Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Современное состояние проблемы внебольничной пневмонии у детей 14
1.2. Энергетический метаболизм клетки 22
1.3. Методы диагностики состояния системы энергопродукции .26
1.4. Элькар – универсальный стимулятор и корректор энергетического
обмена 31
Глава 2. Материал и методы
2.1.Характеристика обследованных групп детей 38
2.2. Характеристика клинических и лабораторных методов исследования 40
2.3. Статистическая обработка данных .43
Глава 3. Клинико-лаборторная характеристика детей с внебольничной пневмонией
3.1. Клинико-лабораторная характеристика обследованных детей .44
3.2. Оценка анамнестических и медико-биологических факторов риска развития внебольничной пневмонии у детей 50
3.2.1. Анализ роли полиморфизма генов IL-6,10,12, SOD и TNF- в развитии внебольничной пневмонии у детей различных вариантов течения .53
3.3. Характеристика энергетического метаболизма обследованных детей .56
3.4. Анализ процессов свободнорадикального окисления в сыворотке крови у детей с внебольничной пневмонией 65
Глава 4. Оценка эффективности применения элькара в комплексной терапии внебольничной пневмонии у детей
4.1.Динамика клинико-лабораторных показателей на фоне стандартной терапии и терапии с Элькар .70
4.2. Влияние Элькара на динамику показателей энергетического метаболизма ИКК у детей с внебольничной пневмонией 71
4.3.Влияние Элькара на динамику процессов свободнорадикального окисления в сыворотке кровиу детей с внебольничной пневмонией 74
Заключение .90
Выводы 104
Практические рекомендации 106
Список литературы
- Методы диагностики состояния системы энергопродукции
- Характеристика клинических и лабораторных методов исследования
- Анализ роли полиморфизма генов IL-6,10,12, SOD и TNF- в развитии внебольничной пневмонии у детей различных вариантов течения
- Влияние Элькара на динамику показателей энергетического метаболизма ИКК у детей с внебольничной пневмонией
Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболевания органов дыхания широко распространены среди детского населения и имеют большой удельный вес в структуре заболеваемости. Довольно частой формой поражения органов дыхания у детей являются пневмонии. Изучение внебольничной пневмонии (ВП) за последние десятилетия, как в нашей стране, так и за рубежом позволило существенно изменить представление о многих аспектах этой проблемы, оптимизировать диагностическую и лечебную тактику (Геппе Н.А., 2009; Галкина Е.В., 2011; Ми-зерницкий Ю.Л., 2011; Iroh Tam P.Y., 2013; Wang L.J., 2013). Но, несмотря на современные достижения медицинской науки, заболеваемость ВП остается на высоком уровне.
На основании комплекса работ последних лет выдвинуто положение о наличии различных типов индивидуального энергетического статуса организма и о существовании скрытой формы относительной индивидуальной недостаточности цитоэнергетического статуса организма - «энергодефицитного диатеза». Для пациентов с энергодефицитным диатезом характерно своеобразие индивидуального течения заболевания, когда обычное лечение недостаточно эффективно и требуется специфическая энерготропная терапия (Сухоруков В.С.,2000; Царегородцев А.Д., 2006).
Ткани легких обладают высокой метаболической активностью и, соответственно, значительными энергетическими потребностями, что предполагает особую чувствительность к нарушениям энергетических процессов (Сенаторова А.С., 2009; Schumacker P.T., 2014). Своевременное выявление нарушений энергетического обмена позволит разработать меры профилактики развития патологических процессов и оптимизировать терапию различных заболеваний (Нако-стенко Т.Н., 2007; Кашуро В.А., 2010; Ryter S.W., 2015), в том числе и внеболь-ничной пневмонии у детей.
Представленные сведения указывают на необходимость дальнейших исследований в данном направлении и поиск способов коррекции энергетического обмена у детей при ВП, чему и посвящена данная работа.
Цель исследования: диагностика, оценка клинического значения дефицита энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови и обоснование его коррекции препаратом Элькар в терапии внебольничной пневмонии у детей.
Задачи исследования:
-
Изучить различные варианты клинического течения внебольничной пневмонии у детей (реактивного и условно гипореактивного) на основе сравнительной оценки показателей энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови при помощи определения процента клеток со сниженным мембранным потенциалом митохондрий, активности ферментов лимфоцитов.
-
Оценить анамнестические и медико-биологические факторы риска развития внебольничной пневмонии, проанализировать роль полиморфизма генов IL-6, IL-10, IL-12, SOD, TNF- в развитии различных вариантов течения внеболь-ничной пневмонии у детей (реактивного и условно гипореактивного).
