Формирование предрасположенности к аллергии у детей при хронической плацентарной недостаточности Ильчукова Ольга Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Частота и возраста характер аллергических заболеваний у детей раннего

1.2. Современные представления о факторах риска и механизмах развития аллергических реакций у детей раннего возраста 14 - 18

1.3. Развитие системы иммунитета в раннем онтогенезе и ее особенности у новорожденных детей, перенесших хроническую гипоксию 18 - 28

1.4. Хроническая плацентарная недостаточность и её влияние на развитие системы иммунитета у плода и новорожденного ребенка 28 - 34

Глава II. Материалы и методы исследований

2.1. Характеристика детей порядок

обследования новорожденных 35

2.2. Методы исследований - 41

2.2.2. Иммуногистохимический метод определения маркера дендритных клеток (CD83) и эндотелиальной молекулы адгезии (CD31) в плаценте 38

2.2.3. Иммуноморфологический метод определения фракции СЗ компонента комплемента, фибриногена, иммуноглобулинов (А, М, G) и провоспалительных цитокинов (IL-4, IL-6, IL-10) в плаценте 38

2.2.4. Определение полиморфизма генов детоксикации (глутатион S-трансфераз МІ, ТІ и PI), генов NO-синтаз (нейрональной (nNOS) и эндотелиальной (eNOS)) в плаценте 39

2.2.5. Определение уровня общего IgE в пуповинной крови

2.3. Методы статистической обработки материала 40 - 41

Глава III. Особенности состояния здоровья матерей при осложнении беременности хронической плацентарной недостаточностью, клиническое состояние их детей в раннем неонатальном периоде и частота пищевой сенсибилизации на первом году жизни 44 - 55

Глава IV. Полиморфизм генов системы детоксикации и генов no-синтаз в плацентах при хронической плацентарной недостаточности 56 - 67

Глава V. Особенности иммунологического состояния плаценты и уровень общего ige в крови из вены пуповины новорожденных детей при наличии хронической плацентарной недостаточности 68 - 75

Глава VI. Эффективность использования гипоаллергенной смеси для первичной профилактики пищевой сенсибилизации у детей на первом году жизни при смешанном и/или искусственном вскармливании - 82

Глава VII. Обсуждение полученных результатов исследовании 83 - 94

Выводы 95 - 96

Практические рекомендации 97

Список сокращении 98

Указатель литератур

• Современные представления о факторах риска и механизмах развития аллергических реакций у детей раннего возраста
• Развитие системы иммунитета в раннем онтогенезе и ее особенности у новорожденных детей, перенесших хроническую гипоксию
• Иммуноморфологический метод определения фракции СЗ компонента комплемента, фибриногена, иммуноглобулинов (А, М, G) и провоспалительных цитокинов (IL-4, IL-6, IL-10) в плаценте
• Полиморфизм генов системы детоксикации и генов no-синтаз в плацентах при хронической плацентарной недостаточности

Введение к работе

Актуальность проблемы. С 60-х годов ХХ столетия как в развитых, так и в развивающихся странах, особенно в странах восточной Европы, отмечается рост распространнности аллергических болезней, что рассматривается как «эпидемия XXI века» (Ревякина В.А., 2009; Балаболкин И.И., 2010). Особую тревогу вызывает увеличение в детской популяции частоты таких заболеваний как пищевая аллергия, атопический дерматит, аллергический ринит, бронхиальная астма (Коростовцев Д.С., Макарова И.В., 2001; Новик Г. А., 2013; , 2008; Santos A.F, Lack G., 2012; Kawamoto N., 2012). Так, одно или больше аллергических заболеваний зарегистрировано в Германии у 45%, в Австрии у 40%, в Греции и Японии у 35%, в Дании и Нидерландах у 30%, в США у 20-40%, в России у 21% детей (WAO, 2013).Частота пищевой аллергии в Европе по результатам письменного опроса составляет около 35% (Rona R.J., 2007).

Началом «аллергического марша», который может приводить к тяжелым анафилактическим реакциям, развитию атопическог дерматита и бронхиальной астмы, является пищевая сенсибилизация (ПС), возникающая у 15-25% детей уже в первые месяцы жизни (Боровик, Т.Э., 2005; Охотникова Е.А., 2008; Фдорова О. С., 2009; Dutau G., 2003; Ranc F., 2009). В связи с этим внимание исследователей привлечено к изучению факторов риска е развития и разработке эффективных методов профилактики пищевой аллергии ещ в младенческом возрасте (Zeiger R.S., 2000; Sabato V., 2013; Metcalfe J., et al., 2013; Kattan J.D., Wang J., 2013; Geddes D.T., Prescott S.L., 2013). Рассматриваются генетические факторы предрасположенности к аллергии и влияние окружающей среды в постнатальный период развития ребнка (способ рождения, характер вскармливания, роль бактериальных и вирусных инфекций, антибактериальной терапии, курения родителей и т.д.) (Eigenmann P.A., 2009). Вместе с тем, в последнее время вс большее число авторов указывает на возможность внутриутробной сенсибилизации плода к аллергенам, поступающим из организма матери при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды (аллергены клещей, животных, домашней пыли, табачный дым и т.д.) (Holt P. G., 1998), а также к протеинам употребляемой пищи (Szpfalusi Z., 1997; M., 2004; Faber M. R., 2005; Ward C.M., et al., 2007; Dupont C., 2011). Показана высокая частота аллергических реакций у детей с задержкой внутриутробного развития (Шабалов Н. П., 1987; Самсыгина Г.А и др., 1999).

