Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 20
1.1. Ключевые данные этиологии и патогенеза эймериоза кур 20
1.2. Морфологическая характеристика возбудителя эймериоза кур 24
1.3. Эпизоотологические данные эймериоза кур 26
1.4. Иммунитет против эймерий 30
1.4.1. Иммунная система желудочно-кишечного тракта птиц 30
1.4.2. Гуморальный иммунный ответ при эймериозе кур 34
1.4.3. Роль клеточного иммунитета при эймериозе кур 38
1.4.4. Роль цитокинов в иммунном ответе при эймериозе кур 42
1.5. Диагностика эймериоза кур 48
1.5.1. Оценка степени поражений кишечника характерных для эймериоза кур 49
1.5.2. Молекулярно - биологические методы диагностики эймериоза кур 51
1.6. Средства профилактики эймериоза кур и лечения больной птицы 54
1.6.1. Дезинвазия 54
1.6.2. Химиопрофилактика эймериоза кур 55
1.6.3. Иммунопрофилактика эймериоза кур 58
1.7. Заключение по обзору литературы 64
Глава 2. Собственные исследования 67
2.1. Материалы и методы 67
2.1.1. Вакцинация цыплят аттенуированными вакцинами против эймериоза 70
2.1.2. Метод подсчета количества ооцист эймерий в помете кур 70
2.1.3. Выделение, концентрирование и накопление ооцист эймерий из помета кур 72
2.1.4. Патологоанатомическое вскрытие и оценка степени поражений слизистой оболочки кишечника кур характерных для эймериоза 73
2.1.5. Гистологические и гистоморфометрические методы исследования слизистой оболочки кишечника кур 78
2.1.6. Метод ПЦР-РВ для анализа уровня экспрессии генов цитокинов в слизистой оболочке кишечника кур 81
2.1.7. Иммуногистохимический метод оценки локального иммунитета кишечника кур после вакцинации против эймериоза 84
2.1.8. Оценка иммуногенности вакцин методом экспериментального заражения кур вирулентными эймериями 89
2.2. Результаты исследований 92
2.2.1. Вакцинация цыплят против эймериоза кур 92
2.2.2. Оценка динамики прироста живой массы птицы и конверсии корма после вакцинации 93
2.2.3. Динамика выделения ооцист эймерий, входящих в состав вакцин 95
2.2.4. Патологоанатомическое и гистоморфологическое исследование слизистой оболочки кишечника кур 97
2.2.5. Гистоморфометрический анализ функционального состояния слизистой оболочки кишечника кур 113
2.2.6. Анализ уровня экспрессии генов цитокинов в слизистой оболочке кишечника кур 119
2.2.7. Иммуногистохимическая оценка общего пула sIgA слизистой оболочки кишечника в поствакцинальный период 124
2.2.8. Содержание клеток-продуцентов sIgA в слизистой оболочке тонкого и толстого отделов кишечника кур после вакцинации 128
2.2.9. Создание биологической модели эймериоза кур для оценки эффективности исследуемых вакцин 132
Глава 3. Обсуждение результатов исследования 143
Глава 4. Заключение 159
4.1. Выводы 159
4.2. Практическое использование полученных научных результатов 162
4.3. Рекомендации по использованию научных результатов 164
Глава 5. Список используемой литературы 166
Приложения 181
- Ключевые данные этиологии и патогенеза эймериоза кур
- Иммунопрофилактика эймериоза кур
- Патологоанатомическое и гистоморфологическое исследование слизистой оболочки кишечника кур
- Создание биологической модели эймериоза кур для оценки эффективности исследуемых вакцин
Ключевые данные этиологии и патогенеза эймериоза кур
Эймериоз кур (Eimeriosis avium, кокцидиоз) – протозойная болезнь, вызываемая паразитами семи разных видов эймерий. По мнению Бакулина В.А., Вершина И.И., Кириллова А.И., Мишина В.С., Chapman H.D., Dalloul R.A., Lillhoj H.S., Williams R.B., среди паразитарных болезней, эймериоз кур является основной причиной высокой смертности и низких показателей продуктивности в промышленном птицеводстве [8, 12, 23, 25, 52, 59, 92, 134].