-
Выявить особенности состояния отдельных показателей свободноради-кального окисления сыворотки крови у детей с различными вариантами клинического течения внебольничной пневмонии (реактивного и условно гипореак-тивного).
-
Научно обосновать и оценить клиническую эффективность применения метаболического и энерготропного препарата Элькар у детей с внебольничной пневмонией на основании динамики клинических проявлений заболевания, энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток.
Научная новизна: При оценке генетических факторов риска развития внебольничной пневмонии у детей отмечено, что у носителей гомозиготного варианта гена Il-12 в позиции C-592A (OR=15,55; 95% Cl 0,84-289,5) и гетерозиготного варианта гена SOD в позиции Ala-16Val (OR=4,55; 95% Cl 1,5-13,76) повышен риск развития внебольничной пневмонии условно гипореактивного течения.
Выявлено, что течение внебольничной пневмонии у детей сопровождается взаимозависимыми и сопряженными процессами снижения биоэнергетики им-
мунокомпетентных клеток крови, митохондриального пути реализации апопто-генной программы лимфоцитов периферической крови, системной гиперпродукцией активных форм кислорода.
Разработан способ ранней диагностики нарушения энергообеспечения им-мунокомпетентных клеток крови при помощи определения процента клеток со сниженным мембранным потенциалом митохондрий лимфоцитов. Разработана схема коррекции выявленных нарушений энергообеспеченности иммунокомпе-тентных клеток крови у детей с внебольничной пневмонией.
Доказана эффективность применения метаболического, энерготропного препарата «Элькар» в стандартной схеме терапии детей с внебольничной пневмонией.
Практическая значимость
1. При анализе клинико-лабораторных показателей выявлены различ-
ные варианты течения внебольничной пневмонии.
Типичное (реактивное) течение, сопровождающееся отчетливой клинической картиной заболевания (острое начало, наличие локальных физикальных изменений в легких по данным перкуссии и аускультации, наличие воспалительных изменений в гемограмме).
Условно гипореактивное течение внебольничной пневмонии, характеризующееся слабовыраженными клиническими проявлениями заболевания (субфебрилитет, длительный кашель, минимальные физикальные изменения в легких при перкуссии и аускультации легких, незначительные проявления симптомов интоксикации), отсутствием воспалительных изменений в гемограмме.
Различное клиническое течение заболевания характеризуется своеобразием показателей, отражающих состояние энергообеспеченности клетки. Наиболее значительные нарушения энергообеспечения диагностируются в группе с условно гипореактивным типом течением заболевания.
В основе условно гипореактивного течения внебольничной пневмонии лежит снижение энергообеспечения иммунокомпетентных клеток крови.
2. Разработан и рекомендуется к практическому применению способ
ранней диагностики нарушения энергообеспечения иммунокомпетентных кле
ток крови при помощи определения процента клеток со сниженным мембран
ным потенциалом митохондрий лимфоцитов.
Исследование процента клеток со сниженным мембранным потенциалом митохондрий методом проточной цитометрии позволяет достоверно определить нарушения энергообеспеченности клеток на более раннем этапе, при отсутствии изменений активности окислительно-восстановительных ферментов цитохимическим методом. Это позволяет использовать данный метод в клинической практике с целью оптимизации диагностики степени нарушения энергообеспечения иммунокомпетентных клеток крови у детей с внебольничной пневмонией, а также для выделения детей с внебольничной пневмонией группы риска, требующих коррекции энергетического метаболизма.
-
В зависимости от степени выраженности снижения энергообеспечения лимфоцитов разработан алгоритм проведения корригирующей метаболической, энерготропной терапии.
-
Патогенетически обоснована и оптимизирована схема лечения вне-больничной пневмонии, включающая метаболический, энерготропный препарат «Элькар».
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1. При оценке анамнестических и медико-биологических факторов
риска развития внебольничной пневмонии у детей выявлено, что статистически значимыми являются раннее искусственное вскармливание, пассивное курение, частые ОРВИ, наличие сопутствующих заболеваний со стороны ЛОР-органов, ЦНС, желудочно-кишечного тракта.
Анализ полиморфизма генов IL-6, IL-10, IL-12, SOD, TNF- у детей с вне-больничной пневмонией выявил, что у носителей гомозиготного варианта гена Il-12 в позиции C-592A (OR=15,55; 95% Cl 0,84-289,5) и гетерозиготного варианта гена SOD в позиции Ala-16Val (OR=4,55; 95% Cl 1,5-13,76) повышен риск
развития внебольничной пневмонии условно гипореактивного течения.