Установлено, что при развитии в условиях хронической гипоксии у ребнка наблюдается дисбаланс различных звеньев системы иммунитета, что, по мнению авторов,

способствует появлению иммунопатологических реакций, лежащих в основе

формирования аллергических реакций (Дегтярева М.В., 1995; Таболин В.А. и др., 1997).

В последние годы получены клинические и экспериментальные доказательства роли плаценты в программировании заболеваний потомства при таком осложнении беременности как преэклампсия (Myatt L., 2006; Jansson T., 2007). Однако имеющиеся в литературе сведения о значении осложнений беременности в развитии у ребенка аллергических реакций носят фрагментарный характер и не дают представления о механизмах «программирования» аллергического фенотипа плода, знание которых позволило бы определить принципы ранней профилактики.

Цель исследования. Изучить механизмы формирования предрасположенности к аллергии и определить методы е профилактики у детей, внутриутробное развитие которых протекало в условиях хронической плацентарной недостаточности.

Задачи исследования

1.Изучить частоту пищевой сенсибилизации на первом году жизни у детей в зависимости от состояния здоровья матерей, наличия осложнения беременности хронической плацентарной недостаточностью и гестозом, а также родоразрешения путм операции кесарева сечения.

2.Изучить в плацентах матерей обследованных детей аллельный полиморфизм генов детоксикации (GSTM1,GSTT1,GSTP1) и генов NO-синтаз (nNOS, eNOS), участвующих в развитии предрасположенности к аллергии.

3.Исследовать морфологическое состояние плацент, экспрессию в них С3 компонента комплемента, иммуноглобулинов, зрелых антигенпрезентирующих клеток СD83, молекул адгезии CD31, а также цитокинов (IL-4, IL-6. IL-10), свидетельствующих о формировании аллергического фенотипа плода.

4.Изучить уровень IgE в крови матери и ребнка в сопоставлении с его клиническим состоянием и результатами проспективного наблюдения в течение первого года жизни.

5.Изучить эффективность профилактики пищевой сенсибилизации при использовании смеси с частичным гидролизом белка для смешанного вскармливания новорожденных, внутриутробное развитие которых протекало в условиях хронической плацентарной недостаточности.

Научная новизна

Впервые показано, что при наличии у женщины патологии трх и более функциональных систем организма (желудочно-кишечного тракта, эндокринной, иммунной) существует высокий риск осложнения беременности хронической плацентарной недостаточностью и гестозом.

Впервые проведен анализ частоты развития ПС на первом году жизни ребнка в зависимости от соматического здоровья матери и условий внутриутробного развития. Установлено, что риск развития ПС у ребнка существует при наличии у матери заболеваний желудочно-кишечного тракта, органов дыхания и мочеполовой системы, но он существенно увеличивается при осложнении беременности хронической плацентарной недостаточностью и гестозом.

Впервые установлен механизм антенатального программирования аллергического фенотипа ребнка, заключающийся в избыточном образовании антигенов в плаценте вследствие иммунологического воспаления и связанных с ним деструктивных и некротических процессов, что сопровождается активацией антиген презентирующих клеток (CD83), молекул адгезии СD31 и образованием IL-4, IL-6, свидетельствующих о дифференцировке Т₀ лимфоцитов в Tх2 типа.

Впервые показана необходимость использования смесей с частичным гидролизом белка при смешанном или искусственном вскармливании детей, внутриутробное развитие которых протекало в условиях хронической плацентарной недостаточности.

Теоретическая значимость

Изучение происходящих в плаценте процессов на тканевом и клеточном уровнях при осложнении беременности хронической плацентарной недостаточностью и гестозом открыло механизм формирования предрасположенности к аллергическим заболеваниям в раннем онтогенезе человека, что определяет перспективы данного направления исследований при других формах акушерской патологии для изыскания новых подходов к профилактике аллергии у детей.

Практическая значимость

Результаты работы определяют новый подход к профилактике пищевой

сенсибилизации ребнка, заключающийся в углублнном изучении соматического анамнеза женщины ещ на этапе планирования семьи, выявлении среди беременных лиц высокого риска развития плацентарной недостаточности и своевременном проведении профилактических и лечебных мероприятий.

Включение новорожденных, внутриутробное развитие которых протекало в условиях хронической плацентарной недостаточности, в группу высокого риска формирования пищевой сенсибилизации позволит осуществлять раннюю профилактику путм поддержки грудного вскармливания, а при смешанном или искусственном вскармливании использованием с рождения адаптированных молочных смесей с частичным гидролизом белка.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У женщин, имеющих заболевания трх и более функциональных систем организма существует высокий риск осложнения беременности гестозом и хронической плацентарной недостаточностью, в результате чего каждый второй ребнок рождается с задержкой внутриутробного развития и путм операции кесарева сечения, а на первом году жизни у 75% детей формируется пищевая сенсибилизация. При отсутствии осложнений беременности в е развитии у 30,7% детей существенную роль играют постнатальные факторы: повышенное поступление аллергенов при наличии у матери хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, органов дыхания и мочеполовой системы.

