Введение к работе
Актуальность проблемы
Трипаносоматиды - это одножгутиковые простейшие, ведущие облигатно паразитический образ жизни. Вместе с их ближайшими родственниками, двужгутико-выми бодонидами и криптобиями, трипаносоматид объединяют в хорошо очерченную группу кинетопластид, которой в современных системах эукариот придается статус класса или типа. Основным признаком "кинэтопластидной" организации клетки служит наличие в ней кинетопласта - клеточной органеллы, появившейся в результате уникальной эволюции митохондриального аппарата этих про-тистов. В кинетопласте сконцентрирована вся или почти вся специфически организованная митохондриальная ДНК (Каллиникова, 1977).
На сегодняшний день семейство Trypanosomatidae насчитывает по разным данным от 750 до 900 видов жгутиконосцев (Подлипаев, 1990), объединяемых в 10 родов. Круг хозяев трипаносоматид необычайно широк. В процессе эволюции эти жгутиконосцы освоили в качестве хозяев простейших и высшие растения, членистоногих и позвоночных животных. Однако наибольшей известностью трипаносоматиды пользуются, прежде всего, благодаря тому, что целый ряд их представителей может вызывать опасные заболевания человека, домашних животных и культурных растений. Так, по статистике ВОЗ, более трети населения земного шара проживает в районах неблагоприятных по различным лейшманиозам и трипа-носомозам, и более четверти миллиарда человек ежегодно страдают от заболеваний, возбудителями которых являются жгутиконосцы трипаносоматиды из родов Leishmania и Trypanosoma.
По вполне понятным причинам на протяжении практически всей истории изучения трипаносоматид внимание исследователей фокусировалось, главным образом, на тех представителях семейства, которые имеют наибольшее практическое значение, то есть на трипаносомах и лейшманиях. В результате подавляющая часть трипаносоматид долгое время оставалась за чертой внимания ученых. Кроме того, до середины 60-х годов нынешнего столетия (до выяснения природы кинетопласта) связь трипаносоматид с какими-либо группами свободноживущих простейших также не была установлена. Именно в таких условиях была предложена (Leger, Dubosq, 1910) и получила в дальнейшем свое развитие (Догель, 1962; Ноаге, 1972; Baker, 1974) классическая гипотеза происхождения трипаносоматид. В отсутствии палеонтологических данных исследования филогении трипаносоматид, строились, главным образом, на данных их сравнительной морфологии, анализе особенностей жизненных циклов и характере распределения их представителей по тем или иным группам хозяев.
Начало накопления новых данных по морфологии трипаносоматид и тонким механизмам их взаимоотношений с хозяевами можно датировать серединой 60-х годов, то есть временем начала интенсивного использования методов просвечивающей электронной микроскопии в исследовании протистов. В 1976 году выходит в свет первый том фундаментального труда "Биология кинетопластид" (1976-1979), в написании которого приняли участие практически все ведущие специалисты, работающие в данной области. В этой работе впервые характеристика как самой группы, так и отдельных ее представителей базируется на данных об их ультратонкой организации. Вероятно, уже на этом этапе можно было ожидать и нового осмысления теоретических вопросов эволюции и филогении кинетопластид. Предпосылками этого служили, с нашей точки зрения, признание филогенетической целостности кинетопластид как свободноживущих, так и паразитических, и достаточно многочисленные данные по сравнительной цитологии различных представителей группы. Однако такого развития эта работа не получила, а ее авторы подтвердили приверженность традиционным представлениям о происхождении и эволюции группы. На протяжении последующих 15 лет вопрос о филогении
- 4 -трипаносоматид в специальной литературе вообще не рассматривался. Между тем накапливающиеся данные стали все чаще вступать в противоречие с существующей гипотезой. Так, обращение, согласно ее положениям, к "низшим" гомок-сенным трипаносоматидам из насекомых, как к предкам трипаносом и леишманий в многочисленных исследованиях не только ни разу по настоящему себя не оправдало, но в ряде случаев спровоцировало появление ошибочных выводов (Vickerman, 1994). Кроме того, ни один из гипотетических организмов, занимающих узловые позиции на филогенетическом древе трипаносоматид (Baker, 1974), так и не был найден в природе.