-
Условно гипореактивное течение внебольничной пневмонии у детей, характеризующееся слабовыраженными клиническими проявлениями заболевания и отсутствием воспалительных изменений в гемограмме обусловлено снижением энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови.
-
Применение Элькара в комплексной терапии способствует не только улучшению энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови (снижает процент лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий, восстанавливает активность окислительно-восстановительных ферментов), но и корригирует нарушения окислительного метаболизма. Это свидетельствует о восстановлении как энергообеспеченности этих клеток, так и об ингибировании митохондриального пути запуска апоптоза.
Апробация работы. Результаты диссертационного исследования доложены: на XV краевом конкурсе молодых ученых и аспирантов (секция «Медицинские науки») (г. Хабаровск, 2013 г.); на II конкурсе молодых ученых в рамках XIII международного конгресса «Доказательная медицина – основа современного здравоохранения» (г. Хабаровск, 2014 г.); на конкурсе научных работ молодых ученых в рамках III съезда педиатров Дальневосточного Федерального округа «Современные вопросы педиатрии» (г. Якутск, 2014 г.); на II Региональной научной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной биологии и медицины» (г. Хабаровск, 2014 г.); на Межрегиональной научно-практической конференции «Современные подходы к терапии инфекций нижних дыхательных путей у детей» (г. Хабаровск, 2014 г.); на XVII краевом конкурсе молодых ученых и аспирантов (секция «Медицинские и биологические науки») (г. Хабаровск, 2015 г.); на VI съезде врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока (г. Благовещенск, 2015 г.); на XV Всероссийском научном форуме с международным участие имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2015 г.).
Внедрение результатов исследования. Результаты проведенной научно-исследовательской работы внедрены в работу клиники Хабаровского филиала
ДНЦ ФПД – НИИОМИД, используются в учебном процессе на кафедрах детских болезней ГБОУ ВПО ДВГМУ и клинико-лабораторной диагностики КГБОУ ДПО ИПКСЗ. Оформлены методические рекомендации: «Способ диагностики нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов при внеболь-ничной пневмонии у детей». Получена приоритетная справка на заявку о выдаче патента «Способ диагностики нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов при внебольничной пневмонии у детей» (регистрационный № 2014152971 от 25.12.2014).
Личный вклад автора: Личный вклад автора в том, что он принимал непосредственное участие в планировании, формулировании целей и задач, определении методов исследования. Автором лично выполнен клинический раздел работы, основные методы исследования по оценке энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови (методами цитохимическим и проточной цитометрии), разработана схема индивидуального дозирования препарата Элькар в зависимости от степени снижения энергообеспеченности иммуноком-петентных клеток. Основные результаты работы получены автором лично, либо в соавторстве при его непосредственном участии, включая статистическую обработку материалов, написание всех разделов исследовани.
Публикация: По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для освещения основных результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата наук.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, главу «Материалы и методы», 2 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации. Работа проиллюстрирована 26 таблицами и 3 рисунками. Библиографический указатель включает 231 источник (145 отечественных и 86 зарубежных авторов).
Методы диагностики состояния системы энергопродукции
На современном этапе значимым фактором этого является изменение клинических проявлений внебольничной пневмонии у детей [48, 52, 96, 168, 207, 226]. Так, течение острых пневмоний у детей отличается от типичных «классических» проявлений заболевания диспропорцией между объемом и характером поражения легочной ткани и показателями неспецифической реактивности организма в ответ на воспалительный бактериальный процесс в легких, увеличивается число рецидивирующих форм заболеваний органов дыхания. У многих больных внебольничной пневмонией имеют место клинические проявления вторичного иммунодефицита, а именно: вялотекущий воспалительный процесс, подверженность ОРВИ, незначительный и кратковременный эффект от антибактериальной терапии [4, 40, 77, 94, 120,121, 220]. Таким образом, поиск новых патогенеческих механизмов и терапия внебольничной пневмонии у детей являются актуальными вопросами педиатрии.
Основу патогенеза заболеваний внебольничной пневмонии у детей составляет сложное, недостаточно изученное сочетание генетически детерминированных и приобретенных дефектов иммунорегуляторных механизмов с развитием патологической активации различных звеньев иммунной системы.