2. При хронической плацентарной недостаточности, особенно при е субкомпенсированной форме, в плаценте вследствие иммунологического воспаления и связанных с ним деструктивных и некротических процессов происходит избыточное образование антигенов, что сопровождается активацией антиген презентирующих клеток (CD83), молекул адгезии СD31 и образованием IL-4, IL-6, IL-10 указывающих на дифференцировку Т₀ лимфоцитов в Tх2-типа, то есть о формировании аллергического фенотипа ребнка.

3. Использование смесей с частичным гидролизом белка при смешанном или искусственном вскармливании новорожденных, внутриутробное развитие которых протекало в условиях хронической плацентарной недостаточности, обеспечивает профилактику пищевой сенсибилизации после рождения.

Апробация работы и личный вклад автора: основные положения диссертации опубликованы в печати (11 печатных работ). Результаты работы доложены на IV Междисциплинарной конференции по акушерству, перинатологии и неонатологии: «Здоровая женщина – здоровый новорожденный» (Санкт-Петербург, 2009), III Российском форуме «Здоровье детей: профилактика социально-значимых заболеваний» (Санкт-Петербург, 2009), V Конгрессе специалистов перинатальной медицины (Санкт-Петербург, 2010), Национальном Конгрессе «Дискуссионные вопросы современного акушерства» (Санкт-Петербург, 2011), III Конгрессе федерации педиатров стран СНГ: «Ребенок и общество: проблемы здоровья, развития и питания» (Москва, 2011), V Съезде общества детских патологов России (Санкт-Петербург, 2012), на конференции «Репродуктивная медицина: Взгляд молодых – 2012» (Санкт-Петербург, 2012), на 2-ом международном конгрессе «Консенсус в педиатрии и здоровье детей» (Москва, 2012), V Конгрессе федерации педиатров стран СНГ: «Ребенок и общество: проблемы здоровья, развития и питания» (Кишинев, 2013), II Национальном конгрессе «Дискуссионные вопросы современного акушерства». Преконгресс-курс XI всемирного конгресса по перинатальной медицине (СПб, 2013), на 23-м Ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Барселона, 2013), III-ем национальном конгрессе «Дискуссионные вопросы акушерства» (СПб, 2015).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 13 рисунками. Список литературы содержит 385 источников, в том числе 284 иностранных.

Современные представления о факторах риска и механизмах развития аллергических реакций у детей раннего возраста

При рассмотрении факторов риска и механизмов развития аллергических реакций авторы подчеркивают роль генетической (наследственной) предрасположенности, изменений характера питания населения, роста экологически неблагоприятных воздействий.

Исследования показали, что генетическая предрасположенность является важным фактором риска для развития ПА (183; 217). Установлено, что при наличии атопического заболевания у одного из родителей вероятность развития аллергии у ребенка составляет около 30%, у обоих -60-70% (385). Исследователи установили высокую роль наследования ПА при наличии её у родителей ребёнка или сибсов (191; 217). Так, Tsai H.J. и соавторы выявили единые аллергены при пищевой сенсибилизации у всех членов семьи (183), а при исследовании пищевой аллергии у близнецов установлена большая частота среди однояйцевых, чем среди дизиготных детей (199).

Выявлена связь генов-кандидатов главного комплекса гистосовместимости (HLA) и развития ПА (HLA -DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPB1) (198; 212; 221). В то же время другие авторы показали, что полиморфизм генов HLA II класса не ассоциирован с аллергией (199).

Одни исследователи обращают внимание на ассоциацию с ПА гена CD14 (С-159Т) -рецептора для липополисахаридов (358), а другие не находят связи между полиморфизмами (С-159Т и С-550Т) гена CD14 и ПА (296).

В своем исследовании Torgerson T.R. и соавт. (342) отметили, что экспрессия FOXP3 гена может привести к тяжелой ПА. Имеются указания на роль в развитии ПА полиморфизма БТАТб-гена (354). Показано, что G2964A полиморфизм БТАТб-гена увеличен при ПА и определяет её степень тяжести (308). Однако другие эту связь отрицают (241).

SPINK5 является ингибитором белка протеазы, экспрессируется в тимусе и его недостаток способствует продукции Th2-лимфоцитов, повышению уровня IgE и эозинофилии (292). У детей с АтД и с полиморфизмом гена SPINK5 1258АА или 1258GG обнаружена высокая встречаемость ПА (347).

Ген IL-10 регулирует экспрессию цитокинов Thl, МНС II и костимулирующих молекул на макрофагах. Аллели генов 1082G-H С-627А связывают с активацией этого цитокина (113; 383). Одни авторы показали связь между полиморфизмом IL-10 -627АА и тяжестью ПА и АтД, но другие исследователи у детей-атопиков при генотипе IL-10 -627АА не обнаружили подобной связи, но при генотипе IL-10 -1082АА риск развития ПА увеличивался в 2,5 раза (229).

