Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Актуальные вопросы 9
1.2 Классификация АЛПС 9
1.3 Патогенез и генетические аспекты АЛПС 12
1.4 Клинические проявления АЛПС 15
1.5 Дифференциальная диагностика АЛПС 17
1.6 Лечение АЛПС 18
1.7 Прогноз при АЛПС 22
1.8 Заключение 22
Глава 2. Характеристика клинических наблюдений и методов исследования 23
2.1 Характеристика клинических наблюдений 23
2.2 Оценка клинических проявлений 25
2.3 Методы обследования 27
2.3.1 Сбор анамнеза и осмотр пациента 27
2.3.2 Лабораторные исследования 28
2.4 Характеристика методов лечения 29
2.5 Статистическая обработка данных 30
Глава 3. Анализ результатов обследования пациентов с АЛПС и группы дифференциальной диагностики 32
3.1. Общая и молекулярно-генетическая характеристика группы пациентов с АЛПС-фенотипом из группы дифференциальной диагностики 32
3.2. Общая и молекулярно-генетическая характеристика пациентов из группы АЛПС 35
3.2.1 Характеристика носителей мутаций 36
3.3. Характеристика клинических проявлений у пациентов с АЛПС 40
3.4. Клиническая характеристика пациентов с АЛПС-фенотипом 43
3.5. Лабораторная характеристика пациентов 46
3.5.1 Сравнение показателей общего анализа крови 46
3.5.2 Иммунологические характеристики пациентов из группы АЛПС и дифференциальной диагностики 47
3.5.3 Оценка биологических маркеров в группе АЛПС и группе дифференциальной диагностики 52
3.6. Морфологические исследования 57
Глава 4. Лечение 60
4.2.1 Лечение пациентов с АЛПС 60
4.1.1 Предшествующая симптоматика и терапия 62
4.1.2 Эффективность терапии сиролимусом 65
4.1.3 Изменение режима дозирования SRL 67
4.1.4 Оценка биомаркеров 69
4.1.5 Оценка безопасности терапии 70
4.2 Сиролимус в терапии пациентов из группы дифференциальной диагностики 71
4.2.1 Эффективность терапии сиролимусом в группе пациентов с АЛПС - фенотипом (группа дифференциальной диагностики) 77
4.2.2 Переносимость терапии сиролимусом в группе пациентов с АЛПС-фенотипом .80
4.3 Сравнительный анализ терапии сиролимусом в двух группах 81
Глава 5. Обсуждение результатов исследования 83
Заключение 87
Выводы 88
Практические рекомендации 89
Список сокращений 90
Список литературы 95
- Лечение АЛПС
- Иммунологические характеристики пациентов из группы АЛПС и дифференциальной диагностики
- Предшествующая симптоматика и терапия
- Сиролимус в терапии пациентов из группы дифференциальной диагностики
Введение к работе
Актуальность темы исследования
История наблюдения за пациентами с аутоиммунным лимфопролиферативным синдромом (АЛПС) началась еще в прошлом столетии, когда Canale и Smith в 1967 году [Canale и соавт., 1967] описали детский синдром лимфоаденопатии и спленомегалии в сочетании с аутоиммунной гемолитической анемией и тромбоцитопенией. В настоящее время АЛПС определяется как заболевание, характеризующееся иммунной дисрегуляцией вследствие потери контроля над лимфоцитарным гомеостазом из-за нарушения апоптоза, приводящего к лимфопролиферативному синдрому и аутоиммунным заболеваниям, преимущественно иммунным цитопениям. Описано более 500 пациентов более чем из 300 семей с диагностированным АЛПС; однако истинная заболеваемость и распространённость синдрома остается неизвестной. Заболевание описано у людей разных рас и этнических принадлежностей. Генетической основой заболевания являются патологические изменения в генах FAS, FASL, CASP8, CASP10, FADD, вовлеченных в лимфоцитарный апоптоз. Для постановки диагноза АЛПС используют критерии диагностики, разработанные Европейским обществом иммунодефицитных состояний (ESID)
[], включающие один обязательный симптом из больших признаков:
спленомегалия;
лимфаденопатия (увеличение 3 лимфатических узлов в течение более 3 месяцев при отсутствии инфекции и злокачественного новообразования;
аутоиммунная цитопения
лимфома в анамнезе;
положительный семейный анамнез
и один из малых признаков:
дубль-негативные Т-клетки (ДНТ) с фенотипом TCR/+CD3+CD4 CD8 составляют более 6% от CD3+ Т-клеток;
повышенные биологические маркеры: растворимый FASL (sFASL) более 200 пг/мл, общий витамин Bi2 более 1500 нг/л, интерлейкин-10 (TL-10) более 20 пг/мл, нарушенный FAS - опосредованный апоптоз.
