и жизнедеятельности микроэлемента [271, 80, 445, 398].В основе антиинфекционной активности ЛФ могут лежать и другие механизмы - стимулирующее действие ЛФ на фагоцитоз и влияние на активность комплемента [80, 417, 390].
Клинико–эпидемиологическая характеристика арбовирусных менингитов
Этиологическая расшифровка менингитов проводилась с помощью по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) с коммерческими тест-системами, выпускаемыми в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва).
1. Количественное содержание лактоферрина, ферритина, трансферрина оп ределяли в сыворотке крови методом твердофазного ИФА по инструкциям фирмы производителя с использованием наборов реагентов для определения концентрации ЛФ, ФР, ТФ ЗАО «Вектор-Бест» г. Новосибирск (чувствитель ность метода 1-5 нг/мл). Регистрацию результатов ИФА проводили в 96 луночных полистироль-ных планшетах на фотометре при длине волны 450 нм. После измерения оптической плотности раствора в пулах, на основании калибровочного графика,рассчитали концентрацию ЛФ, ФР, ТФ в исследуемых образцах.
2. Для определения фибриногена в сыворотке крови использовался метод радиальной иммунодиффузии в агаре по Manсini G.J. Метод основан на свободной диффузии антигена в агаресодержащем антитела. Агар 1,2-1,5% смешивается при температуре 48-52С с антисывороткой или фракцией иммуноглобулинов до конечной концентрации 8-12% (в зависимости от титра антисыворотки). На залитых данной смесью пластинках пробивают лунки, в которые вносят исследуемые смеси. Через 24-48-72 часов образуются зоны преципитации, площадь которых пропорциональна концентрации антигена.
3. Для определения КБ лейкоцитов применялась методика В.Е. Пигаревско-го [217] при внесении изменений в окраску ядер и оценку реакции [46]. Высушенные на воздухе мазки крови фиксировали в течение 7-10 минут в метаноле, затем в течение 10-15 минут окрашивали раствором прочного зеленого, троекратно промывали дистиллированной водой и высушивали. В качестве фоновой окраски использовали в течение 2 секунд 0,1% раствор сафрани-на.Изучение мазков проводили при иммерсионном увеличении. Гранулы КБ выглядели темно-зелеными на фоне розовых ядер. В мазке посчитывали 100 лейкоцитов, активность которых оценивали по 4-х бальной системе: 0 (отсутствие гранул), 1(низкая активность), 2(высокая активность), 3 (выход гранул за пределы цитоплазмы лейкоцита). Низкая степень реакции определялась при количестве гранул прочного зеленого, занимающего менее половины площади лейкоцита, высокая – при полном или почти полном (более половины) заполнении гранулами. Лейкоциты с начальными признаками «выхода» гранул прочного зеленого за пределы клетки были полностью заполнены гранулами с белком (начало выхода) либо содержали их в минимальном количестве (конец выхода). Результаты оценивали по проценту положительно реагирующих форменных элементов.
Кроме того, выводились коэффициенты 1 и 2. Коэффициент 1 – соотношение лейкоцитов с высокой и умеренной активностью КБ, коэффициент 2 – процент лейкоцитов с высокой активностью КБ от общего количества положительно реагирующих клеток.
4. Определение миелопероксидазы проводили бензидиновым способом. Мазок периферической крови фиксировался спирт-формалином в течение 10 секунд, промывался проточной водой, обрабатывался рабочим реактивом в течение 20 минут (20мг бензидина растворить в 6 мл 96% спирта и добавить 4 мл дистиллированной воды). Перед использованием к полученному раствору добавить 1 каплю 3% перекиси водорода, после чего промывался проточной водой и докрашивался в течение 5 минут сафранином. Результаты оценивались по проценту положительно реагирующих форменных элементов. Соотношение лейкоцитов с различной степенью активности МП определялось коэффициентами. Коэффициент 1 – соотношение лейкоцитов с высокой и умеренной активностью МП, коэффициент 2 – процент лейкоцитов с высокой активностью МП от общего количества положительно реагирующих лейкоцитов.