Имеются данные о том, что при С-1055Т полиморфизме гена IL-13 повышен риск развития пищевой сенсибилизации (119).

Исследователи показали, что объединение полиморфизмов IL4, ПЛЗ, IL4RA и STAT6 генов приводит к увеличению уровня IgE в сыворотке в 10,8 раз и в 16,8 раз увеличивает риск развития БА по сравнению с эффектом какого-либо одного гена (231).

Таким образом, данные литературы противоречивы. Семейное наследование ПА и аллергических болезней предполагает, что генетические факторы играют роль в её патогенезе, однако «надежных» генетических маркеров пока не выявлено. Указывая на роль генетических факторов в развитии аллергических реакций, авторы отмечают, что их удельный вес в популяции в последние десятилетия остался практически без изменений (378).

Вместе с тем, исследователи подчёркивают роль неблагоприятных экологических факторов в манифестации генетической предрасположенности (196).

В настоящее время исследования «ген - окружающая среда» при A3 ограничены, ориентируются в основном на факторы окружающей среды: курение, загрязнение воздуха и микробное воздействие. В частности, показано, что полиморфизм гена GSTP1 Ilel05Val и влияние загрязненного воздуха способствуют развитию сенсибилизации к ингаляционным и / или пищевым аллергенам (242).

Существенное значение придаётся эпигенетическим механизмам - изменению экспрессии генов, что может происходить не только внутриутробно или вскоре после рождения, но и в более поздние периоды развития ребёнка (269).

Всплеск аллергической заболеваемости указывает на роль неблагоприятного воздействия факторов окружающей среды в сочетании с наследственной предрасположенностью (239). Неблагоприятное влияние оказывает повсеместная химизация быта и сельского хозяйства, вызванная действием аэрополлютантов (озона, окислов азота, комплекса частиц двуокиси серы, кислых аэрозолей и др.), формирующих индустриальный и фотохимический смог (12; 110; 128). Одним из наиболее часто встречающихся загрязнителей воздушного бассейна является диоксид серы, концентрация которого особенно велика вблизи промышленных зон и автомагистралей. Исследователи показали, что дети, проживающие в городах вблизи крупных дорог, более часто подвержены атопии (118).

Высокие концентрации «внутренних» поллютантов, т.е. поллютантов помещений, становится существенным фактором при формировании A3 (13).

Показано, что пренатальное воздействие курения матери способствует появлению аллергических реакций у детей первого года жизни. При этом выраженность проявлений аллергии коррелирует с интенсивностью пассивного курения. Наиболее неблагоприятным является пассивное курение на фоне наличия у матери A3 (372).

В последние десятилетия многие исследования были посвящены изучению связи между характером питания детского населения и развитием аллергии. Увеличение числа детей с аллергией исследователи объясняют сокращением потребления животных жиров, в первую очередь рыбьего жира и увеличения использования маргарина и растительных масел (125). Гипотеза «избытка» витамина Д предполагает, что увеличение содержания витамина Д в рационе приводит к повышению риска развития ПА (172). Однако существует и противоположная гипотеза «дефицита» витамина Д (381).

Много исследований посвящено роли микрофлоры в развитии A3 у детей (321; 355; 373). При патологии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) изменяется состав микрофлоры кишечника (127). Изменение состава микрофлоры кишечника в первые дни и недели жизни ребёнка может влиять на реализацию аллергической предрасположенности. Изменения характеризуются в основном снижением количества бифидобактерий и увеличением уровня кластридий и бактероидов (105; 151; 152; 169). На кишечную микрофлору может оказывать влияние состав микрофлоры грудного молока матерей, имеющих и не имеющих A3 (272).

Согласно «гигиенической» гипотезе, значительное ограничение контакта с микробными антигенами в раннем периоде жизни ребенка увеличивает риск развития аллергии (349).

Эпидемиологические и экспериментальные исследования показали тесную связь между воздействием аллергенов во время беременности, лактации и ранним развитием пищевой сенсибилизации (216; 378). Многие авторы полагают, что в развитии аллергических реакций играют роль неблагоприятные факторы и антигенная нагрузка во время внутриутробного развития и в раннем постнатальном онтогенезе ребенка (167; 216; 377). Рекомендуется избегать пищевых аллергенов таких, как арахис во время беременности и кормления грудью (Department of Health, 1997). Согласно современным данным, существует несколько возможных механизмов внутриутробной сенсибилизации. Полагают, что плод, заглатывая содержащие цитокины и/или аллергены амниотические воды, стимулирует дифференциацию Т-лимфоцитов в сторону Th2-типа иммунного ответа (134; 188). Придают значение контакту кожи плода с амниотическими водами, содержащими антигены, что может влиять на характер иммунного ответа ребенка в постнатальном периоде (192; 251; 316). В то же время эпидемиологические исследования других авторов не показывают каких-либо связей между материнским потреблением аллергена во время беременности, при кормлении грудью и развитием ПА у ребёнка (149; 182).