В Дальневосточном федеральном округе, в том числе Хабаровском крае, выявлены изменения различных звеньев иммунной системы. Изменение иммунологической реактивности может быть наиболее ранним признаком и результатом неблагоприятного влияния различных экологических факторов.
Как известно, проникновение микроогранизмов в респираторную систему вызывает воспалительную реакцию в паренхиме легких, которая зависит от количества и вирулентности микроорганизмов, состояния защитных механизмов дыхательных путей и организма в целом [79, 99, 100]. Микроорганизм, преодолев защитные барьеры дыхательных путей, может попасть непосредственно в альвеолы и там интенсивно размножаться. Под действием токсинов микроба нарушается проницаемость капилляров, развивается серозный отек. Отечная жидкость, содержащая большое количество бактерий, быстро распространяется через альвеолярные поры на всю долю легкого, нередко вовлекая в воспалительный процесс плевру. Нарушения проходимости бронхов, расстройства микроциркуляции, воспалительная инфильтрация, интерстициальный отек легочной паренхимы и снижение воздушности легочной паренхимы приводят к нарушению перфузии газов и гипоксемии [23, 79]. Последняя сопровождается респираторным ацидозом, гиперкапнией, компенсаторной одышкой и проявлением клинических признаков дыхательной недостаточности. В случае формирования адекватного иммунного ответа при инфицировании легочной ткани происходит ограничение распространения воспалительного процесса, в связи с чем пневмония в большинстве случаев имеет одностороннюю локализацию [63, 69, 70]. При отсутствии адекватного иммунного ответа происходит изменение клинического течения заболевания.
Одной из ведущих причин осложненного и затяжного течения пневмонии считается изменение иммунологической реактивности организма [132, 133, 168]. Изучение внебольничной пневмонии за последние десятилетия как в нашей стране, так и за рубежом позволило существенно изменить представление о многих аспектах этой проблемы и оптимизировать диагностическую и лечебную тактику. В работах российских и иностранных исследователей показано, что особенности клинической картины внебольничной пневмонии у детей зависят от их возраста, иммунного статуса и свойств респираторных патогенов [59, 60, 122, 126, 191, 199].
Множество работ посвящено исследованию иммунных нарушений и их роли в патогенезе внебольничной пневмонии [2, 42, 63, 69, 90, 229]. Так, Х.М.Вахитов (2009) показал, что развитие внебольничной пневмонии у детей сопровождается не только повышением уровня провоспалительных интерлейкинов, но и существенными нарушениями в составе липопротеидов, в первую очередь, за счет повышения атерогенных фракций в сочетании с интенсивной активацией процессов перекисного окисления липидов [18].
Г.А.Мавзютовой (2010) были разработаны и внедрены иммунологические критерии тяжелого и осложненного течения внебольничной пневмонии с учетом состояния системной бактериальной эндотоксинемии и антиэндотоксиновой защиты, особенностей иммунного ответа, являющиеся показанием для иммунокоррекции: снижение показателей фагоцитоза (фагоцитарного индекса и числа), натуральных киллеров CD16+/CD56+; CD4+ - Т-хелперов, CD19+- В-лимфоцитов, HLA-DR+(антигенов главного комплекса гистосовместимости 2-го класса); иммуноглобулинов классов G, при одновременном многократном увеличении уровней сывороточных провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, TNF-, на фоне значительного снижения содержания IL-4 [70]. Бактериальная эндотоксемия влияет на энергообеспеченность иммунной клетки.
Е.П. Калининой (2009г) были выделены варианты резистентности: гипореактивный сбалансированный, гипореактивный несбалансированный и ареактивный, субкомпенсированный и декомпенсированный, каждый из которых характеризовался различными показателями уровня активности иммунитета и резервных метаболических возможностей нейтрофильных гранулоцитов. В зависимости от типа резистентности применялись различные иммуномодулирующие средства и препараты цинка [47]. Н.В. Морозова и соавт. (2010) установили неадекватный иммунный ответ на бактериальную инфекцию, выражающийся в снижении фагоцитарной активности клеток макрофагального ряда у детей с ВП в Хабаровском крае. Так, при иммунологическом исследовании установлен лимфоцитоз (60,4%) без изменений соотношения субпопуляций лимфоцитов крови, отсутствие реактивных изменений клеточного иммунитета. Отмечено снижение уровня IgM (1,68±0,25 г/л), резко снижена функциональная активность фагоцитов [79].
Характеристика клинических и лабораторных методов исследования
Клиническое обследование больных осуществлялось в соответствии с действующими медико-экономическими стандартами.