Таким образам, к настоящему времени вопрос о необходимости пересмотра концепции происхождения и эволюции трипаносоматид стал очевиден.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы заключается в экспериментальном и теоретическом обосновании новой гипотезы происхождения трипаносоматид. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Н критически проанализировать основные положения гипотезы происхождения трипаносоматид Леже-Гоара-Бакера, для чего:
а) исследовать распределение паразитических кинетопластид по различ
ным группам хозяев;
б) исследовать чередование морфологических форм в жизненных циклах
гомоксенных и гетероксенных трипаносоматид;
в) провести сравнительное исследование способов развития трипаносома
тид в их хозяевах;
Ш провести сравнительное исследование ультратонкой организации кинетопластид, включив в число объектов исследования представителей всех основных групп этих жгутиконосцев;
И сформулировать и обосновать гипотезу происхождения кровепаразитизма у кинетопластид
Ы сформулировать и обосновать гипотезу происхождения трипаносоматид и определить вероятные пути их эволюции
Научная новизна
С использованием светового, просвечивающего и сканирующего электронных микроскопов изучена морфология 29 видов кинетопластид, относящихся к трем отрядам, трем семействами и 12 родам. В ходе исследования описаны 1 новый род и 5 новых видов трипаносоматид и 1 новый вид свободноживущих криптобий. Морфология 20 видов исследована впервые. Выявлены основные тенденции в эволюции покровов, двигательного и ротового аппаратов кинетопластид. Впервые описан и исследован митоз свободноживущих кинетопластид. Показано, что ближайшей к свободноживущим жгутиконосцам группой трипаносоматид являются кровепаразиты, а не гомоксенные трипаносоматиды кишечного тракта насекомых. Исследовано разнообразие жизненных циклов гомоксенных трипаносоматид насекомых. Кроме традиционного пути развития, доказана возможность их развития в передней кишке насекомых, в гемолимфе и слюнных железах хозяев. На основании данных сравнительной морфологии, характеристики жизненных циклов и особенностей распределения паразитических кинетопластид по различным группам хозяев предложены гипотеза возникновения кровепаразитизма у кинетопластид и гипотеза происхождения трипаносоматид.
Теоретическая и практическая ценность работы.
Предложенные гипотезы происхождения трипаносоматид и возникновения кровепаразитизма у кинетопластид вносят существенные изменения в современную концепцию возникновения и эволюции паразитизма у эукариот. Принципиально новым является вывод об исходной гетероксенности трипаносоматид и первичности кровепаразитов по отношению к кишечным паразитам в этой группе ки -
нетопластид. Исключительная важность трипаносоматид - возбудителей опасных заболеваний человека, животных и растений - естественно выводит вопрос о происхождении группы за рамки чисто теоретического интереса. Прежде всего, это находит отражение в возможности осмысленного, дифференцированного подбора объектов для многочисленных экспериментальных исследований трипаносом и лейшманий. В качестве ближайшей "внешней группы" для трипаносоматид, в молекулярно биологических или иных исследованиях, предлагается использовать кровепаразитических криптобий. Среди трипаносоматид сохранение наиболее близких к амцестральной группе признаков следует ожидать у кровепаразитических трипаносом, а не у представителей группы "низших" трипаносоматид - гомок-сенных паразитов насекомых. Материалы работы могут быть использованы в учебных курсах по паразитологии, зоологии и цитологии в высших учебных заведениях.
Материал и методы
Материал для данной работы был собран в период с 1982 по 1997 гг., главным образом на территории Псковской и Ленинградской областей России. Основу исследования культуральных форм трипаносоматид составила работа с оригинальной коллекцией живых культур жгутиконосцев, создаваемой при непосредственном участии автора на базе лаборатории протозоологии ЗИН РАН.
Изучение паразитических кинетопластид в природе было сопряжено с оригинальными фаунистическими исследованиями. Всего на наличие этих жгутиконосцев было проверено более 5000 особей их потенциальных хозяев из различных групп растений и животных. Определение полужесткокрылых насекомых - хозяев трипаносоматид было проведено д.б.н. И.М. Кержнером, которому мы приносим искреннюю благодарность. В процессе фаунистических исследований был описан новый род трипаносоматид - Proteomonas (Подлипаев, Фролов, Колесников, 1990), 5 новых видов трипаносоматид: Blastocrithidia miridamm, Leptomonas mycophilus, Phytomonas nordicus, Proteomonas brevicula, P.inconstans (Подлипаев, Фролов, 1987; Фролов, Малышева, 1993; 1993; Подлипаев, Фролов, Колесников, 1990; Фролов, Скарлато, 1991) и 3 вида были впервые обнаружены на территории России: Blastocrithidia familiaris, Leptomonas jaculum, L pyrrhocoris (Фролов, 1987а,б; Фролов, Скарлато, 1989; 1995). Совместно с А.П. Мыльниковым и М.Н. Малышевой описан новый вид свободноживущей криптобий Dimastigella mimosa (Фролов, Мыльников и Малышева, 1997). Часть материала, использованного в работе, в виде живых культур жгутиконосцев или в фиксированном состоянии была предоставлена нам российскими и зарубежными коллегами
Культивирование кинетопластид
Культивирование свободноживущих кинетопластид осуществлялось в стерильных чашках Петри при комнатной температуре. В качестве основной среды для выращивания бодонид и криптобий использовались среда Пратта и церофиловая среда.