Заболевания сердечно - сосудистой, бронхо - легочной систем, осложнения беременности (гестоз, хроническая плацентарная недостаточность, угроза прерывания), родов (слабость родовой деятельности, стремительные роды, преждевременное излитие околоплодных вод, родостимуляция), медикаментозная терапия (13; 170), активное и пассивное курение (20; 179; 372) матери являются окружающей средой ребенка и влияют на становление его иммунной системы.

Развитие системы иммунитета в раннем онтогенезе и ее особенности у новорожденных детей, перенесших хроническую гипоксию

Методом ПЦР/ПДРФ анализа исследована частота нулевых аллелей генов GSTT1 и GSTM1, а также частота аллелей и генотипов GSTP1 гена в образцах ДНК плацент у пациенток с ПН и без ПН. Смесь для амплификации, объемом 25 мкл, включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 MKrBSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1U Tth-ДНК-полимеразы (производства «Бион», Москва). Для амплификации фрагментов генов GSTM1 (GSTM1 F GAA СТС ССТ GAA AAG СТА AAG С; GSTM1 R GTT GGG СТС AAA TAT ACG GTG G) и GSTT1 (GST Tl F TTC CTT ACT GGT ССТ CAC АТС ТС; GST ТІ R TCA CCG GAT CAT GGC CAG С A) использовали следующие условия ПЦР: после денатурации (94 С, 7 минут) проводили 32 цикла амплификации в режиме 94 С - 1 минута; 53 С - 1 минута; 72 С - 1 минута 20 секунд. Для амплификации использовали программируемый термоциклер «ДНК-технология» (Москва). После окончания ПЦР специфичность амплификации и количество амплификата проверяли методом электрофореза в 7,0 % полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ свете. Гомозиготы по нулевому аллелю определяли по отсутствию на электрофореграммах продукта амплификации размером 315 п.о. для GSTT1 и фрагмента 271 п.о. для GSTM1. В качестве внутреннего контроля использовали амплификацию фрагмента гена CYPA1 (192 п.о.). Гетерозиготные особи 0/+ не дискриминировались. Для амплификации двух фрагментов гена GSTP1 (GST р IF СТС ТАТ GGG AAG GAC CAG CAG GAG; GST р 2R САА GCC АСС TGA GGG GTA AGG; GST р 3 F GTT GTG GGG AGC AAG CAG AGG; GST р 4 R GCC ТТС АСА TAG TCA ТСС TTG CGC) использовали следующие условия ПЦР: после денатурации (94 С, 7 минут) проводили 32 цикла амплификации в режиме 94 С - 40 секунд; 60 С - 40 секунд; 72 С - 1 минута. Для амплификации использовали программируемый термоциклер «Perkin-Elmer Cetus» (США). После амплификации продукты ПЦР подвергались расщеплению с помощью специфических эндонуклеаз Bso MAI (праймеры GST р IF и GST р 2R) и Bst FN1 (праймеры GST р 3F и GST р 4R) по прописям, рекомендованным фирмой-изготовителем рестриктаз в буфере, прилагаемом к ферменту. Продукты реакции анализировали в 7,0 % полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ свете. 250 нг исследуемого образца геномной ДНК добавляли к 25 мкл смеси, которая включала 0,67 мМ трис-HCI, рН 8,8 при 25 ОС: 16,6 мМ (NH4)2S04: 6,7 мМ MgCI2: 6,7 мкм ЭДТА: 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,8 мМ каждого, термостабильную ДНК-полимеразу, 0,2 ед/мкл («Сибэнзим», Новосибирск) и по 0,001 оптической единицы каждого олигопраймера. Для амплификации фрагментов гена nNOS и eNOS использовали следующие условия ПНР: после денатурации (94 ОС-7 минут) проводили 32 цикла амплификации в режиме 95 0С-50 секунд, 58 0С-50 секунд, 72 0С-50 секунд и заключительный синтез 72 0С-5 минут. После амплификации анализировали продукты реакции в 7,0 % полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ свете.

Исследования плацент проводили в лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней ФБГНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (руководитель - член-корр. РАМН, з.д.н. РФ, д.м.н., проф. Баранов В. С.) при участии и консультации ст. н. с, д.м.н. Беспаловой О.Н.

Количественное определение общего IgE проводили в плазме пуповинной крови с помощью тест-системы Элексис in vitro. Электрохемилюминесцентный иммуноанализ «ECLIA» использован на автоматическом анализаторе фирмы «Хоффман-Ла Рош»: Элексис 2010, Е170 Модуляр.

В наборе ИФА - общий IgE использован "сэндвич" - вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к IgE. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-IgE-пероксидаза во время инкубации одновременно происходит иммобилизация общего IgE, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-IgE-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации IgE. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству общего IgE в исследуемом образце.

Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина (ТМБ) происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного конъюгата aHTH-IgE-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация общего IgE в исследуемых образцах.

Для учета и обработки данных были созданы специальные карты, куда вносили информацию об анамнезе матери, течении беременности, родов и послеродового периода, данные клинического состояния ребенка, проведенных в раннем неонатальном периоде лабораторных и инструментальных исследований, а также результаты наблюдений и анкетирования на первом году жизни, данные гистологических, иммуногистохимических, иммуноморфологических исследований плацент, данные полиморфизма генов системы детоксикации, генов NO-синтаз и определения IgE из вены пуповины.