Возбудителями заболевания являются паразитические простейшие - эй-мерии, относящиеся к типу Apicomplexa, классу Sporozoa, отряду Coccidia, семейству Eimeriidae, роду Eimeria [8, 10, 12, 13, 26].
Цикл развития эймерий представлен двумя стадиями: эндогенной, протекающей в организме хозяина и экзогенной, проходящей во внешней среде.
Эндогенная часть цикла развития эймерий делится на два этапа:
1. Препатентный период – с момента попадания и проникновения возбудителя в эпителий кишечника до появления первых ооцист, период протекает скрытно без проявления клинических признаков болезни. По Кириллову А. И. и другим авторам, в зависимости от вида он может длиться 4-6 суток (E. acer-vulina – 97 часов, E. tenella - 118, E. maxima- 123, E. brunetti- 120, E. necatrix -138, E. praecox- 84, E. mitis - 101).
2. Патентный период - период выделения ооцист с пометом при исключении возможной реинвазии птицы, длится от 10 до 18 суток в зависимости от вида эймерии [8, 10, 12, 13, 23, 26, 35, 36].
В фундаментальных трудах по эймериозу кур авторы Бакулин В. А., Вершин И. И., Кириллов А. И., Кэлнек Б. У., Chapman H. D. описывают условия, необходимые для споруляции ооцист эймерий, которая проходит во в неш-ней среде в течение 24-96 часов при наличии кислорода, влажности и оптимальной температуры 18-29С [8, 10, 12, 23, 38]. При низких температурах время споруляции увеличивается. В зависимости от вида, ооцисты имеют круглую, овальную или яйцевидную форму, окруженную двухконтурной оболочкой, содержащей пигмент, цвет которого колеблется от слабожелтого до коричневого, у некоторых видов оболочка имеет серый или зеленоватый оттенок.
Инвазионная ооциста содержит четыре спороцисты, каждая спороциста формирует два спорозоита (рис. 1).
Заражение птиц происходит алиментарным путем в момент заглатывания спорулированных ооцист. Эндогенный цикл включает в себя 2-3 генерации бесполого (шизогония или мерогония) и половое (гаметогония) размножение. После проглатывания стенки ооцисты разрушаются в мускульном желудке, затем под действием химотрипсина и желчных солей в двенадцатиперстной кишке высвобождаются спрозоиты [8, 10, 12, 13, 23, 26, 35, 36].
Бакулин В. А., Вершин И. И., Кириллов А. И., Мишин В. С., Chapman H. D., Dalloul R. A., Lillhoj H. S., Williams R. B. и другие утверждают, что эймерии обладают тропностью к эпителиальным тканям и к определенным сегментам кишечника [8, 12, 23, 25, 38, 59, 91, 135]. Спорозоиты проникают в эпителиальные клетки слизистой оболочки или в подслизистую основу кишечника, где округляются и превращаются в трофозоиты. Затем наступает бесполое размножение. Ядро трофозоита многократно делится и образует шизонт I генерации, внутри которого формируются мерозоиты. В дальнейшем шизонт делится, и инвазированная эпителиальная клетка разрушается. Освободившиеся мерозоиты попадают в просвет кишечника и проникают в другие эпителиальные клетки.
Мерозоиты I генерации в свою очередь дают начало II генерации шизон-тов и мерозоитов. Мерозоиты последней генерации дают начало гамонтам и затем гаметоцитам.
Макрогаметоцит превращается в макрогамету без прогамного деления ядра, тогда как микрогаметоцит претерпевает множественное деление ядра, приводящее к формированию большого числа микрогамет. Оплодотворение макрогаметы происходит внутриклеточно, после чего зигота окружается оболочками и превращается в ооцисту. В дальнейшем ооциста выделяется с пометом во внешнюю среду, где проходит процесс спорогонии (рис. 2).
В среднем цикл развития в организме кур эймерии проходят за 7 дней [8, 10, 12, 13, 23, 26, 35, 36].