Тем не менее, даже пациенты с генетически подтвержденным АЛПС не всегда удовлетворяют этим критериям [Bi и соавт., 2007, Teachey, 2012, Wilson и соавт., 1996].
Дифференциальная диагностика проводится с широким спектром патологий, в том числе с первичными иммунодефицитными состояниями, имеющими в числе своих проявлений лимфопролиферативный синдром. Правильная постановка диагноза важна для адекватного и своевременного назначения лечения.
В плане терапии АЛПС в настоящее время перспективным препаратом является сиролимус - ингибитор mTOR киназы [Teachey и соавт., 2009], в то же время, нет достаточного опыта его применения у детей с АЛПС, а также у пациентов с фенотипом АЛПС.
Цель исследования: оптимизировать дифференциальную диагностику АЛПС и АЛПС-подобных заболеваний и определить факторы ответа на терапию на основании клинических и молекулярно-генетических характеристик.
Задачи исследования
-
Изучение распределения молекулярно-генетических дефектов, лежащих в основе АЛПС и АЛПС-подобных ПИДС, с применением методов секвенирования по Сэнгеру и секвенирования нового поколения.
-
Описание особенностей клинической картины, включая лабораторные и морфологические данные, наблюдаемые при АЛПС и фенотипически схожих с ним ПИДС.
-
Изучение зависимости тяжести течения заболевания от локализации мутации в группе пациентов с дефектами в гене FAS, а также пенетрантность генетического дефекта для генов с аутосомно-доминантным типом наследования: FAS и CASP10.
-
Оценка возможности использования биологических маркеров (общий витамин В 12, ДНТ-клетки) при АЛПС в качестве критериев активности заболевания и эффективности терапии.
-
Оценка эффективности и безопасности терапии различными дозами сиролимуса при АЛПС и АЛПС-подобных заболеваниях.
Научная новизна исследования
-
Впервые в российской популяции охарактеризованы клинико-лабораторные особенности пациентов с АЛПС и АЛПС - подобным фенотипом.
-
Впервые в российской популяции выявлен и описан спектр генетических дефектов, лежащих в основе АЛПС-фенотипа, с использованием современных молекулярно-генетических методов исследования.
3. Впервые в российской популяции доказана эффективность и безопасность
применения терапии сиролимусом у пациентов с АЛПС, отработаны минимально эффективные дозы препарата.
Теоретическая и практическая значимость работы
-
Подробно описаны симптомы заболевания у пациентов с АЛПС и АЛПС -подобным фенотипом.
-
Выделен круг нозологий ПИДС для проведения дифференциальной диагностики с АЛПС.
-
Показана корреляция содержания общего витамина В 12 и выраженности лимфопролиферации у пациентов с АЛПС.
-
Показана возможность ведения пациентов на более низких дозах сиролимуса.
Положения, выносимые на защиту
-
АЛПС характеризуется различной пенетрантностью и разнообразием симптомов, которые не всегда отвечают диагностическим критериям ESID.
-
Содержание общего витамина В12 в сыворотке крови является наиболее информативным и простым в определении лабораторным маркером активности заболевания при АЛПС, и, в первую очередь, отражает выраженность лимфопролиферации. Он может использоваться для оценки эффективности терапии этих пациентов.
-
Монотерапия сиролимусом эффективна и безопасна у педиатрических пациентов с АЛПС, однако ее отмена ведет к быстрому рецидиву заболевания. Поддерживающие дозы сиролимуса 1 – 1,5 мг/м2 позволяют контролировать активность АЛПС.
