Морфофункциональные и иммунологические аспекты взаимоотношений в системе паразит – хозяин: цестоды - рыбы Кутырев Иван Александрович

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. История изучения иммунологических аспектов взаимоотношений в системах «паразиты – хозяева»

ГЛАВА 2. Материалы и методы 35

2.1. Материалы для исследований 35

2.2. Инкубирование плероцеркоидов цестод 38

2.3. Сканирующая электронная микроскопия 39

2.4. Трансмиссионная электронная микроскопия 39

2.5. Иммуцитохимия 40

2.6. Биохимическое исследование простагландинов

2.6.1. Подготовка проб для выявления и количественной оценки проста-гландинов 42

2.6.2. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография c ультрафиолетовым детектированием (ОФ-ВЭЖХ-УФ) 42

2.6.3. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с детектированием на масс-спектрометре (ОФ-ВЭЖХ-МС) 43

2.6.4. Приготовление стандартных растворов PGE2 and PGD2 для количественного анализа 43

2.7. Исследование in vitro влияния потенциальных иммунорегуляторов на лейкоциты рыб 44

2.7.1. Разведение G. aculeatus и S. solidus 44

2.7.2. Эксперименты по заражению 44

2.7.3. Приготовление антигенов S. solidus 45

2.7.4. Приготовление культуральной среды 46

2.7.5. Изоляция лейкоцитов 46

2.7.6. Культивирование лейкоцитов 47

2.7.7. Проточная цитофлуориметрия 47

2.7.8. Измерение продукции реактивных форм кислорода лейкоцитами головной почки 48

2.8. Исследование лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб 49

2.9. Исследование гистоморфологии иммунокомпетентных органов и тканей окончательного хозяина 50

2.10. Исследование экспрессии иммунокомпетентных генов рыб 51

2.10.1. Экспериментальные животные: получение ARS-Fp-R и ARS-Fp-S генетических линий радужной форели 51

2.10.2. Отбор проб 52

2.10.3. Определение в селезенке рыб уровня патогенной нагрузки F. psy-chrophilum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени 53

2.10.4. Выделение РНК 53

2.10.5. Анализ экспрессии генов 54

2.11. Статистический анализ данных 55

ГЛАВА 3. Микроморфологические изменения цестод при воздействии сыворотки крови их хозяев 58

3.1. История изучения адаптаций цестод к воздействию иммунными факторами их хозяев 58

3.2. Исследование секреторной активности тегумента плероцеркоидов Diphyllobothrium dendriticum при воздействии сыворотки крови хозяина Coregonus migratorius 62

3.2.1. Исследование с помощью методов сканирующей электронной микроскопии 62

3.2.2. Исследование с помощью методов трансмиссионной электронной микроскопии 67

3.3. Исследование секреторной активности тегумента плероцеркоидов Ligula (Digramma) interrupta при воздействии сыворотки крови хозяина Carassius auratus 76

3.3.1. Исследование с помощью методов сканирующей электронной мик 4 роскопии 76

3.3.2. Исследование с помощью методов трансмиссионной электронной микроскопии 78

3.4. Сравнительный анализ микроморфологических изменений в тегументе D. dendriticum и L. interrupta при воздействии сыворотки крови их хозяев 84

ГЛАВА 4. Наличие и особенности распределения иммунорегуляторных молекул в организме цестод, паразитирующих в рыбах 93

4.1. История изучения иммунорегуляторных молекул паразитов 93

4.2. Иммуноцитохимическое и биохимическое исследование D. dendriticum 96

4.2.1. Выявление простагландинов 96

4.2.1.1. Выявление простагландина E2 97

4.2.1.1.1. PGE2-ИР в нервной системе 97

4.2.1.1.2. PGE2-ИР в циртоцитах 97

4.2.1.1.3. PGE2-ИР в тегументе 98

4.2.1.2. Выявление простагландина D2 99

4.2.2. Ультраструктурное исследование структур, участвующих в синтезе PGE2 и PGD2 100

4.2.3. Выявление нейроактивных субстанций

4.2.3.1. Выявление -аминомасляной кислоты (ГАМК) 102

4.2.3.2. Выявление серотонина 103

4.2.3.3. Выявление неропептида FMRFамида 104

4.2.3.4. Выявление ко-локализации нейроактивных субстанций в нервной 105 системе

4.2.4. Биохимическое исследование D. dendriticum 106

4.2.4.1. Выявление и количественный анализ простагландинов E2 и D2 в плероцеркоидах 106

4.2.4.2. Динамика секреции простагландинов E2 и D2 при инкубировании с сывороткой крови хозяина 106

4.3. Иммуноцитохимическое исследование Ligula (Digramma) interrupta 107

4.3.1. Выявление простагландинов 107

4.3.1.1. Выявление простагландина E2 107

4.3.1.2. Выявление простагландина D2 109

4.3.3. Выявление нейроактивных субстанций

4.3.3.1. Выявление серотонина 110

4.3.3.2. Выявление неропептида FMRFамида 110

4.3.3.3. Выявление -аминомасляной кислоты (ГАМК) 111

4.3.3.4. Выявление ко-локализации нейроактивных субстанций в нервной системе

4.4. Анализ иммунорегуляторов Diphyllobothrium dendriticum и Ligula (Di gramma) interrupta 113