Цикл развития эймерий обеспечивает им высокую паразитическую эффективность. По мнению Кириллова А.И., теоретически каждая ооциста может дать начало 2,52 миллионам паразитических клеток.
Ооцисты высоко устойчивы к факторам внешней среды и к действию многих дезинфектантов [23].
По данным Вершинина И.И., Мишина В.С., Johnson W. T., Long, P.L., в развитии инвазионного процесса можно проследить несколько стадий [13, 26, 79, 93]. Рисунок 2 - Схема жизненного цикла эймерий [60]: 1 – спорулированная ооциста; 2 – спороциста; 3 – спорозоит; 4 – развитие шизонтов первой генерации, 5 – выход мерозоитов и развитие шизонта 2 генерации; 6 – развитие микрогамет, макрогамет; 7 – выход микрогамет и оплодотворение макрогамет, 8 – ооциста, 9 – ооциста неспорулированная. Стадии развития в окружающей среде 1 и 9; стадии бесполого размножения: 4 и 5; стадии полового размножения: 6 - 8.
Первая стадия клеточной реакции организма на проникновение эймерий соответствует препатентному периоду. Спорозоиты, проникая в эпителиоциты или глубже - в подслизистую оболочку кишечника, как в случае E. tenella и E. necatrix, размножаются бесполым путем (шизогония), что вызывает воспалительную реакцию окружающих тканей с пролиферацией ретикулоэндотели-альных элементов в собственную пластину слизистой оболочки кишечника.
Вторая стадия соответствует развитию клинических признаков болезни и приходится на процесс шизогонии эймерий, и формирования шизонтов второго и третьего поколения. Последние разрушают клетки эпителия и высвобождают мерозоиты [13, 26, 79, 93].
По мнению Крылова А. И., Мишина В. С., Chapman H. D., Johnson J., Reid W. M., Long, P. L., наиболее сильные повреждения наносят E. tenella, E. acervulina, E. brunetti и E. necatrix на второй стадии процесса. При этом, как отмечают многие исследователи, клиническое проявление инвазии зависит от иммунного статуса птицы, условий содержания и кормления, вида возбудителя и его вирулентности [22, 23, 25, 38, 80, 93].
Слизистая оболочка кишечника часто бывает повреждена на значительном протяжении, что во многом затрудняет, а порой делает невозможным абсорбцию и усвоение питательных веществ. Нарушаются белковый, жировой и углеводный обмены организма птицы [10, 88, 93].
При локализации паразитов в подслизистом слое (E. tenella и E. necatrix) отмечают сильное кровотечение и вслед за этим развитие гипохромной анемии. Наступают благоприятные условия для развития секундарной инфекции в кишечнике [10, 23, 80].
Классическая клиническая картина эймериоза, описанная в работах исследователей, проявляется диарей, часто с прожилками крови, частичками слизистой оболочки, угнетением, отказом от корма, перьевой покров птицы взъерошен, хвост опущен вниз [10, 12, 35, 36, 88, 93, 127].
В третью стадию патогенеза происходит угасание острых клинических признаков, ослабевает интоксикация. Наблюдают компенсацию нарушенных функций и постепенное выздоровление. Однако, в виду ослабленной резистентности организма хозяина возможны рецидивы заболевания или наслоение секундарной инфекции [8, 10, 52, 79, 93, 127].
Иммунопрофилактика эймериоза кур
Против эймериоза традиционно вакцинировали родительские племенные стада кур и в меньшей степени бройлеров и несушек.
На сегодняшний день по всему миру в обязательном порядке вакцинируют все племенное поголовье птицы при напольном типе содержании, а на территории Европейского союза активно вакцинируют бройлеров на экологически-чистых «зеленых» фермах, и «стандартных» бройлеров при высокой степени инвазии [116, 125, 135].
Эта тенденция объясняется несколькими причинами:
1. нежелательными побочными эффектами кокцидиостатиков на репродуктивную систему птицы, а также эмбриотоксичностью некоторых препаратов;
2. широкой распространенностью мультирезистентности эймерий к действующим веществам антикокцидийных препаратов.