-
Учитывая недостаточную эффективность сиролимуса при АЛПС-подобных заболеваниях, необходима их тщательная дифференциальная диагностика с выявлением генетического дефекта, что позволит выбирать адекватную тактику ведения пациентов.
Внедрение в практику: работа выполнена и внедрена в практику отделения иммунологии, стационара кратковременного лечения и консультативного отделения ФГБУ НМИЦ ДГОИ имени Дмитрия Рогачева Минздрава России. Основные положения диссертации включены в учебный процесс сертификационного цикла врачей аллергологов-иммунологов, гематологов ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
Апробация работы: результаты представлены и обсуждены на международных конференциях: 17th Biennial Meeting of the European Society for Immunodeficiencies – 2016, the
2017 Meeting of the European Society for Immunodeficiencies –2017, на научно-клиническом совете ФГБУ НМИЦ ДГОИ имени Дмитрия Рогачева Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Москва, 2107 год).
Объем и структура диссертации
Лечение АЛПС
До недавнего времени лечение АЛПС в случаях выраженных цитопений было симптоматическим и сводилось к проведению различной иммуносупрессивной терапии. Применяли высокие дозы внутривенных иммуноглобулинов, глюкокортикостероиды [50], циклофосфамид, а также ритуксимаб [51, 72]. Некоторые авторы указывают на транзиторный эффект ритуксимаба и развитие стойкой гипогаммаглобулинемии у пациентов с АЛПС, что, по их мнению, ограничивает его применение [17, 51]. В качестве эффективной базисной иммуносупрессивной терапии в литературе описан микофенолата мофетил [3], который ингибирует лимфоцитарную пролиферацию, не подавляя регуляторные Т-клетки (Treg) [45]. Показано, что повышение количества Treg улучшает течение аутоиммунных заболеваний [14]. Также обнаружено, что присутствующие при АЛПС ДНТ-клетки нарушают работу Treg [9], тогда как ингибиторы mTOR (mammalian target of rapamycin или мишень для рапамицина у млекопитающих) снижают количество ДНТ-клеток (TCR/+CD3+CD4–CD8–) у пациентов с АЛПС [68] и повышают содержание Treg [4]. Таким образом, исследователи подошли к новым вехам в лечении АЛПС. Настоящим прорывом в лечении АЛПС явилась опубликованная в 2009 году статья D.Teachey и соавторов [68], посвященная эффективности терапии сиролимусом в группе взрослых больных с АЛПС. Используемая ранее в этой группе терапия глюкокортикостероидами и иммуносупрессивными препаратами имела обширные побочные эффекты, в то время, как применение сиролимуса позволило в большинстве случаев лечить разнообразные проявления иммуной дисрегуляции, сопровождающие данное заболевание, с использованием комфортной, безопасной, пероральной монотерапии. В недавно опубликованном исследовании показано, что монотерапия сиролимусом у 12 пациентов с АЛПС, в возрасте от 5 месяцев до 19 лет, привела к полному и длительному ответу, что предполагает использование сиролимуса в качестве терапии 1-й линии как длительной нестероидной терапии [13].
Препарат сиролимус (рапамицин, SRL) – естественный макроциклический лактон, с 1999 года известен как иммуносупрессор, когда он начал использоваться для предотвращения отторжения почечного трансплантата [1]. Благодаря своей иммуносупрессивной и антипролиферативной активности в дальнейшем он нашел более широкое применение в различных областях медицины.
На клеточном уровне SRL является ингибитором мишени рапамицина млекопитающих (mTOR-I) – фосфатидилинозитолкиназы, которая интегрирует на себе ряд клеточных сигналов, исходящих от рецепторов инсулина, ростовых факторов и митогенов, тем самым обеспечивая регулирование клеточного роста и пролиферации. [32, 42, 60]. Механизм действия SRL отличается от других иммуносупрессантов, действующих исключительно за счет ингибирования синтеза ДНК. Являясь пролекарством, SRL связывается с цитозолольным белком FKBP12, образуя комплекс FKBP12/рапамицин (рисунок 1-2), и ингибирует активацию mTOR.