5. Определение концентрации фибронектина плазмы крови проводилось методом ИФА, по инструкциям производителя, с использованием набора реагентов для определения фибронектина ЗАО «БиоХимМак» г. Москва. 6. Определение концентрации ФНО- в сыворотке крови проводилось по инструкции производителя методом ИФА при использовании наборов реагентов производства «Протеиновый контур», г. Санкт-Петербург. В наборе Pro Con использован метод твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы-хрена в качестве индикаторного фермента. Молекула ФНО- находится в наборе в виде коньюгата с биотипом. На первой стадии анализаФНО – в калибровочных и исследуемых пробах связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный ФНО- взаимодействует со вторыми антителамимеченными биотипом. Количество связывающего коньюгата прямопорционально (по количеству), ФНО– в исследуемом образце. На последней стадии в лунки вносится коньюгат-стрептавидин-пероксидаза. Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченных антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация ФНО- в определенных образцах. Чувствительность тест- системы 5 нг/мл.
7. Определение концентрации ИНФ- и ИНФ- в сыворотке крови проводилось методом твердофазного ИФА с использованием набора реактивов для им-муноферментного анализа ИНФ- и ИНФ- ООО «Цитокин», Санкт-Петербург. Чувствительность метода 30 нг/мл.
8. Определение концентрации ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 в сыворотке крови проводилось методом твердофазного ИФА, по инструкции изготовителя иммуноферментных тест систем, для количественного определения уровней цитокинов человека«ООО Цитокин» Санкт-Петербург.
Чувствительность метода для ИЛ-1 – 10пг/мл, ИЛ-2 – 10пг/мл ИЛ-4 – 2 пг/мл, ИЛ-6 – 5пг/мл, ИЛ-8 – 10 пг/мл.
В лунки планшета вносились по 0,1 мл буфера и калибровочные пробы (сыворотка крови). После чего стрипы инкубировались в течение 2 часов со встряхиванием при температуре 37С. По окончании инкубации, удалялось содержимое лунок декантированием и пятикратной промывкой. При каждой промывке во все лунки добаляли по 0,3 мл промывочного буфера, встряхивали рамку на шейкере, в течение 5-10 сек. с последующим декантированием. При каждом декантировании тщательно удаляли остатки жидкости из лунок встряхиванием рамок со стрипами в перевернутом положении на фильтровальной бумаге.
Далее во все лунки вносили по 0,1 мл раствора конъюгата, после чего стрипы повторно инкубировали в течение 60 минут со встряхиванием при температуре 37С, а затем промывали.
По окончании промывки во все лунки добавляли по 0,1 субстратной смеси и инкубировали в течение 15-20 мин., после чего останавливали реакции с помощью внесения 0,05 мл «Стоп-реагента», встряхивали на шейкере 10 минут и измеряли оптическую плотность в образцах при длине волны 450 нм. На основании полученных результатов, на масштабной бумаге строили график для калибровочных проб, после чего определяли концентрации интерлейкинов в исследуемых биологических жидкостях по построенному калибровочному графику.
Общеклинические и инструментальные методы обследования включали: осмотр, контроль гемограммы, ликвора, биохимических показателей крови и ликвора, электролитов крови у всех больных, исследование глазного дна, электроэнцефалографию, компьютерную или магниторезонансную томографию по показаниям.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с исползова-нием компьютерных программMSExcel - 2003 (Microsoft, США) и Statistica 7.0 (StatSoft, США) с использованием параметрической и непараметрической статистики в зависимости от шкал и характера распределения переменных. В случае нормального распределения признака использовали количественные переменные: средняя арифметическая, среднее квадратическое отклонение, ошибка средней арифметической. Достоверность различий количественных признаков определяли с помощью критерия Стьюдента – t для сравнения независимых выборок. Различия считались статистически значимыми при p 0, 05.
Методы непараметрической статистики применялись в том случае, если предварительный анализ распределения количественных показателей клиниче ской характеристики заболевания не подтверждал гипотезу о гаусовском харак тере их распределения.Для определения достоверности различий качественных признаков использовали анализ таблиц сопряженностей с вычислением точного значения критерия и точного критерия Фишера. Для анализа количественных признаков при сравнении двух независимых выборок применяли критерий Манна – Уитни (U), при сравнении трех и более выборок критерий Краскела -Уолисса (H). Для выявления односторонней зависимости случайной зависимой переменной от нескольких независимых переменных применялся метод регрессивного анализа.
Диагностическое и прогностическое значение лактоферрина, ферритина, трансферрина и фибриногена при вирусных менингитах
Нормализация показателей ликвора наблюдалась в конце 2-3 недели заболевания. В гемограмме при поступлении чаще лейкоцитоз до 10,86±1,5410 9/л – в 77,9%. У 22,1% больных количество лейкоцитов составляло от 4,4 до 7,610 9/л. Изменения в моче отмечались у больных с тяжелыми формами заболевания и носили токсический характер (белок, лейкоциты, эритроциты).