Таким образом при отсутствии иммунизации против эймериоза, перед врачами предприятий сегодня стоит реальная угроза возникновения вспышки эймериоза в периоды острого стресса птицы (период вакцинаций птицы, перевод ремонтного молодняка в продуктивное стадо, период пика яйценоскости и др.) [106].
В настоящее время в мире существует около 20 вакцин против эймери-оза кур. Живые вакцины различаются включенным в них видовым составом ооцист и их типом (аттенуированные/ вирулентные), устойчивостью видов эй-мерий к кокцидиостатикам, методом применения [114, 115].
Целью вакцинации, по мнению Tellez G. et al., служит формирование у птицы иммунитета, достаточного для профилактики хронической инвазии, но при этом позволяющего накапливаться определенному количеству эймерий в кишечнике для развития полноценного локального иммунного ответа к эйме-риям [125].
После вакцинации живыми ооцистами, иммунитет у птицы формируется только после двух-, трехкратного естественного реинвазирования (3 неделя после вакцинации). Выделяемые с пометом после вакцинации ооцисты эйме-рий должны иметь условия для споруляции в подстилке, после чего цыплята, склевывая инвазионные ооцисты, заражаются повторно. Для успешного спо-рулирования ооцист должны быть соответствующие условия температуры и влажности. Если в птичнике подстилка сухая, то процесс споруляции может задерживаться или нарушаться [51].
Неаттенуированные вакцины против эймериоза кур содержат немоди-фицированные лабораторные либо полевые штаммы эймерий, у которых сохранена естественная вирулентность [50]. Вирулентные живые вакцины вызывают некоторые поражения слизистой оболочки кишечника. Chapman H. D. считает, что это хорошо стимулирует выработку активного иммунитета у птиц [53]. Однако такие поражения предрасполагают к возникновению некротического энтерита, вызываемого Clostridium perfringens, что вызывает снижение продуктивности птицы [23, 92]. Таким образом, патогенность вирулентных вакцин может часто превышает иммуногенность, кроме того, они могут занести в стадо новые виды эймерий [115].
Вирулентные вакцина относятся к вакцинам старшего поколения и содержат чувствительные к кокцидиостатикам эймерии. Это было необходимо, чтобы сдержать активное развитие вакцинных вирулентных штаммов эймерий применением лечебно-профилактических средств против эймериоза и не допустить вспышки заболевания на предприятии после вакцинации [125, 134].
Аттенуированные вакцины включают в свой состав ооцисты эймерий с искусственно сниженной вирулентностью. Из множества предложенных методов аттенуации эймерий, в производстве коммерческих вакцин используется лишь два из них – пассаж паразитов через куриные эмбрионы (например, E.tenella в вакцине «Ливакокс») и селекция быстроразвивающихся штаммов (все виды эймерий в «Паракокс») [135].
После вакцинации повреждение кишечника обычно незначительное и н е отражается на продуктивности птицы. Следовательно, риск возникновения вспышки эймериоза после вакцинации и некротического энтерита минимален.
Основным преимуществом живых вакцин является их способность изменять уровень резистентности к антикокцидийным препаратам в циркулирующей на бройлерной птицефабрике популяции эймерий. Есть несколько сообщений об этой особенности вакцин [38, 51, 98, 108]. Стабильность этой восстановленной чувствительности эймерий недостаточно изучена. Тем не менее, подход вакцинации для оптимизации эффективности антикокцидийной программы очень важен, и наряду с простой ротацией, вакцинация бройлеров -единственный известный метод, помогающий снизить долю резистентных паразитов [51]. Экономически выгодно использовать вакцины, содержащие только виды актуальные для данной географической зоны. Кроме того, живые вакцины могут расширить видовой состав эймерий, циркулирующий на птицефабрике. Поэтому в Европе все большую популярность завоевывает анализ с помощью ПЦР, позволяющей дифференцировать виды эймерий на конкретной птицефабрике [58].
Однако у живых вакцин также есть и недостатки - ограниченный срок годности и высокие издержки производства, связанные с аттенуацией эйме-рий. Кроме того, накапливать живые ооцисты и производить необходимое количество материала для вакцинации миллиардов голов птицы ежегодно дорогостоящий и трудозатратный процесс. Поэтому появилась необходимость в разработке и создании протективных рекомбинантных вакцин [126].