ГЛАВА 5. Исследование регуляторного влияния цестод на иммунную систему их хозяев – рыб 126

5.1. Строение, механизмы функционирования иммунной системы рыб и иммунный ответ при инфекциях и паразитозах 126

5.2. Исследование in vitro влияния потенциальных иммунорегуляторных молекул цестод на показатели лейкоцитов трехиглой колюшки Gasterosteus aculeatus 137

5.2.1. Влияние простагландина E2 138

5.2.1.1. Влияние простагландина E2 на лейкоциты головной почки при краткосрочном воздействии 138

5.2.1.1.1. Количество лейкоцитов и их субпопуляций 138

5.2.1.1.2. Кислородный взрыв 139

5.2.1.2. Влияние простагландина E2 на лейкоциты головной почки при долгосрочном воздействии 139

5.2.1.2.1. Количество лейкоцитов 140

5.2.1.2.2. Субпопуляции лейкоцитов 140

5.2.1.2.3. Кислородный взрыв 141

5.2.2. Влияние нейромедиатора серотонина (5-HT) 141

5.2.2.1. Влияние серотонина на лейкоциты головной почки при кратко срочном воздействии 142

5.2.2.1.1. Количество лейкоцитов и их субпопуляций 142

5.2.2.1.2. Кислородный взрыв 142

5.2.2.2. Влияние серотонина на лейкоциты головной почки при долгосрочном воздействии 142

5.2.2.2.1. Количество лейкоцитов 143

5.2.2.2.2. Субпопуляции лейкоцитов 143

5.2.2.2.3. Кислородный взрыв 144

5.2.3. Влияние нейромедиатора -аминомасляной кислоты (ГАМК) 144

5.2.3.1. Влияние ГАМК на лейкоциты головной почки при краткосроч ном воздействии 144

5.2.3.1.1. Количество лейкоцитов и их субпопуляций 144

5.2.3.1.2. Кислородный взрыв 145

5.2.3.2. Влияние ГАМК на лейкоциты головной почки при долгосрочном воздействии 145

5.2.3.2.1. Количество лейкоцитов 145

5.2.3.2.2. Субпопуляции лейкоцитов 146

5.2.3.2.3. Кислородный взрыв 146 5.3. Исследование изменений лейкоцитарного состава органов иммунной

системы рыб при заражении плероцеркоидами цестод 146

5.3.1. Исследование изменений лейкоцитарного состава органов иммунной системы байкальского омуля С. migratorius при заражении плероцерко идами лентеца чаечного D. dendriticum 147

5.3.1.1. Качественные характеристики лейкоцитарного состава органов иммунной системы байкальского омуля 147

5.3.1.2. Изменение лейкоцитарного состава головного отдела почки байкальского омуля при заражении D. dendriticum 148

5.3.1.3. Изменение лейкоцитарного состава туловищного отдела почки байкальского омуля при заражении D. dendriticum 148

5.3.1.4. Изменение лейкоцитарного состава селезенки байкальского омуля при заражении D. dendriticum 148

5.3.2. Исследование изменений лейкоцитарного состава органов иммунной системы карася серебряного С. auratus при заражении плероцеркоидами 149 ремнеца L. interrupta

5.3.2.1. Качественные характеристики лейкоцитарного состава органов иммунной системы карася серебряного 149

5.3.2.2. Изменение лейкоцитарного состава головного отдела почки карася серебряного при заражении L. interrupta 150

5.3.2.3. Изменение лейкоцитарного состава туловищного отдела почки карася серебряного при заражении L. interrupta 150

5.3.2.4. Изменение лейкоцитарного состава селезенки карася серебряного при заражении L. interrupta 151

5.4. Исследование у окончательных хозяев микроморфологических изменений органов, принимающих участие в антипаразитарном иммунологическом ответе, при экспериментальном заражении цестодами 152

5.4.1. Изменение клеточного состава брыжеечных лимфатических узлов сирийского хомяка при экспериментальном заражении D. dendriticum 152

5.4.2. Изменение состава тучных клеток 12-перстной кишки сирийского хомяка при экспериментальном заражении D. dendriticum 153

5.5. Исследование изменений экспрессии иммунокомпетентных генов у радужной форели Oncorhynchus mykiss при заражении флавобактериями Fla vobacterium psychrophilum 154

5.5.1. Динамика изменений количества бактерий Fp в селезенке ARS-Fp-R- и ARS-Fp-S-линий форели после заражения 155

5.5.2. Анализ изменений экспрессии генов при заражении Fp методом принципиальных компонент 156

5.5.3. Попарный анализ экспрессии генов при заражении Fp 156

5.5.4. Сравнительный анализ ответной реакции на заражение Fp между генетическими линиями 158

5.5.5. