Этиологическая роль Streptococcus pneumoniae при респираторных инфекциях, его носительство и чувствительность к антибиотикам у детей младшего возраста Лазарева Мария Александровна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Пневмококковые инфекции у детей: носительство, клинические проявления, современная профилактика .

Глава 2. Пациенты и методы исследования 34

Глава 3. Носоглоточное носительство S. pneumoniae у воспитанников детских домов, дошкольных учреждений и неорганизованных детей младше 5 лет

3.1. Микробный спектр при носоглоточном носительстве у детей в возрасте до 5 лет

3.2. Серотиповое разнообразие S. pneumoniae при носоглоточном носительстве у детей в возрасте до 5 лет

3.3. Антибиотикорезистентность исследованных штаммов pneumoniae и анализ молекулярных механизмов устойчивости к макролидам

Глава 4. Носоглоточное носительство S. pneumoniae при острых респираторных бактериальных инфекциях у детей младше 5 лет, его серотиповое разнообразие и чувствительность к антибиотикам

4.1. Роль S. Pneumoniae в структуре острых респираторных бактериальных инфекций у детей младшего возраста, госпитализированных в стационары г. Москвы в 2011-2012 гг

4.2. Практика назначения системных антибактериальных препаратов при респираторных инфекциях у детей младшего возраста

Глава 5. Чувствительность к антибиотикам, клональное и серотиповое разнообразие пневмококков у детей с острым средним отитом

5.1. Структура бактериальных возбудителей острого среднего отита у детей в возрасте до 5 лет

5.2. Серотипы и чувствительность к антибиотикам S. pneumoniae при остром среднем отите у детей в возрасте до 5 лет

5.3. Мультилокусное сиквенс-типирование (МЛСТ) штаммов пневмококка с множественной устойчивостью к антибиотикам

Глава 6. Обсуждение результатов исследования 98

Выводы 115

Практические рекомендации 117

Библиография 1

• Серотиповое разнообразие S. pneumoniae при носоглоточном носительстве у детей в возрасте до 5 лет
• Антибиотикорезистентность исследованных штаммов pneumoniae и анализ молекулярных механизмов устойчивости к макролидам
• Практика назначения системных антибактериальных препаратов при респираторных инфекциях у детей младшего возраста
• Серотипы и чувствительность к антибиотикам S. pneumoniae при остром среднем отите у детей в возрасте до 5 лет

Введение к работе

Актуальность проблемы

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, пневмококк) - наиболее распространенный возбудитель респираторных бактериальных инфекций, менингитов и бактериемии у детей (Баранов А.А. и соавт., 2008; Walker C.L. et al., 2013). S. pneumoniae является одним из микробов, обычно колонизирующих носоглотку у детей младшего возраста, что создает основной резервуар инфекции и обеспечивает ее распространение (Simell В. et al., 2012). В настоящее время описано более 90 серотипов пневмококка, различающихся структурой капсульных полисахаридов, которые определяют вирулентность и иммуногенность микроорганизма. Не все серотипы являются одинаково патогенными, и большинство пневмококковых инфекций связаны с ограниченным числом серотипов (Hausdorff W.P. et al., 2005). Тяжесть пневмококковых заболеваний также различна, в большинстве случаев S. pneumoniae вызывает мукозальные инфекции, такие как острый средний отит и острый синусит. Вместе с тем именно пневмококк чаще всего является причиной тяжелых инвазивных инфекций. По данным ВОЗ, ежегодно от пневмококковой инфекции умирают 1,6 млн. человек, из них от 700 тысяч до 1 млн. детей в возрасте до 5 лет. Эта статистика отражает, главным образом, ситуацию в тех странах, где до настоящего времени не введена вакцинация детей от пневмококковой инфекции. Ежегодная частота инвазивных пневмококковых инфекций в этих регионах варьирует от 10 до 100 случаев на 100 тысяч населения. Так, пневмококк является главной причиной острых пневмоний у детей младше 2 лет. Пневмококковые пневмония, менингит и бактериемия расцениваются как тяжелые, нередко жизнеугрожающие заболевания, представляющие серьезную проблему для здравоохранения (Баранов А. А. и соавт., 2009; Сидоренко С. В. и соавт., 2010; Reinert R. R. et al., 2010).

Точная распространенность пневмококковых инфекций, а в особенности пневмококковой бактериемии в России до настоящего времени не известна. Этиологическое подтверждение бактериальных инфекций в повседневной педиатрической практике проводится редко, врачи ориентируются на клинические признаки, что затрудняет назначение этиотропной терапии. Крайне редкие исследования крови и спинномозговой жидкости в сочетании с обычной практикой лечения антибактериальными препаратами детей с подозрением на бактериемию и менингит до каких-либо лабораторных исследований исключает возможность реально оценить частоту инвазивных пневмококковых заболеваний. Кроме того, лишь несколько лабораторий в стране могут выделить, идентифицировать и серотипировать пневмококк с высокой точностью. Таким образом, статистические данные о заболеваемости в России инвазивными пневмококковыми инфекциями в основном базируются на экспертных оценках.

Широкое и нередко необоснованное назначение антибиотиков при респираторных инфекциях у детей без учета их этиологии служит одним из основных факторов,

определяющих рост антибиотикорезистентности пневмококка. Вызывает обеспокоенность появление пневмококков с множественной устойчивостью (т.е. полирезистентностью -нечувствительностью к 3 и более группам антибиотиков), доля которых в некоторых странах достигает 30-50%. Выраженная региональная вариабельность резистентности S. pneumoniae диктует необходимость получения данных о его чувствительности к используемым антибиотикам и в России.

Цель исследования:

Определить циркулирующие серотипы пневмококков и охарактеризовать спектр их резистентности к антибиотикам у здоровых носителей и детей с острыми респираторными инфекциями в возрасте до 5 лет для улучшения эмпирической антибактериальной терапии.

Задачи исследования:

1. Сравнить частоту носительства Streptococcus pneumoniae в носоглотке у здоровых воспитанников детских домов, дошкольных учреждений и неорганизованных детей младше 5 лет.

2. Определить спектр микробного носительства при острых респираторных бактериальных инфекциях у детей (пневмонии, отиты, синуситы) и оценить вклад Streptococcus pneumoniae в этиологическую структуру.

3. Определить серотипы выделенных штаммов пневмококков и сравнить серотиповое разнообразие у различных групп обследованных детей.

4. Проанализировать бактериальную этиологию острого среднего отита у детей младшего возраста, дать характеристику клональной структуры пневмококков с множественной устойчивостью к антибиотикам, выделенных у пациентов с острым средним отитом.

5. Оценить резистентность пневмококков к различным антибиотикам, используемым в педиатрии, и провести анализ молекулярно-генетических механизмов устойчивости к макролидам.

6. На основе данных о резистентности сформулировать рекомендации по рациональной эмпирической антибиотикотерапии пневмококковых инфекций у детей.

Научная новизна:

Получены современные данные о носоглоточном носительстве S. pneumoniae у детей младшего возраста, его частота у неорганизованных здоровых детей этой возрастной группы составляет 15%, у детей, посещающих детский сад, 24%, у воспитанников детского дома 26%. В спектре бактериальной колонизации носоглотки доля S. pneumoniae составила 31% у здоровых детей и 47% у детей с острыми респираторными бактериальными инфекциями.

Анализ бактериальной этиологии острого среднего отита у детей младше 5 лет показал изменившуюся в последние годы структуру отопатогенов. В нашем исследовании была подтверждена лидирующая роль S. pneumoniae при остром среднем отите, его доля

составила 69%. Частота выделения S. pyogenes (18%) в нашем исследовании значительно превышала таковую для Н. influenzae (13%) иМ catarrhalis (9%).

В работе дана характеристика серотипового спектра циркулирующих пневмококков у детей младшего возраста. Установлено преобладание серотипов 19F, 6А и 6В, 23F, 14, которые составили > 75% распределения в разных когортах обследованных детей. Наиболее часто встречался серотип 19F, его доля в серотиповом спектре превышала 20%. У детей с острыми респираторными бактериальными инфекциями, в том числе с острым средним отитом, актуальными являются также серотипы 3 и 19А.

Получены новые данные о возросшей в последние годы устойчивости S. pneumoniae к антибиотикам. Исследования, проведенные в 2011-12 гг. и 2013-14 гг., показывают рост устойчивости штаммов S. pneumoniae к пенициллину с 37% до 48%, к триметоприму/сульфаметоксазолу с 52% до 60%. Резистентность пневмококка к клиндамицину не изменилась, оставаясь на уровне 31-32% в последние годы. Множественная устойчивость пневмококка выросла с 25% в 2012 г. до 37% в 2014 г. При этом актуальные штаммы S. pneumoniae сохраняют высокую чувствительность к амоксициллину.

Уровень резистентности циркулирующих штаммов S. pneumoniae к макролидным антибиотикам превышает 30%, а в группе здоровых носителей он достигает 40% к 14- и 15-членным макролидам (эритромицин, азитромицин, кларитромицин) и 31% к 16-членному макролиду спирамицину, что позволяет считать нецелесообразным их применение при пневмококковых инфекциях.

Представлены данные об изменении механизмов резистентности S. pneumoniae к макролидам. Показано возрастание до 52% доли эритромицин-резистентных штаммов S. pneumoniae с наличием ermB-геиа в качестве одной детерминанты и до 35% - в ассоциации с дае/-зависимым эффлюксом. Полученные данные позволяют констатировать, что в последние годы в России значительно увеличилось число штаммов, имеющих сразу два механизма резистентности к макролидам; этот фенотип связан с генетическими элементами клональных комплексов наиболее резистентных пневмококков.

Описанные в работе изоляты пневмококка с множественной устойчивостью принадлежали к ограниченному числу клональных линий, которые не были описаны в России ранее. Анализ клональной структуры пневмококков показал преобладание изолятов, относящихся к клональному комплексу СС320. Штамм пневмококка серотипа 19А с ST320, обнаруженный в ходе настоящей работы, является первым пневмококком такого рода, выявленным в нашей стране.

Практическая значимость:

Полученные в настоящем исследовании данные о чувствительности к антибиотикам, серотиповом составе изолятов пневмококка у детей младшего возраста могут быть использованы для мониторирования изменений сероэпидемиологии, сиквенс-типов и резистентности S. pneumoniae после начала массовой вакцинации от пневмококковой инфекции, включенной в российский календарь иммунизации в 2014г.