Протеины микронем являются общими для паразитов типа Apicomplexa и отвечают за адгезию и проникновение в клетку хозяина. Ryan et al. идентифицировали и клонировали несколько генов, кодирующих протеины микронемы E. tenella [113]. Эти протеины - EtMIC2 и EtMIC4 показали протектив-ный эффект, а при вакцинации EtMIC2 геном in ovo, авторы отметили стимулирование протективного локального иммунитета в кишечнике против E. tenella и E. acervulina [64, 67]. EtMIC1 и EtMIC2 индуцировали как гуморальный, так и клеточный ответы [126]. Dalloul et al. применили CpG олигодезок-сирибонуклеотиды3, содержащие неметелированные мотивы4, совместно с MIC2 антигеном in ovo, и увидели иммунопротективный эффект [59].
Усиление иммунного ответа хозяина также достигли Ding et al. после активации куриного гена, кодирующего синтез ИЛ-2 [64]. Введение цитоки-нов: ИЛ-8, ИЛ-16, ФРО-4 и лимфотактина совместно с вакцинацией показало существенное снижение выделения ооцист с пометом и увеличение продуктивности птицы [126].
Кроме того, ученые усиленно изучают профилин эймерий в качестве объекта для создания рекомбинантных субъединичных вакцин. Профилин входит в структуру актинового цитоскелета эукариотических клеток [114].
Использование вирусов в разработке векторных вакцинах против эйме-риоза считается сегодня перспективным направлением. В качестве вектора рассматривают вирус оспы птиц и вирус герпеса индеек, в виду их способности вмещать необходимый размер для экспрессии множественных генов эйме-рий, которые обеспечат защиту против различных видов паразита [126].
Субъединичные вакцины на основе протеинов, пептидов или фрагментов возбудителей вызывают менее эффективный протективный иммунный ответ, по сравнению с вакцинами, содержащими цельный микроорганизмы. Эффективность рекомбинантных вакцин во многом ограничена в виду не только определенного времени экспрессии протеинов эймерий в течение различных стадий жизненного цикла, но и в отсутствии перекрестного иммунитета между видами эймерий. Добавление адъювантов может помочь обеспечить необходимый уровень иммуностимуляции для усиления протективного иммунитета при повторном заражении [114, 116, 137].
В 2016 году ученые попробовали использовать спорозоиты эймерий в роли вектора в вакцине против токсоплазмоза мышей и птиц и добились успешных результатов [123]. Эта разработка открыла возможность использования эймерий в составе живых вакцин для доставки гетерологичных антигенов и экспрессии чужеродных белков. Таким образом, сегодня эймерии уже выступают в роли поливалентных вакцинных векторов, которые способны защитить животных от ряда патогенов [97].
Таким образом, иммунопрофилактика на сегодняшний день – основной метод контроля эймериоза в племенных стадах кур и самое перспективное направление для профилактики заболевания бройлеров. Сейчас применение вакцин на бройлерных стадах отмечается лишь в 5% и менее процентах случаев, что связано с высокой стоимостью вакцин, недостижением ожидаемых результатов в связи с неправильным применением вакцины или неполным знанием механизмов формирования иммунитета кур при эймериозе [126].
Однако многие авторы уверены, что вакцинация птицы против эймери-оза – единственный путь для решения серьезной проблемы мультирезистент-ности эймерий к антикокцидийным средствам в связи с уникальным свойством вакцин восстанавливать чувствительность эймерий к препаратам. А также вакцинация способна удовлетворить требования потребителей по сокращению использования любых антимикробных препаратов при выращивании птицы.
Патологоанатомическое и гистоморфологическое исследование слизистой оболочки кишечника кур
При аутопсии цыплят на 7 сутки после вакцинации видимых патологических изменений в тонком и толстом кишечнике не выявили ни в одной из групп.
На 14 сутки после вакцинации в группе «Ливакокс Q» обнаружили катаральный дуоденит, катаральный илеит и катарально-геморрагический тифлит. Степень поражения слизистой оболочки кишечника по бальной системе оценки патологоанатомических поражений Джонсона и Рейда, характерных для эймериоза, составила 1 балл по E. tenella.