У 87 (29%) больных, среднетяжелыми формами заболевания, менинге-альный синдром отсутствовал, на первый план выступала общемозговая сим-птоматика.Начало заболевания острое. Температура тела повышалась до 38-39,5С, беспокоили резкая головная боль, рвота не связанная с приемом пищи, отмечались катаральные изменения в ротоглотке. Лихорадка на фебрильных цифрах сохранялась в течение 1-3 суток, затем снижалась до нормальных или субфебрильных цифр при сохранении головной боли, рвоты, что являлось основанием для проведения люмбальной пункции и исследования СМЖ при поступлении больного в стационар. Основным направительным диагнозом данной группы больных был – острая респираторная вирусная инфекция. При проведении люмбальной пункции ликворное давление было повышенным. Цвет ликво-ра неизменен. Цитоз ликвора от 20 до 30 клеток в 1 мкл, смешанного нейтро-фильно-лимфоцитарного характера. При исследовании ликвора в динамике (5-6 день заболевания) цитоз ликвора увеличивался в 2-5 раз, сохраняя нейтро-фильно-лимфоцитарный характер. Средняя величина показателя цитоза, в данный период, составляла 132,7±30,5 клеток в 1 мкл. Клинически, на фоне увеличения цитоза, нарастали симптомы интоксикации и неврологическая симптоматика (головная боль, рвота). Заболевание носило волнообразный характер, пролонгируя сроки санации ликвора и длительность нахождения больного в стационаре. Другим вариантом течения заболевания, у данных больных, было быстрое исчезновение симптомов интоксикации и неврологической симптоматики, при сохранении изменений в ликворе в виде показателей цитоза (до 30 клеток в 1 мкл) в течение 3 и более недель, при удовлетворительном самочувствии больного и отсутствии клинических признаков заболевания. Клиническими примерами данных вариантов течения заболевания являются следующие наблюдения. Больной А. 10 лет. История болезни №546. Заболел остро. Температура тела повысилась до 39С отмечались слабость, недомогание. Лечился симптоматическими средствами дома, к врачу не обращался. На 2-ой день заболевания присоединились рвота, головная боль, продолжал лихорадить. Госпитализирован на 3-й день заболевания в состоянии средней степени тяжести.
При осмотре: температура тела 37,5С.Жалобы на сильную головную боль. В ротоглотке катаральные явления. При выраженной ригидности мышц затылка, симптомы Кернига, Брудзинского отрицательные. При исследовании СМЖ цитоз ликвора 36 клеток в 1 мкл смешанного нейтрофильно-лимфоцитарного характера (нейтрофилы – 64%, лимфоциты – 36%). Белок ликвора, сахар и хлориды в пределах нормы. На фоне дезинтоксикационной терапии с дегидратацией самочуствие улучшилось (в первый день лечения), а температура тела снизилась до нормальных цифр. На 6 день от начала заболевания, температура тела вновь повысилась до 38,5С, менингеальный синдром стал четко выраженным (ригидность мышц затылка, положительный симптом Кернига, верхний симптом Брудзинского). При повторном исследовании СМЖ, на 6 день от начала заболевания, цитоз ликвора нарос до 150 клеток, оставаясь нейтрофильно-лимфоцитарного характера. Серологическое обследование на наличие антител к вирусу ЛЗН в сыворотке крови (реакция ИФА) на 7 и 14-й день от начала заболевания, положительное – выявлены антитела класса Ig M в титре1:400 и 1:3200 в динамике.
Проведение патогенетической терапии в сочетании с индуктором интерферона «Циклоферон» позволило достигнуть полного клинического выздоровления и санации ликвора на 22 день от начала заболевания. Диагноз клинический: Лихорадка Западного Нила, серозный менингит, волнообразное течение. Больной С. 12 лет. История болезни №311. Заболел остро. Температура тела повысилась до 38,5С, отмечались головная боль, слабость, тошнота, однократно рвота. Госпитализирован на второй день заболевания в состоянии средней степени тяжести с лихорадкой до 38С, жалобами на головную боль. При осмотре умеренно выраженный катаральный синдром. Менингознаки отрицательные. В гемограмме: количество лейкоцитов 8,210 9/л, формула крови без существенных изменений, СОЭ 9 мм/час. Выраженность общемозговой симптоматикинесоответствовала катаральному синдрому, что явилось основанием для проведения диагностической люмбальной пункции. При исследовании СМЖ цитоз ликвора 51 клетка в 1 мкл, из них нейтрофилы 27, лимфоциты 24 клетки.