Представленные данные об актуальных серотипах ^.pneumoniae позволяют прогнозировать эффективность вакцинации от пневмококковых инфекций после начала массовой иммунизации детского населения. Результаты наших исследований показывают совпадение спектра циркулирующих серотипов на 63,5 - 81% для 7-ми валентной пневмококковой конъюгированной вакцины (ПКВ7) и ПКВ 10 и на 86 - 93% для ПКВ 13 в различных когортах детей младшего возраста.

Установленные в работе сероэпидемиология и молекулярно-генетические характеристики S. pneumoniae обосновывают использование ПКВ с расширенным охватом серотипов, включая серотип 19А, даже несмотря на относительно небольшую долю этого серотипа среди циркулирующих штаммов пневмококков.

На основании полученных в исследовании новых данных об устойчивости S. pneumoniae к антибиотикам могут быть сформулированы рекомендации по антибактериальной терапии пневмококковых инфекций. Сохраняющаяся высокая чувствительность S. pneumoniae к амоксициллину (> 90%) позволяет рекомендовать его препаратом первого выбора при острых бактериальных инфекциях пневмококковой этиологии у детей.

Повышение уровня резистентности исследованных штаммов пневмококка к макролидным антибиотикам до 40% свидетельствует о нецелесообразности рутинного использования любых макролидов для лечения пневмококковых инфекций. Устойчивость S. pneumoniae к 14- и 15-членным макролидам (эритромицин, азитромицин, кларитромицин) не различается, резистентность к 16-членным макролидам (спирамицин), согласно результатам нашего исследования, также превышает 30%, что обусловлено едиными для всех антибиотиков этой группы механизмами устойчивости.

Представленные данные о бактериальной этиологии острого среднего отита у детей и чувствительности выявленных отопатогенов к антибиотикам позволяют рекомендовать для лечения амоксициллин±клавуланат в качестве препарата первого выбора.

Апробация работы

Основные положения и результаты исследования были представлены в виде докладов и обсуждены на XV, XVI, XVII, XVIII и XIX Конгрессах педиатров России (Москва, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015 гг.); на научно-практической конференции Союза педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Казань, 2011 г.); на Международном Конгрессе

«Europediatrics-2013» (Глазго, 2013 г.); на съезде детских инфекционистов (Санкт-Петербург, 2012 г.); на Конгрессе Европейского общества детских инфекционистов ESPID (Салоники. 2012 г.), на Конгрессах Европейского общества клинической микробиологии и инфекционных болезней ЕССМШ (Барселона, 2014 г., Копенгаген, 2015 г.) на научно-практических конференциях педиатров (Рязань, 2014 г., Хабаровск, 2014 г, Ростов-на-Дону, 2015 г.).

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Серотиповое разнообразие S. pneumoniae при носоглоточном носительстве у детей в возрасте до 5 лет

Серотипы S. pneumoniae различаются по своему инвазивному потенциалу, а также могут ассоциироваться с теми или иными клиническими формами инфекции. После начала вакцинации ПКВ7 резко возросла частота выявления серотипа 19А у пациентов с ОСО [48,49]. Серотипы З, ПА и нетипируемые пневмококки ассоциируются с острым конъюнктивитом [50]. Серотипами с низким инвазивным потенциалом признаны 1, 5 и 7F, они обычно выявляются при инфекциях у молодых здоровых взрослых, уровень смертности при этом очень низок. Серотипы со средним и высоким инвазивным потенциалом чаще обнаруживаются у пожилых с сопутствующей соматической патологией [51,52]. Такие серотипы как 3, 6А, 6В, 9V, 14, 19А и 23F 19F и 23F часто являются причиной острого среднего отита (ОСО) у маленьких детей в всем мире [53].

Мета-анализ всех случаев летальных исходов от пневмококковых инфекций показал, что с наиболее низким уровнем смертности ассоциируются серотипы 1, 7F и 8, а с наиболее высоким - серотипы 3, 6А, 6В, 9N и 19F [54]. В когортном исследовании, проведенном в Дании в период 1977-2007 гг., наиболее высокий уровень смертности от ИЛИ обусловливали серотипы З, 10А, ПА, 15В, 16F, 17F, 19F, 31 и 35F (при сравнении с серотипом 1, р 0/001) [55]. Van Hoek и соавт. изучали все случаи летальных исходов ИЛИ в Англии с апреля 2002 по март 2011, оценивая при этом серотип возбудителя и возраст пациента (группы 5 лет, 5-64 года и 65 лет) [56]. Среди детей младше 5 лет общий уровень смертности был низким (3%), максимальный риск неблагоприятного исхода определяли серотипы 6А (7%), 19F (5%), 9V (5%) и 3 (5%). В возрастной группе от 5 до 64 лет доля смертельных исходов составила 10%: 33% при серотипе 31, 30% - при 11А и 21% -при 19F, а самый низкий уровень смертности ассоциировался с серотипами 1, 7F и 8 (3%, 4%, и 6%, соответственно). Максимальная смертность была выявлена среди пожилых (группа пациентов 65 лет), она составила 30%; серотипы 19F (41%), 31 (40%) и 3 (39%) были ассоциированы с наибольшей частотой летальных исходов, а с наименьшей - серотипы 1(17%), 7F (20%) и 12F (21%) [56]. S. pneumoniae - наиболее частый возбудитель внебольничной пневмонии у детей и взрослых [57,58]. В то время как до 60-80% случаев пневмококковой пневмонии являются небактериемическими (мукозальными), пневмонии с бактериемией протекает особенно тяжело [57,59,60]. Различные серотипы пневмококка при этом также обладают разной вирулентностью. Введение нескольких колониеобразующих единиц (КОЕ) серотипов 2 и 3 мышам приводит к бактериемии и смерти, в то время как серотип 19 способен вызвать бактериемию только при введении нескольких десятков КОЕ [61].