Известно, что лимфопролиферация при АЛПС происходит не только вследствие накопления ДНТ-клеток, неспособных к апоптозу, но и из-за высокой пролиферативной активности ДНТ и их моно-позитивных Т-клеток предшественниц in viv o [53]. Volkl и соавторы показали, что ДНТ - это не просто клетки, избежавшие апоптоза - они являются окончательно дифференцированными и обладают значительной митотической активностью, которая тесно связана с гиперактивацией AKT- и mTOR – путей. Лечение с использованием рапамицина устраняет повышенную пролиферативную активность не только в ДНТ-клетках, но и в их клетках-предшественниках CD4+ или CD8+ [71]. Таким образом, становится понятен механизм действия сиролимуса в процессе сокращения лимфопролиферации при АЛПС, однако его влияние на патогенез аутоиммунных проявлений остается до конца не выясненным. Существуют разнообразные гипотезы, например, что Fas-дефицитные аутореактивные В-клетки обходят отрицательную селекцию в герминативных центрах и претерпевают расширенную соматическую гипермутацию [31]. Рапамицин может непосредственно влиять на передачу сигналов в B-клетках или на их выживание [33], однако эти механизмы требуют дальнейшего изучения.
Тем не менее, продолжаются поиски новых методов лечения АЛПС. Недавно была опубликована статья об эффективном использовании тофацитиниба – ингибитора янускиназ в MRL/lpr мышиной модели АЛПС [75]. Авторы сосредоточили внимание на ДНТ-клетках как важном лабораторном признаке заболевания, и определили в качестве мишени JAK-STAT сигнальный путь с целью элиминации этой популяции лимфоцитов. Исследователи отметили эффективность монотерапии тофацитинибом, выразившуюся в сокращении лимфопролиферации, уменьшении содержания ДНТ-клеток, нормализации концентрации иммуноглобулинов и купировании аутоиммунных проявлений. Другие перспективные методы лечения появляются в прямой связи с новыми знаниями о молекулярных механизмах, лежащих в основе клинических проявлений АЛПС. Так, например, обнаружено, что in vitro IL-17 ингибирует FAS-индуцированную гибель клетки [10]. Полагают, что нейтрализация IL-17 улучшит апоптоз лимфоцитов при АЛПС. Было показано, что лечение анти-IL-17A антителами приводило к купированию аутоиммунных проявлений, сокращению лимфопролиферации и продлению жизни в мышиной модели АЛПС.
Многим пациентам с АЛПС в прошлом выполняли спленэктомию по поводу хронических рефрактерных цитопений, что в настоящее время делать не рекомендуется [24, 50]. В случае выполнения спленэктомии до установления диагноза необходимо проводить длительную антибиотикопрофилактику и продолжить вакцинацию. В диагностированных случаях АЛПС спленэктомия должна быть показана только пациентам с рефрактерными к любой терапии угрожающими жизни цитопениями. Следует отметить, что более чем у 50% пациентов с АЛПС возникали рецидивы цитопений после спленэктомии. По данным литературы, инвазивные бактериальные инфекции после спленэктомии наблюдались у 30–50% пациентов [49].
В тяжелых, рефрактерных случаях у пациентов с АЛПС следует рассмотреть вопрос о проведении трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Показаниями для ТГСК являются лимфомы, тяжелые и рефрактерные аутоиммунные цитопении, а также случаи гомозиготных и компаунд-гетерозиготных дефектов в гене FAS [6, 19, 62]. Тем не менее, опыт применения ТГСК при АЛПС ограничен несколькими опубликованными клиническими наблюдениями, а долгосрочные результаты еще предстоит оценить [70].
Иммунологические характеристики пациентов из группы АЛПС и дифференциальной диагностики
Поликлональное повышение концентрации IgG, IgA в сыворотке крови часто наблюдается при АЛПС. Для пациентов с АЛПС-фенотипом характерны разнообразные показатели содержания иммуноглобулинов от гипо-до гипергаммаглобулинемии, в зависимости от нозологии. Так, например, гипергаммаглобулинемия наблюдалась среди пациентов c RALD, АВЗ.