Проведение патогенетической терапии позволило к 5 дню от начала заболевания, достигнуть улучшения состояния больного. Температура нормализовалась, рвота не повторялась, головная боль исчезла. На 14 день заболевания, при отсутствии клинических признаков менингита, проведено контрольное исследование СМЖ. Цитоз ликвора 27 клеток, лимфоцитарный, белок, сахар и хлориды в норме. Полная санация ликвора наступила к 21 дню от начала заболевания, хотя клиническое выздоровление наступило значительно раньше. Серологическое обследование в ИФА на наличие антител к вирусу ЛЗН в сыворт-ке крови дало положительный результат, с нарастанием титра антител класса Ig M в 4 раза.
Особенности цитокиновой регуляции при арбовирусных менингитах
История болезни №207. Поступила на 2-й день болезни с диагнозом острая респираторная вирусная инфекция. Ребенок от 2-й беременности протекавшей без особенностей. Роды естественные, в срок. Вес при рождении 3100 г, рост – 48 см, оценка по шкале Апгар – 8 баллов. Привита вакцинами БЦЖ и против вирусного гепатита В. Наблюдалась невропатологом с диагнозом перинатальная энцефалопатия с задержкой темпов психомоторного развития. Перенесенные заболевания: ОРВИ – дважды, гастроэнтерит в возрасте 1,3 и 4 месяца. Лечилась стационарно. Настоящее заболевание началось остро. Температура тела повысилась до 37,6С, кашель, срыгивания. На 2-й день заболевания отмечались судорожные подергивания мышц лица, конечностей, кратковременные тонические судороги, купировавшиеся самостоятельно.
При осмотре в приемном покое: самочувствие страдает нерезко. В сознании, активна, температура тела 37,9С. Менингознаки отрицательные. Голова гидроцефальной формы. Большой родничок 3x3,5 см с расхождением швов, умеренно напряжен. Ринит, выделения из носа слизистые. Кожа бледная, мраморность. Полиадения, лимфоузлы мелкие безболезненные. Пониженного питания. Дефицит веса около 20%. Тургор тканей сохранен. Кашель влажный, нечастый. Число дыханий 32 в 1 минуту. Гемодинамика не страдает. Число сердечных сокращений – 130 в 1 минуту. Печень + 1,5 см ниже края реберной дуги, безболезненная, эластичная. Селезенка не пальпируется. В течение первых 5 дней нахождения в стационаре (на фоне проводимой терапии ОРВИ) состояние ухудшилось: наросла вялость, резко снизился аппетит, усилилась мраморность кожи. Температура тела от 37,6С до 38,9С. Кашель усилился, появилась одышка до 44 в 1 минуту. Перкуторно отмечалось укорочение легочного звука справа, ниже угла лопатки, там же ослабление дыхания, хрипы не выслушивались. Изменился неврологический статус: большой родничок выбухал, периодически судороги клонико-тонического характера. Мышечный тонус повышен, тремор конечностей и подбородка. В цереброспинальной жидкости (на 5-й день госпитализации) цитоз 32 клетки в 1 мкл, из них 18 нейтрофилы, белок 0,33 г/л, ликворное давление высокое. В периферической крови - лейкоциты 11,8x109/л, палочкоядерные 8%, сегментоядерные 62%, лимфоциты 24%, моноциты 8%, СОЭ 20 мм/час, токсическая зернистость лейкоцитов. В мазке из зева, количественным методом на флору, StreptococcusPneumonia. Серологическое обследование на респираторные вирусы – отрицательное. Рентгенография органов грудной клетки – очаговая бронхопневмония справа.
По клинико-лабораторным данным выставлен диагноз менингоэнцефа-лит (предположительно цитомегаловирусной этиологии, правосторонняя бронхопневмония). Дальнейшее течение заболевания с отрицательной динамикой. Сохранялись лихорадка, неврологическая симптоматика, изменения в легких, присоединился энтероколитный стул. При повторной рентгенографии легких через 10 дней положительной динамики не отмечено. Цитоз ликвора 26 клеток в 1 мкл лимфоцитарного характера. При обследовании на герпесвирус-ные инфекции методом ИФА на 15 день болезни в крови больного определили IgM – антитела к ЦМВ. Проведено лечение специфическим иммуноглобулином «Цитотект» из расчета 10% раствор в дозе 2 мл/кг массы тела в сутки, внутривенно через день (5 введений). Вифероном по 150000 МИЭФ в течение 3 недель (в первую неделю ежедневно, затем через день) и двухкратным введением 5% раствора пентаглобина из расчета 400 мг/кг массы тела больного (суточная доза). Одновременно проводилась дезинтоксикационная и антибактериальная терапия меронемом в возрастной дозировке. На фоне данной терапии состояние больной улучшилось, температура снизилась до субфебрильных цифр, а затем нормализовалась, к 20 дню от начала заболевания. Пневмония клинически и рентгенологически разрешилась на 30 день. Ликвор санировался на 5 неделе от начала заболевания. Больная переведена в неврологическое отделение на восстановительное лечение на 38 день от начала заболевания.