Согласно недавно проведенному мета-анализу, серотип пневмококка 14 является наиболее распространенным этиологическим фактором внебольничной пневмонии в странах Южной Америки и Карибского бассейна, за ним следуют серотипы 1 и 5 [62]. В период после введения вакцинации ПКВ7 стали доминировать серотипы 1, 19А и 3. Доля серотипа 14 в структуре внебольничной пневмонии после введения вакцины ПКВ7 снизилась до 5% [60,63]. Burgos и соавт., однако, сообщают, что среди взрослого населения Испании серотип 14 все еще является лидирующим этиологическим фактором пневмококковой пневмонии, даже поле введения ПКВ7 [64]. Схожие результаты были получены Bewick et al. в Великобритании, где наиболее часто выявляемыми серотипами при внебольничной пневмонии были 14, 1, 8, 3 и 19А, а серотипы 19А, 3 и 6А/С были лидирующими инвазивными штаммами [65]. Авторы заключили, что при проведении когортных исследований только бактериемических случаев пневмонии роль 14 серотипа может оказаться недооценена. Расширение спектра вакцинных серотипов приведет к изменению результатов эпидемиологических исследований.

Во все мире менингит, вызванный S. pneumoniae, становится причиной около 60 тыс смертей и инвалидизации детей 5 лет ежегодно [66]. Распространённость пневмококкового менингита наиболее высока среди детей младше 1 года. Согласно мониторингу, проведенному в Уганде, среди детей младше 5 лет наиболее распространенным серотипом при менингите является 6А/6В (40%), за которым следуют 22А, 23F, 14 и 19А [67]. Ранее серотипы 1, 3 и 5 редко являлись возбудителями менингита [17], однако в недавних исследованиях было отмечено, что 60-80% пневмококковых менингитов в странах так называемого Африканского менингитного пояса вызваны серотипом 1, причем уровень смертности при таком менингите выше, чем при менингококковом [68]. В отличие от США и Европы, где наблюдаются различия в серотиповом преобладании среди детей и взрослых, в Африканских странах менингит, обусловленный серотипом 1, доминирует как среди детей старшего школьного возраста, так и среди взрослых, ассоциируясь с высоким уровнем смертности. Такие различия обусловлены скорее происхождением серотипа 1 в этой зоне, нежели характеристиками самого серотипа [69]. При помощи метода МЛСТ (мультиклонального сиквенс-типирования) было обнаружено три генетических варианта серотипа 1, каждый из которых географически обособлен. Людям, собирающимся посетить страны Африканского менингитного пояса, рекомендуется в дополнение к менингококковой вакцинации проведение вакцинации ПКВ13.

В США серотиповое разнообразие штаммов, вызывающих пневмококковый менингит, претерпело значительные изменения после введения ПКВ7. При сравнении сообщений 1998-1999 гг. и 2004-2005 гг. можно отметить значительное снижение частоты менингита, обусловленного вакцинными серотипами (с 59% до 23%, рО.001) [70]. При снижении общей заболеваемости пневмококковым менингитом выросла частота менингитов, вызванных не входящими в ПКВ7 серотипами пневмококка: с 28% до 65%, с преимущественным преобладанием серотипов 19А и 22F [70].

В Российской Федерации обязательной регистрации подлежат только случаи менингококковой инфекции. В период с 2003 по 2007 гг. в Москве и Санкт-Петербурге на пневмококковые менингиты приходилось от 3,7% до 27,7% всех бактериальных менингитов. Однако заболеваемость пневмококковыми менингитами в РФ в различных возрастных группах изучена недостаточно [71].

Острый средний отит (ОСО) — наиболее распространенная бактериальная инфекция в мире, особенно часто возникающая у детей в возрасте до 2 лет, а также основная причина назначения антибактериальной терапии и проведения тимпаноцентеза у детей. Каждый год острым средним отитом заболевают 709 млн человек, из них 51% — дети в возрасте до 5 лет. Ухудшение функции слуха, связанное с перенесенным острым средним отитом, встречается с частотой 30,8 на 10 тыс. человек [72]. Около 80-90% детей к возрасту 3 лет переносят как минимум один эпизод ОСО [73-75]. В США на долю ОСО приходится наибольшее число рецептов на антибиотики для детей. В Москве заболеваемость ОСО составляет примерно 6 тыс случаев на 100 тыс детского населения в год [76]. Основными бактериальными отопатогенами считают S. pneumoniae и нетипируемую Н. influenzae, на долю которых приходится до 60-80% микробиологически подтвержденных случаев ОСО [53,77].