В группе, вакцинированной «Эвалон», на 14 сутки обнаружили катаральный дуоденит, катаральный илеит и катаральный тифлит. Изменений слизистой оболочки, характерных для эймериоза обнаружено не было.
На 23 сутки после вакцинации обнаружили выраженные признаки репликации вакцинных штаммов эймерий в кишечнике. Так у цыплят из группы «Ливакокс Q» выявили гиперемию слизистой оболочки и белые бляшки в двенадцатиперстной кишке, немногочисленные кровоизлияния в тощей кишке, игольчатые кровоизлияния на серозной оболочке и слизь оранжевого цвета, увеличение в размере и гиперемию пейровых бляшек в подвздошной кишке, точечные кровоизлияния в слепых отростках. Вышеперечисленное отображает признаки развития всех видов эймерий, входящих в состав вакцины «Ли-вакокс Q». Степень поражения слизистой оболочки кишечника по системе оценки Джонсона и Рейда составила 1 балл – E. acervulina, E. necatrix, 2 балла – E. maxima, 1 балл – E. tenella.
У цыплят из группы «Эвалон» на 23 сутки наблюдали катаральный дуоденит, катарально-геморрагический еюнит, слизь оранжевого цвета в подвздошной кишке с немногочисленными точечными кровоизлияниями на серозной оболочке, увеличение в размере и гиперемию пейровых бляшек в подвздошной кишке. Степень поражения слизистой оболочки кишечника по бальной системе оценки патологоанатомических поражений Джонсона и Рейд составила 1 балл – E. acervulina, E. necatrix, 1 балл – E. maxima [80].
Оценку состояния тонкого (двенадцатиперстная, тощая, подвздошная кишки) и толстого отделов (слепые отростки и прямая кишка) кишечника кур проводили путем изучения гистологических срезов, принимая во внимание основные параметры, отобранные на основе отечественной и зарубежной научной литературы [23, 33, 91, 114].
Результаты гистологического исследования тонкого и толстого кишечника вакцинированных групп описаны ниже. 1. Гистокартина тонкого отдела кишечника
Контрольная группа (n=5): гистоархитектоника тонкого отдела кишечника (двенадцатиперстной, тощей и подвздошной кишок) цыплят на 7, 14 и 23 дни исследования была сохранена и характерна для конкретного периода развития птицы. Серозная оболочка, мышечный и подслизистый слои хорошо сохранены, слизистая оболочка хорошо выражена, эпителиальные призматические клетки имели четкую структуру, бокаловидные клетки обладали разной степенью активности. На 14 и 23 сутки в образцах тощей кишки выявили умеренную инфильтрацию подслизистой оболочки клетками лимфоидного ряда. Гистокартина двенадцатиперстной кишки 7 сутки, группа «Ливакокс Q»: серозная оболочка разрыхлена, в мышечной стенке имелись слабоокрашенные пустоты, указывающие на признаки отека. Визуализировали истончение подслизистого слоя с обилием клеток лимфоидного ряда. Вышеперечисленное является предпосылкой к атрофиче-ским, а в дальнейшем и к некротическим процессам в кишечнике.
Общая структура слизистой оболочки ворсин сохранена, однако присутствовала десквамация апикальных частей некоторых ворсин (у двух из пяти в одном поле зрения). Реснитчатый слой был частично деформирован в связи с повышенной секрецией густой слизи бокаловидными клетками. Просвет последних заполнен эозинофильно окрашенным секретом. Подобная реакция слизистой оболочки может быть ответом на вакцинацию в суточном возрасте и постепенной колонизации вакцинных эймерий в эпителии слизистой оболочки кишечника.
7 сутки, группа «Эвалон»: выявили выраженную лимфоидную пролиферацию подслизистого слоя. Структура ворсин слизистой оболочки в целом была сохранена, редко встречались ворсины с десквамацией эпителия апикальной части. Визуализировали умеренное количество слизи на поверхности реснитчатого эпителия. Таким образом, признаки воспалительной реакции и формирования лимфоцитарного иммунного ответа в данном случае были выражены умеренно.