Диагноз при выписке: Цитомегаловирусная инфекция постнатальная, генерализованная, менингоэнцефалит, правосторонняя бронхопневмония, энтероколит острое течение. Субкомпенсированная гидроцефалия. Гипотрофия II степени. В данном случае определяющим является уточнение этиологии ме-нингоэнцефалита и пневмонии. Проведение курса этиотропной терапии ци-тотектом в сочетании с вифероном и пентаглобином позволило достигнуть положительной динамики и в конечном итоге обратного развития менингоэн-цефалита и пневмонии, способствовало сокращению длительности основного заболевания. Данное заболевание так же демонстрирует, что в развитии пневмонии кроме ЦМВ участву бактериальный фактор, на что указывают высев бактериальной флоры из мокроты и изменения гемограммы. Больной А., 1 месяц. История болезни №196. Ребенок от второй беременности. Беременность протекала с угрозой прерывания. Роды преждевременные, на 32 неделе беременности. Вес при рождении 1600,0г. Голова гидроцефальной формы, рефлексы угнетены, нистагм, ассиметрия мимической мускулатуры, косоглазие, гипертонус конечностей, желтушное окрашивание кожи, единичные элементы геморрагической сыпи на коже туловища. Гепатоспленомегалия. Температура тела 37,2С. На 5 день после родов переведен в городскую больницу для новорожденных с диагнозом: Внутриутробная инфекция, недоношенность, гидроцефалия, конъюгационная желтуха. В течение последующих 3 недель сохранялись: гипертонус конечностей, тремор, субфебрильная температура тела, отсутствовала прибавка в массе тела. Нарастали гипертензионно-гидроцефальный синдром, желтуха. Гепатоспленомегалия (печень на 5 см, селезенка на 3 смниже края реберной дуги). При биохимическом исследовании крови - билирубинемия с преобладанием прямой фракции, активность цитоплазматических ферментов в 3 раза, щелочной фосфатазы в 2 раза превышала норму. Со стороны желудочно-кишечного тракта клиника энтерита, с частотой стула до 5 раз в сутки. В гемограмме лейкоцитоз 13,4x109/л, тромбоцитопения до 49x109/л. Патологические изменения ликвора, на 8 день жизни, отсутствовали. 21-й день – цитоз 20 клеток в 1 мкл, лимфоцитарного характера, белок 0,15г/л. В неврологическом статусе, на данный период, легкая ассиметрия глазных щелей, сглаженность левой носогубной складки, кратковременные судороги тонического характера. На ЭЭГ угнетение биоэлектрической активности мозга, в лобно-центральных отделах обоих полушарий. На 45 день жизни ребенка темпера 107 тура тела нормализовалась, судороги прекратились. Сознание изменено – реакция на осмотр в виде двигательного беспокойства, тремора конечностей и туловища, за предметами не следит, левосторонний гемипарез. При проведении компьютерной томографии резкое снижение плотности мозгового вещества, желудочковая система расширена и смещена влево. Исследование глазного дна в динамике выявило частичную атрофию зрительных нервов. При обследовании, методом ИФА ликвора и крови выявлены антитела IgM, что свидетельствовало о активной ЦМВИ. Данное исследование подтверждено выявлением генома ЦМВ при помощи полимеразной цепной реакции являющейся в настоящее время наиболее признанным методом диагностики. Проведенное лечение: цитотект 10% раствор из расчета 2 мл/кг массы тела в сутки. Курс - 3 введения, через день. «Виферон-1» в свечах по схеме с общей длительность курса лечения 66 дней. Иммуноглобулин G для внутривенного введения из расчета 3 мл на кг массы тела (разовая доза) ежедневно в течение 5 дней. Син-дромальная и симптоматическая терапия. Дезинтоксикация, антибиотико-терапия препаратами из группы цефалоспоринов, макролидов.
Больной выписан из стационара через 4 месяца после рождения с диагнозом: Врожденная цитомегаловирусная инфекция, генерализованная форма, затяжное течение, энцефалит, гепатит, с остаточными явлениями в виде де-менции по олигофреническому типу, левостороннего гемипареза.