Многие авторы отмечают взаимосвязь между уровнем заболеваемости и тяжестью течения острых респираторных заболеваний (ОРЗ) с инфицированием S. pneumoniae. Kouni и соавт. исследовали 611 детей с ОРЗ и заключили, что предшествующая пневмококковая вакцинация снижает вероятность госпитализации таких пациентов [78]. Klugman и соавт. отметили выраженную корреляцию между инфицированием вируса гриппа А и риском развития ИЛИ [79]. Коинфекция указанными патогенами приводила к развитию тяжелой, жизнеугрожающей пневмонии. В пандемии гриппа 1918 года большинство смертей были вызваны вторичной пневмонией, причем пневмококк был самым распространенным коинфицирующим патогеном [79]. Во время пандемии H1N1 в 2009 пневмококк был самым распространенным агентом коинфекции, выделявшимся у пациентов, погибших от H1N1-инфекции.

Антибиотикорезистентность исследованных штаммов pneumoniae и анализ молекулярных механизмов устойчивости к макролидам

Микробиологические методы исследования Для микробиологического анализа использовали расходные материалы и оборудование производства BioMerieux (Франция). Посев биоматериала производили на питательный агар (Columbia, Bio-Rad, Франция) с добавлением 3% донорской эритроцитарной массы крови человека и 3% лошадиной сыворотки, а также на «шоколадный» агар, содержащий 10 мкг/мл НАД, который добавляли в предварительно охлажденную до 50-60С среду. Посевы инкубировали в термостате с повышенным содержанием СО2 (5%) при температуре 37С в течение 24 - 48 ч.

Значимыми условно-патогенными бактериями считали S. pneumoniae, Н. influenzae, S. pyogenes, М. catarrhalis и S. aureus [14,151,152]. Идентификацию пневмококка проводили на основании морфологических и культуральных свойств, а также с помощью теста с оптохином и реакции латекс-агглютинации (Slidex Pneumo-Kit, BioMerieux, Франция). Пневмококковые изоляты хранили в бульоне (Nutrient Broth, HiMedia, Индия) с добавлением 17% глицерина при - 80С.

Выделенные культуры Н. influenzae идентифицировали на основании изучения морфологии, культуральных свойств, потребности в факторах роста X и V в системе API NH. Бета-гемолитические стрептококки (S. pyogenes) дифференцировали по чувствительности к бацитрацину (Bacitracin, HiMedia, Индия) и методом латекс-агглютинации с реагентом Slidex Strepto Kit (BioMerieux, Франция). M. catarrhalis идентифицировали на основе окраски по Граму, положительной оксидазной реакции и характерного протеомного профиля, который определяли с помощью MALDIOF масс-спектрометра (Bruker Daltonics, Bremen, Germany; MALDI Biotyper).

Серологическое типирование S. pneumoniae проводили в реакции латексной агглютинации и/или реакции набухания капсулы по Нейфельду. Для этого использовали набор «ImmuLex Pneumotest kit» (Statens Serum Institut, Дания). Реакцию набухания капсулы определяли с помощью фазовоконтрастной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Нетипируемыми считали изоляты пневмококка, которые не агглютинировались ни одной из пуловых сывороток (пулы A-I и Р-Т).

Определение чувствительности к антибиотикам Для определения чувствительности пневмококка к оксациллину, эритромицину, клиндамицину и триметоприму/сульфаметоксазолу (ТМП/СМЗ) использовали диско-диффузионный метод (диски Bio-Rad, США) на среде Мюллера-Хинтон с добавлением 5% крови человека. Результаты интерпретировали согласно рекомендациям МУК 4.2. 1890 - 04 [153]. Чувствительными считали штаммы с диаметром зоны подавления роста 20 мм для диска с оксациллином, 21 мм для эритромицина, 19 для клиндамицина и триметоприма/сульфаметоксазола. Для штаммов S. pneumoniae определяли минимальную подавляющую концентрацию (МІЖ) пенициллина и амоксициллина методом Е-теста. Чувствительными считали изоляты с МІЖ 0,6 мкг/мл, нечувствительными к пенициллину - штаммы с МГЖ 0,06 мкг/мл. Результаты интерпретировали согласно обновленным рекомендациям EUCAST (2013 г.) [154].

Молекулярно-генетические методы Молекулярное серотипирование пневмококков проводили с помощью мультиплексной ПЦР (М-ПЦР). Для этого использовали праймеры для следующих серотипов/серогрупп: 1, 3, 4, 5, 6А/В, 7F, 7С, 8, 9V, 10А, ПА, 12F, 14, 15А, 15В/С, 16F, 17F, Sgl8, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 31, 33F, 34, 35F, 38 (Pai R., 2006). Разделение и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле. Экстракцию ДНК из образцов ЖСУ проводили с помощью набора QIAamp DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Izasa, Барселона, Испания) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. В ЖСУ проводили поиск генетического материала четырех этиологически значимых отопатогенов (S. pneumoniae, S. pyogenes, Н. influenzae и М. catarrhalis) с помощью ПНР в реальном времени.