14 сутки, группа «Ливакокс Q»: визуализировали диффузное скопление лимфоидных клеток в подслизистом слое. В эпителиальном слое большое количество пикноморфных клеток с белой неокрашенной цитоплазмой и ярким базофильно окрашенным ядром неправильной формы. Апоптоз, вероятно, был вызван направленным действием цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров в результате формирования иммунного ответа против вакцинных эймерий. Визуализировали небольшое количество эпителиальных клеток, пораженных эймериями.
14 сутки, группа «Эвалон»: выявили динамические изменения в гисто-архитектонике двенадцатиперстной кишки. Они свидетельствуют о дальнейшем развитии воспалительных защитных процессов с появлением апоптозных клеток и нарастании лимфоцитарной реакции - диффузное скопление лимфо-идных клеток в подслизистом слое.
23 сутки, группа «Ливакокс Q»: выявили признаки дистрофии эпителиального слоя слизистой оболочки. Присутствовало большое количество бокаловидных клеток с различной степенью активности. Визуализировали существенное количество пикноморфных клеток, а также митотически делящихся клеток в эпителиальном слое. Вероятно, это являлось результатом декомпенсации большого числа погибших клеток эпителия и выражалось в ускорении кинетики смены клеток эпителия. В нескольких полях зрения визуализировали энтероциты, пораженные эймериями (рис. 14, в сравнении с контрольной группой – рис. 15). Вокруг зараженных клеток визуализировали инфильтрации клетками лимфоидного ряда, что свидетельствовало о нарастании локального иммунного ответа слизистых оболочек.
Создание биологической модели эймериоза кур для оценки эффективности исследуемых вакцин
При достижении цыплят кросса Кобб 500 (n=10) возраста 15 суток, проводили серии заражения путем перорального введения суспензии, содержащей спорулированные ооцисты. Концентрации ооцист в суспензии указаны в таблице 10.
Через 7 суток после первого заражения ежедневно выполняли копроло-гические полуколичественные исследования для мониторинга начала выделения ооцист эймерий с пометом. В течение 8 дней после первичного заражения в исследуемом помете ооцисты не обнаружили. В связи с чем, произвели повторные заражения на 24, 25 и 26 сутки жизни цыплят.
На 10 сутки после последнего заражения цыплят зарегистрировали обильное выделение ооцист эймерий. Также наблюдали угнетенное поведение четырех цыплят. С этого момента собирали помет от цыплят, накапливали, концентрировали и выделяли ооцисты для последующего определения дозы ооцист эймерий, вызывающей поражения слизистой оболочки кишечника на 2 балла по Джонсону и Рейду, а также для последующего экспериментального заражения вакцинированных групп.
По описанным в разделах 2.1.3. и 2.1.8. методам получили материал для последующего заражения кур и определения дозы, вызывающей поражения на 2 балла по Джонсону и Рейду. Подсчет концентрации ооцист эймерий выполняли в камере Горяева (рис. 43).
Определяли процент спорулированных ооцист. Количество спорулиро-ванных ооцист составило в пределах 80%.
Для определения заражающей дозы ооцист эймерий, вызывающей поражения слизистой оболочки кишечника на 2 балла по Джонсону и Рейду приобрели кур кросса Хайсекс Браун (n=25). Птица не имела контакта с эймери-ями и не была вакцинирована против эймериоза кур.
При достижении возраста 14 недель разделили кур на 5 групп по 5 голов. Провели экспериментальное заражение спорулированными ооцистами эйме-рий, выделенных от цыплят кросса Кобб 500. Доза при заражении каждой группы указана в таблице 11.
С 7 суток после заражения вели копрологические исследования помета на предмет наличия ооцист эймерий. На протяжении 2 недель не обнаружили увеличения выделения ооцист эймерий с пометом зараженных кур и не зарегистрировали клиническое проявление эймериоза. Поэтому мы продолжили серию заражений кур.