У большинства наших пациентов с АЛПС (n=21, 75 % случаев) отмечалось повышение одного или нескольких классов иммуноглобулинов: преобладало сочетание повышения IgA и IgG у 10 пациентов (36 %), IgA и IgE у 3 пациентов (11 %), IgA+IgG+IgE у 3 пациентов (11 %), изолированное повышение IgA – у 2 пациентов (7 %), IgA+IgG+IgM у 1 пациента (4%). Всего IgA был повышен у 20 пациентов, IgG - у 15 пациентов , IgE – у 8 пациентов, IgM – у 2 пациентов. Снижение IgM наблюдалось у 17 пациентов (61 %).
Учитывая разные возрастные нормы, пациенты для удобства сравнения IgA, IgG, IgM были поделены на возрастные подгруппы (таблица 3-7). Значимые различия в содержании иммуноглобулинов были выявлены только в старшей возрастной группе относительно IgG и IgA сыворотки крови.
Для наглядности данные таблицы 3-7 представлены в графическом виде (рисунок 3-7). Можно отметить, что среди пациентов с АЛПС более выражено повышенное содержание IgG, IgA во всех возрастных категориях. Среди пациентов с АЛПС подобным фенотипом чаще можно встретить повышенное содержание IgM.
Не отмечено связи снижения IgM с лимфопролиферативным синдромом у пациентов с АЛПС: в группе пациентов с низким IgM выраженность лимфопролиферациии составила с среднем 4,4 балла, в группе с нормальным IgM – 3 балла (р=0.2) (таблица 3-8). Возможно, необходимо большее количество наблюдений.
Иммуноглобулин E определялся не у всех пациентов. Поскольку он имеет другие возрастные диапазоны норм и высокие числовые значения по сравнению с другими иммуноглобулинами, то представлен отдельно в таблице 3-9.
Как видно из таблицы, наблюдаются значимые разбросы показателей содержания IgE в двух группах. Для пациентов с АЛПС были характерны более высокие значения IgE в сыворотке крови. Достоверные различия в содержании IgE были получены в возрастной группе старше 3 лет.
У 15 пациентов с АЛПС (54%) наблюдалось снижение CD19+. Изолировано CD19+ был снижен только у шести пациентов. У остальных отмечались разнообразные комбинации. Сочетанное снижение CD19+ и CD3+ за счет CD4+ и CD8+ отмечено у 5 пациентов; снижение CD3+ за счет CD4+, совместно с низкими показателями CD19+ наблюдалось у одного пациента; снижение CD4+и CD19+ у одной пациентки; повышение CD8+ и снижение CD19+ у одной пациентки, повышение CD8+ и CD19+ у одного пациента; повышение CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ наблюдалось у одной пациентки; повышение CD3+, CD8+,CD19+ - у одной пациентки; изолированное повышение CD19+ - у одного пациента; изолированное снижение CD8+ - у одной пациентки.
Проведено сравнение субпопуляций лимфоцитов групп пациентов с АЛПС и АЛПС-подобным фенотипом в зависимости от возрастных норм (таблица 3-10, рисунок 3-8).
Предшествующая симптоматика и терапия
Показаниями для назначения SRL явились: изолированный лимфопролиферативный синдром – 3 пациента (П1,4,7), изолированная аутоиммунная гемолитическая анемия (П. 14), сочетание лимфопролиферативного синдрома с гемопатиями - 18 пациентов, среди которых 6 пациентов имели трехростковую цитопению (П. 2, 5, 8, 9, 17, 22); 7 пациентов (П. 10, 11, 13, 15, 16, 20, 21) имели двухростковую цитопению; 3 пациента (П. 3, 12, 19) - аутоиммунную гемолитическую анемию; один пациент имел нейтропению (П. 6); иммунная тромбоцитопения наблюдалась у одного пациента (П. 18). Одна пациентка (П. 15) имела Кумбс-негативную (прямая проба Кумбса отрицательная), гиперрегенераторную, гипохромную анемию I степени.