Выделение ДНК из чистой культуры S. pneumoniae и детекцию генов резистентности к макролидам егтВ и mef у эритромицин-резистентных пневмококков проводили при помощи ПНР с использованием праймеров, предложенных Reinert R. et al (2008).

Мультилокусное сиквенс-типирование Мультилокусное сиквенс-типирование (МЛСТ) пневмококков с множественной устойчивостью к антибиотикам (т.е. устойчивостью к 3 или 4 исследованным антибиотикам) проводили согласно протоколу [155]. Внутренние фрагменты генов aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt и ddl амплифицировали путем ПЦР с помощью описанных праймеров, а затем полученные ампликоны секвенировали. Аллели и сиквенс-типы (ST) определяли с помощью программного обеспечения на web-странице пневмококка [156]. Сиквенс-типы анализировали и относили к клональным комплексам после их сравнения со всеми сиквенс-типами, имеющимися в онлайн-базе данных, используя программу eBURST [156]. Сиквенс-типы, имеющие 6 одинаковых аллельных вариантов из 7 исследованных локусов относили к одному клональному комплексу.

У законных представителей всех включенных в исследование пациентов было получено информированное подписанное согласие на проведение диагностических и лечебных процедур при госпитализации в стационар или амбулаторном визите к врачу в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации.

Статистическую обработку данных осуществляли при помощи программы SPSS 20.0 (SPSS Statistics, США). Для сравнения распределения патогенов и серотипов S. pneumoniae использовали таблицы сопряженности, критерий х2 или точный тест Фишера. Для сравнения долей использовали Z-критерий. Различия считали статистически значимыми при/? 0,05.

Вероятность определения этиологии ОСО по результатам микробиологического исследования носоглоточного мазка оценивали с помощью расчета посттестовых шансов (Посттест-Ш) высева в ЖСУ и носоглотке идентичного патогена [157,158]. Для каждого возбудителя составляли таблицу сопряженности и в столбцы вносили результаты посева ЖСУ (референсное исследование, «золотой стандарт»), а в строки - результаты посева носоглоточного материала (индексный тест). Затем рассчитывали отношение правдоподобия (ОП) как отношение вероятности высева патогена в ЖСУ (доля истинноположительных результатов) к вероятности высева этого же патогена только в носоглотке при его отсутствии в ЖСУ (доля ложноположительных результатов). Полученное значение ОП использовали для определения Посттест-Ш совпадения результатов посева ЖСУ и материала из носоглотки по формуле: Посттест-Ш = претестовые шансы (Претест-Ш) х ОП. Претест-Ш рассчитывали, исходя из претестовой вероятности, т.е. доли конкретного патогена в этиологической структуре ОСО с учетом отрицательных культуральных результатов по формуле: Претест-Ш = претестовая вероятность / (1 - претестовая вероятность). Посттест-Ш конвертировали в посттестовую вероятность по формуле: посттестовая вероятность = Посттест-Ш х (1 + Посттест-Ш).

Практика назначения системных антибактериальных препаратов при респираторных инфекциях у детей младшего возраста

Чувствительность к антибиотикам была протестирована у 67 штаммов S. pneumoniae. В панель исследованных антибиотиков вошли бета-лактамы (оксациллин, пенициллин, амоксициллин), макролиды (эритромицин, азитромицин, кларитромицин, спирамицин), клиндамицин и триметоприм/сульфаметоксазол (ТМП/СМЗ). Резистентность исследуемых штаммов пневмококка к различным группам антибиотиков варьировала от 31% до 60%. Наибольшая устойчивость была отмечена к ТМП/СМЗ (табл. 3.5).

Общую чувствительность к бета-лактамам оценивали путем тестирования чувствительности к оксациллину с помощью диско-диффузионного метода. Резистентностью к оксациллину обладали 48% (32/67) изолятов пневмококка. Последующий анализ с использованием Е-теста показал, что все оксациллин-резистентные пневмококки были нечувствительны к пенициллину (МПК 0,06 мкг/мл) (см. табл. 3.5), т.е. доля нечувствительных к пенициллину штаммов также составила 48%. МПК пенициллина 2 мкг/мл наблюдалась у 7% (5/67) штаммов.

МПК амоксициллина была определена для всех 32 оксациллин-резистентных изолятов. У 60%( 19/32) штаммов МПК амоксициллина составила 0,5 мкг/мл, у 2 штаммов МПК была 1 мкг/мл, у 5 изолятов- 2 мкг/мл. При этом сниженной чувствительностью/резистентностью к амоксициллину (МПК 2 мкг/мл) обладали 6 изолятов (9%), 4 из которых относились к серотипу 19F, 1 изолят - к серотипу 14, и серотип еще одного штамма был неизвестен.

Уровень резистентности исследованных штаммов пневмококка к макролидным антибиотикам достигал 40% (см. табл. 3.5). Для 14- и 15-членных макролидов (эритромицин, азитромицин, кларитромицин) он не различался, что было обусловлено едиными для всех антибиотиков этой группы механизмами антимикробной устойчивости (см. ниже). Обращает внимание, что резистентность к 16-членному макролиду спирамицину, согласно результатам нашего исследования, также превышает 30%, что свидетельствует о нецелесообразности рутинного использования любых макролидов для лечения пневмококковых инфекций.