Результаты исследований обработаны с использованием метода анализа средних тенденций и количественных различий. Вычисляли среднюю арифметическую величину (М), среднее квадратичное отклонение (о) и среднюю ошибку средней величины (ш).

Для вычисления и сравнения средних величин цифровых данных, а также для оценки достоверности полученных результатов пользовались методами оценки разности между долями, анализа средних тенденций (t-критерий Стьюдента), корреляционным анализом. За достоверность различий принимали уровень р 0,05. Для независимых выборок использовали критерий U (непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни), для сравнения относительных величин использовали критерий ф (точный критерий) Фишера. Корреляционный анализ проводили с использованием непараметрического критерия Спирмана. Статистическую обработку материала проводили с использованием программных пакетов «Microsoft Office 2003», «Statgraphics 6.0», «SPSS 9.0».

При сравнении частот генотипов использовали стандартный критерий у2. Относительный риск (OR) развития заболевания при определенном генотипе рассчитывали по стандартной формуле с поправкой на малые выборки, OR = (а + 0,5) /(Ь + 0,5) х (d + 0,5)/(с + 0,5), где а и b — количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, а с и d — количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно. OR указан с 95 % доверительным интервалом. Границы доверительного интервала вычисляли по формулам ORmin = OR (1 -\,96Ny2) и ORmax = OR(l + 1,96/VX2). При помощи бинарной логистической регрессии рассчитывали вероятность наступления события в зависимости от значений независимых переменных. Вероятность наступления события рассчитывали по формуле:

Где z= bi Xi + ЬгхХг+...+ bnxXn+ a, Xi - значения независимых переменных, bi -коэффициенты, расчет которых является задачей бинарной логистической регрессии, а -некоторая константа. Если для р получится значение меньшее 0.5, то можно предположить, что событие не наступит; в противном случае предполагается наступление события.

Иммуноморфологический метод определения фракции СЗ компонента комплемента, фибриногена, иммуноглобулинов (А, М, G) и провоспалительных цитокинов (IL-4, IL-6, IL-10) в плаценте

Проведено сопоставление результатов иммуноморфологического и иммуногистохимического исследование 38 плацент, среди которых 15 плацент получены у матерей первой группы, беременность у которых осложнилась субкомпенсированной хронической плацентарной недостаточностью и гестозом, а 23 плаценты принадлежали матерям III группы, у которых беременность протекала без осложнений.

Гистологическое исследование 38 плацент, из которых 15 принадлежали матерям, беременность у которых осложнилась хронической плацентарной недостаточностью выявило у последних признаки субкомпенсированной хронической плацентарной недостаточности. Имелась патологическая незрелость и нарушение созревания ворсин хориона по диссоциированому типу. Наблюдались выраженные инволютивно-дистрофические процессы (высокая степень фиброза стромы ворсин и содержания фибриногена в межворсинчатом субхориальном пространстве) и циркуляторные расстройства с редукцией сосудистого русла, наличием полей хаотически склерозированных ворсин. При избыточном отложении фибриногена имелся тромбоз сосудов и разрушение эндотелиоцитов. При этом компенсаторно-приспособительные реакции были слабо выражены.

Сопоставление полученных данных с результатами иммуноморфологического исследования плацент показало, что только при субкомпенсированной хронической плацентарной недостаточности наблюдается избыточное (от 30 до 320 у.е.) отложение СЗ компонента комплемента и фибриногена в межворсинчатом пространстве, в области базальных мембран трофобласта и сосудов ворсин хориона (рисунок 6).

Отложение СЗ компонента комплемента в плаценте при хронической плацентарной недостаточности (А) и его отсутствие в норме (В) Имеется также обилие лимфоидных элементов в децидуальной оболочке. В местах отложения СЗ компонента комплемента наблюдается значительная экспрессия иммуноглобулинов А, М, G, что свидетельствует об избыточном формировании патогенных иммунных комплексов, вызывающих иммунологическое воспаление, тяжелые дистрофические и некротические процессы в ткани. В местах их отложения происходит полное разрушение синцитиотрофобласта ворсин, выявляются очаги некроза и кровоизлияния в базальной пластинке (рисунок 7).

Следовательно, при хронической плацентарной недостаточности плацента становится источником избыточного накопления антигенов. Наряду с этим нарушается барьерная функция плаценты и плодных оболочек, что создаёт условия для проникновения лекарственных веществ и других антигенов из межворсинчатого пространства с последующим их влиянием на иммунную систему плода. Кроме того, эпигенетические воздействия при хронической плацентарной недостаточности могут изменить экспрессию генов цитокинов, иммуноглобулинов и других пептидных регуляторов, что не может не влиять на иммунную систему матери и плода (269). Наряду с патологическими изменениями в плаценте в результате активации комплемента происходит экспрессия рецепторов к нему - CD21 и CD25, что способствует захвату и выведению белковых антигенов (336).