Восемь пациентов (П. 1, 4, 6, 7, 10, 15, 18, 19) получили SRL в качестве препарата первой линии. Двум пациентам (П. 12, 16) сиролимус в качестве базовой терапии инициировали практически одновременно с ритуксимабом, в связи с тяжестью клинических проявлений. Другим пациентам ранее проводилась разнообразная иммуносупрессивная терапия, включая глюкокортикостероиды (ГКС), микофенолат мофетил (ММФ), высокодозовые внутривенные иммуноглобулины (ВВИГ), ритуксимаб, этопозид, циклоспорин, циклофосфамид, комбинированную полихимиотерапию (таблица 4-2).
Пациент 3, в дебюте своего заболевания наблюдался с диагнозом Т-клеточная лимфома, в течение 4 месяцев получал терапию по протоколу NHL-BFM 95 с частичным клиническим ответом в виде умеренного сокращения лимфопролиферации, нормализации показателей числа тромбоцитов, содержания гемоглобина, но лечение осложнилось развитием сепсиса и печеночной токсичностью. Через 3 месяца от окончания терапии пациент был обследован в связи с положительным семейным анамнезом на АЛПС, диагноз подтвержден, химиотерапия прекращена. Пациенту 11 в возрасте 1 года (до постановки диагноза АЛПС) в связи с цитопенией на фоне спленомегалии проведена спленэктомия, что не избавило его от последующего рецидивирующего течения заболевания в виде цитопений.
Основным показателем для назначения терапии SRL являлось отсутствие достаточного ответа на другую иммуносупрессию или рецидив заболевания при попытке отмены ГКС.
Схема предшествующей иммуносупрессивной терапии пациентов с АЛПС. Обозначения: синий квадрат – частичный ответ с рецидивом, черный квадрат – нет ответа, красный квадрат – частичный ответ с токсичностью. Полного долгосрочного ответа на терапию не было ни у одного пациента. ГКС – глюкокортикостероиды; ММФ – микофенолат мофетил; CHOP - (C)yclophosphamide (циклофосфамид); (H)ydroxydaunorubicin (доксорубицин), (O)ncovin (винкристин), (P)rednisone (преднизолон); ГКСФ – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; ВВИГ – внутривенный иммуноглобулин; CsA – циклоспорин А; протоколы NHL BFM 95, HLH-2004.
Сиролимус в терапии пациентов из группы дифференциальной диагностики
В данной группе попытка терапии сиролимусом предпринималась всего у 20 человек, однако в течение 12 и более месяцев сиролимус получили лишь 10 человек, их клинико-генетическая характеристика представлена в таблице 4.3. Показанием для назначения SRL явились: у четырех пациентов изолированный лимфопролиферативный синдром (П. 9, 12, 15, 17), у оставшихся 16 - сочетание лимфопролиферации и гемопатии.
Среди пациентов данной группы большинство получало ранее разнообразную иммуносупрессивную терапию, без достаточного ответа и контроля заболевания (таблица 4-4), только у троих пациентов (П. 2, 3, 13) сиролимус явился иммуносупрессивным препаратом первой линии.
Пациенты 4, 8 находятся на ранних сроках лечения ( 3 месяцев) и не включались в дальнейший анализ.
Возраст начала терапии SRL в группе пациентов с АЛПС-подобным фенотипом составил 84,25 ± 52,4 мес. Длительность терапии SRL составила от 1-50 месяцев, в среднем 13,36 ± 13,7 мес.
Доза препарата в данной группе также подбиралась под контролем минимальной концентрации препарата в крови, таблица 4-5.
Сиролимус начали получать 20 человек, и, как представлено в таблице 4-6, на разных (ранних) временных этапах терапия была отменена нескольким пациентам по причине недостаточной эффективности и в ряде случае токсичности.
В настоящее время терапию продолжают пять пациентов: два пациента (П. 4, 8) с длительностью терапии до 3 месяцев и три пациента (П. 5, 15, 16) - в течение более 12 месяцев.