Примечание. PEN - пенициллин; АМО - амоксициллин; ERY - эритромицин; AZI - азитромицин, CLA - кларитромицин, SPI - спирамицин, TMP/SMX - триметоприм/сульфаметоксазол, CLI -клиндамицин, МУ - множественная устойчивость (устойчивость к 3 или более группам антибиотиков). Прочие серотипы (п=18): 23А, ПА, 8, 35F, 16F (по 1 каждого), а также нетипированные. МПК к пенициллину была исследована у всех оксациллин-резистентных штаммов (п=32), для всех МПК пенициллина составила 0,06 мкг/мл. МПК амоксициллина у 6 оксациллин-резистентных штаммов составила 2 мкг/мл.

Для уточнения механизмов резистентности к макролидам у 23 из 27 макролид-резистентных изолятов при помощи ПЦР было проведено исследование генов егт(В) и mef (табл. 3.6). Основным молекулярным механизмом, обусловливающим резистентность к макролидам за счет модификации (метилирования) мишени и невозможности связывания антибиотика с рибосомой, является наличие у пневмококка гена егт(В). Носителями гена егт(В) были более 90% (21/23) эритромицин-резистентных штаммов, что определяло их конститутивный MLSB-фенотип, т.е. одновременную устойчивость ко всем макролидам, линкозамидам, стрептограмину В (табл. 3.6).

Набольшая устойчивость к антибиотикам была свойственна штаммам, относившимся к серотипу 19F. Уровень нечувствительности пневмококков этого серотипа к пенициллину превышал 85% (13/15), к ТМП/СМЗ - 80% (12/15), а к макролидам и клиндамицину составил 60% (9/15). Более 80% пневмококков серотипа 14 были нечувствительными к пенициллину, макролидам, клиндамицину и ТМП/СМЗ. Выявленный в нашем исследовании сравнительно высокий уровень нечувствительности к амоксициллину обусловили изоляты, относящиеся к двум серотипам: 19F и 14. К высокорезистентным следует отнести также пневмококки серотипа 6В, устойчивость к макролидам выявлена у 7/11 (64%), а к клиндамицину - у 6/11 (55%) штаммов, относившихся к этому серотипу.

Следует отметить, что наибольшая резистентность отмечена у пневмококков вакцинных серотипов (входящих в состав как ПКВ13, так и в состав ПКВ10): 19F, 23F, 14, 6В, 6А. Все штаммы серотипа 3 и серотипа 9V в нашем исследовании сохраняли чувствительность ко всем тестированным антибиотикам.

Среди исследованных штаммов пневмококка множественной устойчивостью (т.е. устойчивостью к 3 и более классам антибиотиков) обладали 37% (25/67) изолятов. Штаммы с множественной устойчивостью к антибиотикам относились к серотипам 19F, 14, 6В, 23F. Необходимо отметить, что все изоляты с высокой МІЖ к пенициллину ( 1 мкг/мл) и амоксициллину ( 1 мкг/мл) обладали множественной устойчивостью к антибиотикам.

Пневмококки с множественной устойчивостью в 2 раза чаще выявлялись у детей из закрытых или полузакрытых детских коллективов (по 50% в каждой группе) по сравнению с неорганизованными детьми (25%) (рис. 3.5).

Вместе с тем не выявлено связи носоглоточного носительства штаммов с множественной устойчивостью у детей с недавней предшествующей антибиотикотерапией. Множественная устойчивость пневмококков выявлена у 3 из 11 детей, получавших антибиотики, и у 9 из 26 детей, не получавших их.

Таким образом, проведенный анализ серотипового разнообразия S. pneumoniae при носоглоточном носительстве позволил определить спектр циркулирующих пневмококков в детской популяции, он сохраняет стабильность в нашей стране в последние десятилетия.

В результате нашего исследования получены тревожные данные о значительном росте устойчивости циркулирующих серотипов pneumoniae к антибиотикам, что, вероятно, связано с распространенной клинической практикой антибактериальной терапии.

У детей из закрытых и полузакрытых детских коллективов пневмококки с множественной устойчивостью к антибиотикам выявлялись в два раза чаще, чем у неорганизованных детей. У детей из детского дома было выявлено всего два серотипа пневмококка (19F и 23F), все они были полирезистентными. В данном случае высока вероятность, что это эффект обмена патогенами между воспитанниками в закрытом коллективе.

Серотипы и чувствительность к антибиотикам S. pneumoniae при остром среднем отите у детей в возрасте до 5 лет

Несмотря на разнообразие капсульных типов пневмококка (их описано более 90), антибиотикорезистентность не распределяется равномерно среди всех серотипов. Резистентные пневмококки принадлежат к ограниченному числу клонов (или клональных линий), которые включают лишь несколько серотипов. С другой стороны, отдельный серотип может быть представлен в составе разных клонов, не являющихся родственными и отличающихся по степени резистентности [182,186,187]. Семивалентная пневмококковая конъюгированная вакцина (ПКВ-7) оказала выраженный эффект на сероэпидемиологию пневмококка, практически прекратив циркуляцию вакцинных серотипов и существенно снизив заболеваемость пневмококковыми инфекциями, в том числе ОСО, в тех странах, где она применяется [53,188,189]. Вместе с тем, в последние годы стали появляться сообщения о распространении в поствакцинальный период резистентных не-ПКВ-7 серотипов, в первую очередь серотипа 19А, принадлежащего к клональному комплексу (clonal complex, СС) 320 [136,188,190]. Этот феномен замещения серотипов может реализовываться через механизм переключения капсулы и экспансии резистентных генотипов, существовавших до внедрения ПКВ [90,187,191]. В связи с этим выявление и молекулярная характеристика клонального разнообразия устойчивых к антибиотикам пневмококков представляется более перспективным подходом для прогнозирования эволюции и распространения резистентности, чем простое серотипирование отдельных штаммов.