Стандартное культивирование изолятов трипаносоматид осуществлялось в стеклянных пробирках объемом 15 мл, с использованием ватно-марлевых пробок. Объем среды составлял 3 мл. Все Crithidia, Proteomonas и Herpetomonas muscarum muscarum успешно культивируются на среде ГКДЭ или BHI {Brain heart infusion) фирмы Sigma. Культуры пересевались раз в месяц После пересева культуры на трое суток помещали в термостат при 24 С, а затем в холодильник. Все Leptomonas, Herpetomonas sammuetpesoai, изоляты Phytomonas spp., и Endotrypanum sp. культивируются на двухфазной среде FYTS. Изоляты Phytomonas и Endotrypanum не переносят низких температур, поэтому весь процесс их культивирования протекает в термостате при 24 С. Культивирование трипаносом осуществлялось на двухфазной среде, содержащей кровь, аналогичной
классической среде NNN (Novy et al., 1907). На плотной питательной среде ГКДЭ получали клоны гомоксенных трипаносоматид насекомых (Хаецкий, 1982).
Методы обработки материала для световой микроскопии
Все материалы, использованные в работе, были получены на двух марках световых микроскопов. В полевых условиях использовали отечественный МБИ-3 с фазово-контрастным устройством. В стационарных условиях применяли микроскоп Jenoval-contrast с фазово-контрастным устройством и фотонасадкой. Жгутиконосцев исследовали in vivo или на сухих мазках, окрашенных по Рома-новскому-Гимза.
Методы обработки материала для электронной микроскопии^
Для просвечивающей электронной микроскопии кусочки внутренних органов и тканей зараженных хозяев или осажденных центрифугированием из культур жгутиконосцев помещали в 1.5-2 %-ный глутаральдегид в 0.1 М какодилатном буфере и фиксировали 1.5-2 ч при 0 С. Промывку объектов проводили в 0.1 М какодилатном буфере, содержащем 5% сахарозы -1 ч. Затем материал постфиксиро-вали 2%-ным Os04 в 0.1 М какодилатном буфере (1 ч., 0 С), обезвоживали в спиртах и пропиленоксиде и заключали в смесь аралдита с эпоном. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-III, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата (1 ч) и цитратом свинца (5 мин) и изучали в электронных микроскопах JEM 100 С и JEM100 СХ.
Для сканирующей электронной микроскопии материал фиксировали 3%-ным глутаральдегидом, постфиксировали 2%-ным OsC>4, дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, сушили методом перехода критической точки С02 в аппарате Hitachi 21РС32. Препараты напыляли платиной и просматривали в электронном микроскопе Hitachi S570.
Некоторые компьютерные методы обработки материала, использованные в работе^
Текст диссертации набран в редакторе Mikrosoft Word v. 7.0 и распечатан на принтере HP DeskJet 870Cxi. Графические работы: рисунки и ряд схем выполнены в графическом редакторе Corel Xara v.1.1 компании Xara Ltd. Для трехмерной реконструкции органелл использовали электронно-граммы их серийных срезов. Негативы сканировали ручным сканером Primax Hand Scanner 256. Затем изображения импортировали в программу Corel Xara 1.1, где снимали контурные копии необходимых структур и строили 3D модель объекта (Фролов и др., 1997). Компьютерная реконструкция филогенетических деревьев, основанная на анализе дискретных (0-1), главным образом, морфологических признаков, выполнена с использованием пакета программ Phylip 3.5 (Felsenstein, 1981; 1985).
Апробация работы.
Основные материалы диссертационной работы были представлены и доложены на Всесоюзном совещании "Зоологическая систематика и филогения" (октябрь 1983 г., Ленинград), на отчетных сессиях ЗИН РАН по итогам работ за 1989, 1990, 1991,1995, 1996 г.г., на ежегодных чтениях памяти академика Е.Н. Павловского в 1992 г., на пятом делегатском съезде Всесоюзного общества протозоологов (сентябрь 1992 г., Витебск), на заседании С.-Петербургского отделения Общества протозоологов (февраль 1994 г.), на втором Международном симпозиуме по биологии свободноживущих, гетеротрофных жгутиконосцев (август 1994 г., С. Петербург).
По теме диссертации опубликовано 45 работ
Структура и объем работы
Диссертация состоит из двух томов. Первый том (265 страниц) объединяет введение, раздел материал и методы, четыре главы результатов и их обуждения, выводы, список литературы, содержащий 255 названий, (из них 57 на русском языке) и благодарности. Второй том включает иллюстративный материал: 5 таблиц и 144 рисунка.