Известно, что главными активаторами первичного иммунного ответа «наивных» Т-лимфоцитов являются дендритные клетки (ДК), которые в плаценте происходят из CD14(+) -моноцитов (208). Последние после контакта с антигеном (АГ) и его поглощения начинают созревать и при этом экспрессируют на своей поверхности костимулирующие молекулы (CD40, CD58, CD80, CD86, CD83) и молекулы главного комплекса гистосовместимости (MCH-I и MCH-II) (148). Презентация антигена дендритными клетками осуществляется путём контакта вышедших на поверхность клетки комплексов антигенный пептид/МСН с рецепторами Т-лимфоцитов (TCR), распознающими антиген (257). Поскольку ДК плаценты выступают в качестве стимуляторов иммунного ответа плода на антигены материнского происхождения мы полагали, что степень их экспрессии в плаценте может служить показателем массивности антигенной агрессии. Поэтому была изучена представленность зрелых дендритных клеток (CD83) в 38 плацентах в сопоставлении с их гистологическим и иммуноморфологическим состоянием.

Результаты исследований 38 плацент показали, что ДК (CD83) в плацентах после срочных родов обнаруживаются в периваскулярном пространстве децидуальной оболочки и строме ворсин в 57,9 ± 8,0% случаев. Относительная площадь экспрессии составляет 4,94±1,05%, а оптическая плотность - 0,35 ± 0,08 у.е. (рисунок 9). Сопоставление с результатами гистологического исследования плацент показало, что дендритные клетки присутствуют в ткани при наличии хронической плацентарной недостаточности (коэффициент корреляции R=0,55, Р 0,05). Последняя характеризовалась патологической незрелостью и нарушением созревания ворсин по диссоциированому типу. Наблюдались выраженные инволютивно-дистрофические процессы (высокая степень фиброза стромы ворсин и содержания фибриногена в межворсинчатом субхориальном пространстве) и циркуляторные расстройства с редукцией сосудистого русла и наличием полей хаотически склерозированных ворсин. При избыточном отложении фибриногена наблюдались тромбоз сосудов и разрушение эндотелиоцитов. При этом компенсаторно-приспособительные реакции были слабо выражены.

В 23 плацентах гистологические признаки хронической плацентарной недостаточности отсутствовали. Незначительная экспрессия ДК (CD83) имелась только в 7 из них где присутствовали воспалительные изменения (мононуклеарный и лимфолейкоцитарный децидуит, интервиллезит, лимфолейкоцитарный мембранит).

Полиморфизм генов системы детоксикации и генов no-синтаз в плацентах при хронической плацентарной недостаточности

Дендритные клетки, являясь главными активаторами «наивных» Т-лимфоцитов, модуляторами ответов В-лимфоцитов и натуральных киллеров, продуцируют цитокины, которые дифференцировано направляют (регулируют) тип иммунного ответа (208; 252). Высокая экспрессия IL-1, IL-4; JL-6 в эндотелии сосудов ворсин хориона, т. е в тех плацентах, где имелась экспрессия CD83 и CD31, указывает на примирование ThO в сторону Тп2-типа иммунного ответа.

Известно, что сдвиг направления в сторону формирования Th2 иммунного ответа зависит как от типа и количества антигена, так и от активности костимулирующих молекул на ДК и от микроокружения ДК и их природы (160). Дифференциация Th «нулевых» в Th2 индуцируется в присутствии IL-4, IL-6 (114; 166; 200; 334). При хронической плацентарной недостаточности и гестозе этому способствует высокий уровень в артерии пуповины IL-6, IL-8, растворимого IL-4R (162; 163). Большое значение имеет тип возникающей в плаценте иммунологической реакции в сочетании с индивидуальным генетическим фоном (197).

Известно, что высокий уровень кортикостероидов в плаценте при наличии хронической плацентарной недостаточности также способствует примированию Th «нулевых» в сторону дифференцировки Th2, т.к. кортикостероиды значительно угнетают выделение цитокинов (IL-2, TNF-т), но повышают продукцию цитокинов Th2 (175). Как в плаценте, так и у плода, развивающегося в условиях хронической гипоксии при хронической плацентарной недостаточности, возрастает продукция IL-6, TNF- , С-реактивного белка, тромбопоэтина, о чём свидетельствует значительное увеличение их уровня в пуповинной крови (238). Увеличение уровня JL-4 также способствует подавлению дифференциации Thl- типа и сдвигу в сторону Th-2 (230).

Кроме того, сдвиг в сторону Тп2-ответа усиливается под влиянием нитроксидных радикалов, которые в избытке образуются в плаценте и у плода при хронической плацентарной недостаточности (6).

Следует отметить, что в литературе ранее было высказано мнение о том, что уже при рождении система клеточного иммунитета имеет направленность в сторону Тп2-ответа, поскольку отражает иммунологическую память о влиянии на плод аллергенов, попадающих в его организм из окружающей мать среды (111; 214; 251; 278; 368). В подтверждение этому свидетельствовали работы, показавшие изменение баланса Thl/Th2 у потомства при воздействии различных аллергенов на мать (145; 168; 336; 376). Однако в этих исследованиях авторы не принимали во внимание качественное состояние самой плаценты. Вместе с тем, другие исследователи считают, что система врожденного клеточного иммунитета плода способна обеспечить дифференцировку лимфоцитов как в сторону Thl, так и Th2 типа (107). При отсутствии неблагоприятных воздействий у новорожденного имеется баланс Thl/Th2 и достаточная продукция Т регуляторных клеток, обеспечивающих формирование толерантности (237; 279; 331).