Выявленные штаммы пневмококков с множественной устойчивостью к антибиотикам (п = 32) генотипировали с помощью МЛСТ. Клональная структура этих штаммов с указанием серотипа и профиля резистентности представлена в таблице 5.5. Всего было обнаружено 13 известных сиквенс-типов, принадлежащих к 8 клональным комплексам, а также 3 новых сиквенс-типа, имеющих связь с СС320, и 1 синглетон (генотип-«одиночка», не принадлежащий ни к одному из известных клональных комплексов).

Индупибельная резистентность (І-MLSB фенотип). В нашей выборке преобладали представители СС320 (31%, 10/32). Они включали 3 изолята с ST320, 6 однолокусных вариантов (single locus variant, SLV) и 1 двулокусный вариант (double locus variant, DLV) этого сиквенс-типа. Примечательно, что 5 из 6 SLV обладали идентичным вариантом последовательности локуса dll и принадлежали к единственному новому сиквенс-типу, который ранее не бал описан в базе данных PMEN (табл. 5.5). Большинство изолятов СС320 имели серотип 19F (8/10), а 2 из 10 изолятов - серотип 19А. Все СС320-пневмококки характеризовались высокими МІЖ пенициллина и амоксициллина ( 1 мкг/мл). Кроме того, 9/10 этих штаммов являлись носителями комбинации детерминант устойчивости к макролидам егтВ и те/ что обуславливало их МЬБв-фенотип. Один штамм (DLV ST320) был носителем гена те/и сохранял чувствительность к клиндамицину (табл. 5.5). Изолят-синглетон с серотипом 19F демонстрировал высокую МІЖ пенициллина (4 мкг/мл) и имел обе детерминанты резистентности к макролидам.

Оставшиеся изоляты серогруппы 19 (n = 8) принадлежали к 4 различным клональным комплексам, включая СС236 (п = 3), СС193 (п = 2), СС230 (n = 2) и СС156 (п = 1). В этой группе МІЖ к пенициллину отличалась сравнительно низким уровнем (все МІЖ 0,5 мкг/мл, за исключением 1 штамма из СС156 с МІЖ пенициллина 1 мкг/мл), а 3/8 изолятов обладали единственной детерминантой резистентности к макролидам (у 2 был ген егтВ, у 1 - ген те/).

Клональный комплекс СС156 (клон Spain9V-3) был представлен пневмококками ST790 и ST865 (п=3 каждый). Большинство (5/6) этих изолятов относилось к серотипу 14 и было носителем егтВ как единственной детерминанты резистентности к макролидам, а один изолят обладал индуцибельным MLSB-фенотипом. Оставшийся СС156-изолят с ST790 обладал капсулой 19А и двойным механизмом резистентности к макролидам. Все пневмококки СС156 демонстрировали высокую МІЖ пенициллина ( 1 мкг/мл). Один штамм с серотипом 14 имел ST15 и относился к СС15 (см. табл. 5.5).

Клональный комплекс СС315 был представлен 6 изолятами (все с серотипом 6В) и 3 сиквенс-типами, которые включали ST315 (п = 4), ST1032 и ST386 (n = 1 каждый). Лишь один штамм имел высокую МІЖ пенициллина (1 мкг/мл), но был чувствителен к триметоприму/сульфаметоксазолу. Остальные были чувствительны к пенициллину или обладали невысоким уровнем МІЖ.

Один изолят с множественной устойчивостью с серотипом 23F имел ST81 и представлял СС81 (см. табл. 5.5).

Таким образом, анализ клональной структуры пневмококков с множественной устойчивостью к антибиотикам показал преобладание изолятов, относящихся к СС320. Этому клональному комплексу принадлежало большинство пневмококков с высокими МГЖ пенициллина и амоксициллина. В нашей выборке генотипированных пневмококков мы также наблюдали перечисленные клональные комплексы, однако они встречались гораздо реже. Десять из 32 пневмококков с множественной устойчивостью принадлежали к СС320, из них 3 изолята имели ST320, а у 7 изолятов были обнаружены новые сиквенс-варианты ST320. Отметим, что 6 из 7 этих пневмококков отличались от ST320 по последовательности локуса dll, причем 5 из них обладали идентичной новой последовательностью dll аллеля. Дивергентные последовательности по локусу dll ассоциируются со структурными вариантами пенициллинсвязывающего белка 2Ь, вызывающими резистентность к пенициллину. До настоящего времени в PMEN не было депонировано ни одного изолята из России с сиквенс-типом ST320, т.е. штамм пневмококка серотипа 19А с ST320, обнаруженный в ходе настоящей работы, является первым пневмококком такого рода, выявленным в нашей стране.