Комплексное общеклиническое обследование включало: сбор анамнеза, общий анализ крови, общий анализ мочи, общий белок, альбумин, прокальцитонин, C-реактивный белок, рентгенография органов грудной клетки, которое проводилось по общепринятым методикам.
Молекулярно-генетическое исследование полиморфизма генов проводилось с помощью тест-систем ООО НТП «Литех» (г. Москва) методом ПЦР с использованием комплекта реагентов «SNP-экспресс». Исследуемым материалом для анализа являлась цельная венозная кровь. Забор крови производился в одноразовую пластиковую пробирку с 200 мл раствора антикоагулянта (0,05М раствор ЭДТА). ДНК выделяли с использованием комплекта реагентов «SNP экспресс» из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс кровь». Выделенную ДНК замораживали и хранили при –20 С. Изучение полиморфных вариантов исследуемых генов проводили с помощью амплификации соответствующих участков генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Разделение продуктов амплификации производилось методом горизонтального элекрофореза, визуализация результатов на УФ-трансиллюминаторе. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм.
Оценка показателей энергообеспеченности иммунокомпетентных клеток крови проводилось методами цитохимическим для определения активности окислительно-восстановительных ферментов лимфоцитов, а также проточной цитометрии для регистрации процента лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий. Определение дегидрогеназ (сукцинатдегидрогеназы (СДГ), глицерофосфатдегидрогеназы (-ГФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ)) проводилось количественным методом, основанным на реакции восстановления солей тетразолия и выпадения осадка диформазана в местах активности фермента (Р.П. Нарциссов 1969) [82, 84]. Активность дегидрогеназы выражалась средним числом гранул в одной клетке.
Цитохимическое выявление активности кислой фосфатазы (КФ) лейкоцитов осуществляли методом азосочетания по A.F. Goldbergи T. Barka [172]. Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли по М.Г. Шубичу [143]. Для выявления миелопероксидазы (МП) использован метод в модификации Р.П. Нарциссова [83]. Результаты исследования активности ЩФ, КФ и МП оценивали полуколичественным методом по принципу L.S. Kaplow (1955) и выражали в условных единицах. Анализ структуры популяции клеток по активности дегидрогеназ проводили, рассчитывая коэффициенты вариации (V), асимметрии (А), эксцесса (Е).
Определение процентного содержания клеток с пониженным мембранным потенциалом митохондрий () проводилось методом проточной цитометрии (A.Mathur et al., 2000) с использованием красителя JC-1 (5,5 ,6,6 -тетрахлор-1,1 ,3,3 тетраэтилбензи-мидазолкарбоцанин йодид/ хлорид) («BD MitoScreen», США). JC-1 является катионным красителем, поглощение которого митохондриями напрямую связано с величиной митохондриального мембранного потенциала [183] так как спектральные свойства красителя в митохондриях зависят от структурно-функциональной целостности митохондриального аппарата и определяются трансмембранным электрохимическим потенциалом.
Окрашенные JC-1 клетки дважды отмывали буфером и ресуспендировали, после чего подвергали проточной цитофлуориметрии на цитометре BD FACS Calibur (США) в программе CellQuestPro.
JC-1-мономер быстро проникает через митохондриальную мембрану живой клетки, в результате чего внутри митохондрии формируются JC-1 агрегаты, характеризующиеся красным спектральным свечением ( =590 нм), которое может быть измерено на FL-2-канале проточного цитометра.
При деполяризации митохондриальной мембраны, являющейся ранним признаком апоптоза, JC-1 не накапливается внутри митохондрии и находится в цитоплазме в виде мономерной формы, которая характеризуется зеленым спектральным свечением ( = 525 нм), что измеряется на FL-1-канале.
В окрашенных JC-1 образцах определяли процентное содержание лимфоцитов в гейтах неапоптотических (FL-2-свечение, FL-1-свечение) и апоптотических (FL-1-свечение) клеток. Определение концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови проведено методом ИФА с использованием комплекта реагентов «СРБ-ИФА-Бест» (г. Новосибирск). Определение концентрации прокальцитонина в сыворотке крови проведено методом ИФА с использованием комплекта реагентов «Прокальцитонин-ИФА-БЕСТ» (г. Новосибирск). Определение биохимических парамтров общего белка и альбумина проводилось по общепринятым методикам. Хемилюминесцентное исследование (ХМЛ) проводилось на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО ДВГМУ (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ С.С.Тимошин). Диагностика проводилась совместно с д.м.н. О.А. Лебедько.