Наблюдение вели еще в течение 30 дней, однако симптомы эймериоза так и не зарегистрировали - куры не выделяли ооцисты эймерий с пометом, а также не было выявлено каких-либо характерных для эймериоза клинических признаков.
В связи с этим мы сделали вывод, что экспериментальное заражение кур Хайсекс Браун в возрасте 14 недель повышенными дозами ооцист эймерий не удалось в связи с низкой вирулентностью последних. Вероятно, ооцисты эй-мерий, выделенные из проб помета различных птицефабрик, обладали слабой вирулентностью на фоне постоянно применяемых кокцидиостатических препаратов, также возможно накопление этих ооцист на бройлерах привело к еще большему снижению их вирулентности.
Для наработки высоковирулентных ооцист эймерий провели массовый отбор проб помета с птицефабрик во время регистрации вспышки эймериоза.
Вышеописанными в пункте 2.1.3. методами накопили и изолировали оо-цисты из помета и определили заражающую дозу, вызывающую поражения слизистой оболочки кишечника на 2 балла по Джонсону и Рейду. Провели экспериментальное заражение 5 групп кур по 5 голов различными дозами с последующим их вскрытием и подсчетом баллов повреждений кишечника в каждой группе (табл. 12).
Определили, что заражающая доза составляет 1 мл суспензии с концентрацией 16,5 10 ооцист вирулентных эймерий на 1 мл.
Используя полученный материал с высоковирулентными ооцистами эй-мерий, провели экспериментальное заражение вакцинированных против эйме-риоза экспериментальных групп, а также контрольную группу кур Хайсекс Браун в возрасте 16 недель.
Предварительно смоделировали состояние стресса у всех групп кур, которое присутствует в этот период жизни при промышленном содержании кур во время перевода ремонтного молодняка кур в племенное стадо и осуществления в связи с этим ряда вакцинаций.
Учет результатов экспериментального заражения провели на 6 сутки после заражения с использованием бальной системы Джонсона и Рейда. В период от экспериментального заражения и до вскрытия птицы не зарегистрировали падежа ни в одной из групп, из клинических признаков наблюдали лишь небольшое угнетение птицы, фекалии с небольшими прожилками крови в контрольной группе и группе «Ливакокс Q».
Результаты патологоанатомического вскрытия кишечника приведены в таблицах 13-15.
Из таблиц видно, что общий индекс поражений кишечника составил для контрольной группы 3,4 балла; для группы «Ливакокс Q» - 2,7; для группы «Эвалон» - наименьший балл – 0,5.
Для интерпретации значения полученных баллов, принято считать, что при общем среднем индексе равным 2 и выше и наличии при этом поражений слизистой оболочки слепых отростков у 20% птиц (E. tenella) и/или при наличии поражений двенадцатиперстной, тощей и подвздошной сегментов тонкого кишечника у 80% птиц (E. acervulina, E. maxima), необходимо срочно начать лечение для предупреждения падежа птицы. Если общий средний индекс поражений слизистой кишечника составляет от 1 до 2, требуется повторить вскрытие через 5-7 дней и тщательно отслеживать изменения степени поражений [38, 61]. В случае, когда общий средний балл меньше 1 - умеренные или незначительные поражения единично встречаются в стаде, при таком значении ситуация с эймериозом считается под контролем.
В нашем исследовании в контрольной группе зарегистрировали поражения слепых отростков кишечника, равные 2 баллам и выше у 60% птицы (рис. 44), 1 баллу у 40% птицы; поражения двенадцатиперстной кишки, равные 1 баллу - у 40% птицы, а подвздошной кишки – у 100% птицы.
Таким образом, экспериментальное заражение контрольной невакцини-рованной группы привело к обширным поражениям слепых отростков и умеренным поражениям (1 балл по Джонсону и Рейду) двенадцатиперстной и подвздошной сегментов тонкого кишечника.
В группе «Ливакокс Q» выявили 42% птицы с поражениями слепых отростков кишечника, равные 2 баллам и выше (рис. 45-47), 100% птицы с поражениями подвздошной кишки, равные 1 баллу, и 42% птицы с поражениями двенадцатиперстной кишки - 1 балл.