Наши результаты свидетельствуют о том, что при развитии плода в неблагоприятных условиях при хронической плацентарной недостаточности возникают все предпосылки к формированию у него Th2 сдвига, т.е. аллергического фенотипа ребенка. В наших исследованиях формирование аллергического фенотипа ребёнка происходило антенатально при отсутствии неблагоприятного генетического фона. Наши результаты показали отсутствие N0-синтаз и различий аллелей генов детоксикации (GSTP1, GSTM1, GSTT1) как в нормальных плацентах, так и при хронической плацентарной недостаточности. Другие исследователи также не нашли особенностей полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 в плацентах при преэклампсии (304).

Известно, что изменение соотношения Thl/Th2, проявляющееся повышением активности Th2 клеток и продукции цитокинов IL-4, IL-10, IL-13 определяет развитие IgE-опосредованной реакции (186; 230; 264; 366).

Поэтому мы попытались выяснить каков уровень общих IgE антител в крови из вены пуповины у новорожденных детей, развивающихся в условиях хронической плацентарной недостаточности. Оказалось, что уровень общего IgE в пуповинной крови отличается широким диапазоном индивидуальных колебаний, имеется лишь тенденция к повышению при патологии плаценты, следовательно, IgE не может служить прогностическим показателем развития у ребенка пищевой сенсибилизации на первом году жизни. Низкий уровень общего IgE в наших исследованиях можно объяснить свойствами IgE антител, обладающих цитотропностью. Считают, что концентрация IgE-антител в сыворотке крови потому и низка, что молекулы IgE в основном фиксируются в тканях, окружающих региональные лимфатические узлы (74). Можно полагать, что отсутствие повышения общего IgE в пуповинной крови при рождении связано с тем, что при первичном попадании аллергенов в организм плода происходит только запуск механизма синтеза IgE антител, фиксирующихся на клетках-мишенях. В литературе в отношении происхождения IgE антител мнение авторов противоречивы. Одни считают, что IgE антитела в пуповинной крови материнского происхождения. Они связываются в плаценте с высокоаффинными рецепторами (Fcl RI) на антигенпрезентирующих клетках, что может влиять на развитие иммунной системы плода и формирование у ребенка предрасположенности к аллергии (132; 225; 226; 268). Авторы ссылаются на положительную корреляционную связь между уровнем общих и аллерген специфических IgE в крови матери и в пуповинной крови (131; 180; 274; 333). При этом уровень общих IgE антител в пуповинной крови был существенно выше, если мать испытывала стресс во время беременности (314), подвергалась воздействию сигаретного дыма и поллютантов (181; 209). При наличии осложнений беременности (352) и родового акта (преждевременное излитие околоплодных вод, отхождение мекония в околоплодные воды) также наблюдалось повышение уровня IgE в околоплодных водах (227).

В то же время другие исследователи считают, что выявляемые в плаценте IgE имеют плодовое происхождение и образуются в его организме уже на 11-12 неделе беременности (240). Важно отметить, что IgE специфические антитела чаще выявляются на пищевые аллергены, чем на ингаляционные (157; 244; 284). Обнаружена корреляционная связь между материнскими и плодовыми специфическими IgE (332).

В связи с различной оценкой происхождения IgE в пуповинной крови мнение относительно прогностической значимости данного показателя противоречивы. Одни исследователи считают, что наличие аллергии у матери в сочетании с высоким уровнем IgE в её крови и в крови из вены пуповины является главным прогностическим фактором развития атопического дерматита и других проявлений аллергии у потомства (158; 207; 224). С этим положением согласуются результаты других исследователей, показавших, что уровень IgE в пуповинной крови не имеет прогностической значимости, но в сочетании с данными об уровне IFN-1 и аллергенов его специфичность возрастает до 93%. Сочетание материнского стресса, генотипов LT-D, Fcl-Л и высокого уровня IgE в пуповинной крови с учётом аллергологического анамнеза родителей является прогностическим в отношении развития атопического дерматита у потомства уже в двухлетнем возрасте (310). В то же время другие авторы, сопоставляя анамнез матери и уровень IgE у 1314 новорожденных детей с данными проспективного наблюдения за их здоровьем в последующие 2 года жизни, пришли к выводу, что эти факторы не имеют прогностического значения (309). Другие исследователи отрицают значение повышенного уровня IgE в пуповинной крови для определения предрасположенности ребёнка к развитию в последующем аллергических реакций (346).

Вероятно, только при повторной встрече с аллергеном и при избытке образования комплекса антиген + IgE происходит переход ко II стадии аллергической реакции и нарушению структуры мембран клеток-мишеней, что ведёт к появлению клинических проявлений аллергии.