Регистрацию ХМЛ осуществляли на люминесцентном спектрофотометре LS 50B «PERKIN ELMER» по методикам Ю.А. Владимирова и соавт (1991), А.В. Арутюняна и соавт (2000), Z.Changetal (2003). Определяли:
Статистическая обработка проведена на персональном компьютере с применением пакета «Statistica» для «Windows» (версия 10) и пакет «Анализ данных» для Microsoft Excel 2007. Вычислялась средняя арифметическая, стандартное отклонение, ошибка средней величины, достоверность различий между показателями с учетом доверительной вероятности по критерию Стьюдента-Фишера. Достоверность связи изучаемых показателей и характер зависимости оценивали по коэффициенту корреляции Спирмена [41, 131]. Критическая величина уровня значимости принята равной 0,05.
Анализ роли полиморфизма генов IL-6,10,12, SOD и TNF- в развитии внебольничной пневмонии у детей различных вариантов течения
В реализации процесса программированной клеточной гибели ключевую роль играют митохондрии. Они служат мишенью для специализированных про- и антиапоптотических белков, некоторых транскрипционных факторов, низкомолекулярных медиаторов. Основным ответом митохондрии на действие апоптогенных стимулов является падение величины ее мембранного потенциала, что сопровождается высвобождением из межмембранного пространства широкого спектра биологически активных веществ (цитохрома С, апоптоз-индуцирующего фактора AIF, прокаспаз-2, -3 и -9), определяющих реализацию гибели клетки [105, 144]. Снижение мембранного потенциала митохондрий является одним из основных показателей инициации митохондриального пути запуска апоптоза [164, 179, 194].
Ключевым событием митохондриального пути апоптоза является повышение проницаемости наружной мембраны митохондрий за счет раскрытия пор мембраны. В результате стимулируется образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорилирования, увеличение содержания Са2+ в цитоплазме, истощение митохондриального пула АТФ [105].
Таким образом, изменение мембранного потенциала является признаком активации митохондриального запуска апоптоза, а также нарушения энергообразования. Митохондриальный путь запуска апоптоза реализуется путем открытия гигантских пор в мембране митохондрий с последующим поступлением проапоптогенных факторов (цитохром С, APAF-1 и др.) в цитоплазму и запуском каспазного каскада. Открытие пор на внутренней мембране митохондрий является потенциал-зависимым, «обратимым» процессом.
При анализе данных, выявлены различия увеличения процента клеток со сниженным мембранным потенциалом митоходнрий иммунокомпетентных клеток крови в зависимости от пола (рис. 3). Не смотря на то, что достоверности не было получено, во всех группах исследования процент клеток со сниженным мембранным потенциалом митохондрий лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов
у мальчиков превышал данный показатель у девочек.
Рис. 3 Содержание ИКК со сниженным мембранным потенциалом митохондрий периферической крови у детей с внебольничной пневмонией в зависимости от пола
Таким образом, при внебольничной пневмонии у детей происходит увеличение процента клеток со сниженным мембранным потенциалом митохондрий иммунокомпетентных клеток крови, что свидетельствует о снижении энергообеспечения данных клеток, а также об активации митохондриального «обратимого» пути запуска апоптоза данных клеток. Полученные данные указывает на необходимость коррекции выявленных нарушений.
3.4. Анализ процессов свободнорадикального окисления в сыворотке крови у детей с внебольничной пневмонией
Анализ ХМЛ-параметров сыворотки крови детей с внебольничной пневмонией (табл. 13) позволил зарегистрировать достоверное повышение уровня продуктов свободнорадикального окисления во всех группах исследования относительно контрольной группы. При этом регистрировалось угнетение антиоксидантной защиты сыворотки крови также во всех группах исследования.
В группе 1, в которой заболевание протекало с выраженной клинической картиной, наличием характерных воспалительных изменений в гемограмме, наличием ярко выраженной клинической картины зарегистрировано наиболее выраженное увеличение ХМЛ-парметров относительной показателей контрольной группы. Показатель генерации АКМ в целом (Ssp) превышал аналогичный в группе сравнения в 11,4 раза, показатели, свидетельствующие об интенсивности ПОЛ – концентрация гидроперикесей липидов (h), интенсивность накопления перекисных радикалов липидной природы (Sind-1) превышали значения группы сравнения в 11,5 и в 12,5 раза, соответственно. А ослабление антиоксидантной антирадикальной защиты в целом (Sind-2) и резистентность к перикисному окислению (H) превышали аналогичные значения группы сравнения в 8,2 и 13,6 раза.
В группе 2 детей показатель Ssp превышал контрольные значения в 8 раз. Интенсифицация перекисного окисления липидов была также выражена значительнее в сравнении с третьей группой детей, о чем свидетельствовало увеличение концентрации гидроперикисей липидов (h) в 8 раз, а образование перекисных радикалов липидной природы (Sind-1) – в 9,1 раза в относительно показателей группы сравнения. Ослабление антиоксидантной антирадикальной защиты также были выражены меньше, чем в группе 1. Так, показатель (Sind-2) возрос в 5,8 раза, и снижение устойчивости субстрата к перекисному окислению (H) – в 9,8 раза относительно ХМЛ параметров группы сравнении.
Таким образом, выявлено, что развитие внебольничной пневмонии у детей сопровождается повышением интенсивности АФК в целом, в том числе скорости образования перекисных радикалов, интенсификация первичного этапа пероксидации липидов на фоне угнетения антиоксидантной защиты и перекисной резистентности и свидетельствуют о нарушение баланса между генерацией и элиминацией АФК. Подобное состояние редокс-метаболизма следует расценивать как формирование системного оксидативного стресса [160, 228]. Полученные нами данные соответствуют общепринятому представлению о том, что воспаление является одним из типовых патологических процессов, сопряженных с развитием оксидативного стресса. При этом, чем выраженнее клинико лабораторные проявления заболевания, тем более интенсивнее происходит активация свободно-радикального окисления, и угнетение показателей антиоксидантной антирадикальной защиты.
Проведенный корреляционный анализ всех показателей, отражающих состояние энергообеспечения иммунокомпетентных клеток крови, показал значимые положительные взаимозависимости средней силы между показателями увеличения процента клеток со сниженным мембранным потенциалом митохондрий лимфоцитов и моноцитов (r=0,659, p 0,05), лимфоцитов и гранулоцитов (r=0,507, p 0,05), моноцитов и гранулоцитов (r=0,754, p 0,05).
При исследовании значимых корреляций у детей с внебольничной пневмонией между параметрами ферментативной активности лимфоцитов, отражающих активность окислительно-восстановительных реакций в клетке также выявлены взаимозависимости. Так активность СДГ имеет сильную положительную связь с показателями активности ЛДГ (r=0,645, p 0,05) и -ГФДГ (r=0,686, p 0,05), а также среднюю положительную связь между значениями активности ЛДГ и -ГФДГ (r=0,550, p 0,05).
Влияние Элькара на динамику показателей энергетического метаболизма ИКК у детей с внебольничной пневмонией
Хемилюминесцентный анализ процессов биогенеза АФК в сыворотке крови детей через месяц после клинико-рентгенологического выздоровления выявил, что в группе детей, получавших «стандартную терапию» в динамике сохраняются выраженные нарушения биогенеза АФК на системном уровне, несмотря на незначительную динамику показателей к улучшению. Показатель, свидетельствующий об общей генерации АФК (Ssp) хотя и снизился более, чем на 70%, но значений контрольной группы так и не достиг и достоверно превышал его в 2,2 раза (табл. 17). Интенсификация перекисного окисления липидов также оставалась на высоком уровне. Концентрация гидроперекисей липидов (h) превышала контрольные значения в 2,1 раза, интенсивность накопления перекисных радикалов липидной природы (Sind-1) – в 2,0 раза, соответственно, несмотря на то, что данные показатели снизились в десятки раз в сравнении с исходными значениями. Помимо этого, сохранялось угнетение антиоксидантной антирадикальной системы защиты сыворотки крови, показатель (Sind-2) в 1,9 раза, (H) – в 1,8 раза превышали контрольные ХМЛ-параметры. В группе детей, получавших Элькар в дополнение стандартной терапии, отмечено значительно более выраженное восстановление показателей свободнорадикального окисления и антирадикальной защиты в сравнении с показателями группы «стандартная терапия». Так, показатель интенсивности свободнорадикальных процессов (Ssp) снизился в 6,7 раз, в 7,6 раз снизилась концентрация гидроперекисей липидов (h), и в 7,2 раза снизилось образования перекисных радикалов липидной природы (Sind-1) относительно исходных показателей. Показатели же антиоксидантной защиты улучшились, об этом свидетельствовало снижение показателя (Sind-2) в 7,5 раза, а также увеличение резистнетности к перекисному окислению (H снизилась в 7,2 раза) относительно исходных показателей.
Таким образом, применение препарата Элькар у детей с внебольничной пневмонией корригирует нарушение окислительного метаболизма, в виде снижения генерации АФК в целом, в том числе скорости образования перекисных радикалов, интенсификации первичного этапа пероксидации липидов, а также улучшает активность антиоксидантной антирадикальной защиты. Клинический случай ребенка Мария М. 1год 11месяцев.
В условиях соматического отделения клиники Хабаровского филиала ДНЦ ФПД – НИИ охраны материнства и детства с 15.04.2013 по 26.04.2013г находилась на обследовании и лечении пациентка – Мария М., 1 год 11 месяцев с клиническим диагнозом: Внебольничная пневмония двусторонняя (справа в S 9,10, слева в S8), очаговая, средней степени тяжести, неуточненной этиологии.
Поступила с жалобами: на повышение температуры тела до 39,6С, частый продуктивный малоэффективный кашель, вялость, слабость, снижение аппетита
Из анамнеза: болеет 4 дня, заболевание началось остро с сухого кашля. Получала Синекод, без эффекта. На 2 день заболевания кашель стал влажный, неэффективный, повышение температуры тела до 39,6С. Получала Аугментин в течение 2-х дней, температура сохранялась на субфебрильных цифрах, кашель сохранялся. Обратились к участковому педиатру, ребенок направлен на стационарное обследования и лечения.
Anamnesis vitae: Ребенок от 25-летней здоровой женщины, от III беременности (в анамнезе 2 аборта), протекавшей без особенностей. Ребенок от I родов на сроке 39 недель, с массой тела при рождении 3450г, длиной тела 50 см. Оценка по шкале Апгар 8-9 баллов. Росла и развивалась по возрасту. Находилась на искуственном вскармливании с рождения. Переносит ОРВИ до 3 раз в год. С грудного возраста аллергия на пищевые продукты. С рождения наблюдалась у невролога по поводу ПЭП: синдрома повышенной нервно-рефлекторной возбудимости, легкой степени тяжести.
Состояние при поступлении средней степени тяжести, обусловленное симптомами интоксикации (повышение температуры тела до 39С, вялость, слабость). Телосложение правильное. Питание удовлетворительное. Тургор тканей сохранен. Кожные покровы – чистые, бледные. Слизистые оболочки ротовой полости - чистые, зев гиперемирован. Носовое дыхание свободное отделяемое слизистое скудное. Периферические лимфатические узлы не увеличены. Костно-мышечная система: без видимых деформаций. Сердечнососудистая система: пульс 120 в 1 минуту. Тоны сердца громкие, ритмичные. Система органов дыхания: ЧД 26 в 1 минуту. Перкуссия легких: легочной звук укорочение справа в нижних отделах. Аускультация легких: дыхание жесткое, ослаблено в нижних отделах справа, хрипов нет. Язык влажный, не обложен. Живот нормальной конфигурации, мягкий, безболезненный. Печень не увеличена. Селезенка не увеличена. Физиологические отправлении в норме. Физическое развитие: масса тела: 12,0 кг, длина тела: 87 см, окружность грудной клетки: 51см. В отделении проведено обследование:
1. Общий анализ крови 16.04.13: Hb - 127г/л Э – 4,571012/л Л – 10,1109/л п -1% с - 58% л - 30% м - 11% СОЭ - 4мм/ч.
2. Рентгенография ОГК от 14. 04. 2015г: Легочной рисунок усилен. Симптомы вздутия: нет. Корни усилены. Интерстициальный рисунок не изменен. Отмечается инфильтрация в S 9,10 справа и S 8 слева. Поражения плевры нет. Изменения средостения нет. Заключение: пневмония двусторонняя очаговая (S 9,10 справа и S 8 слева).
3. При исследовании активности окислительно-восстановительных ферментов лимфоцитов выявлено снижение активности СДГ в 2,6 раза, -ГФДГ в 1,1 раза отностельно группы сравнения, на фоне увеличения энзиматической активности ЛДГ в 1,1 раза, то есть наблюдалось снижение аэробного метаболизма в сторону повышения анаэробных процессов. Увеличение соотношения ЛДГ/-ГФДГ в 1,3 раза, свидетельствующее об обеспечении энергией клеток за счет компенсаторного повышения малоэффективного анаэробного пути получения энергии. Значительное повышение активности энзима ЩФ свидетельствует об активации бактериостатических механизмов.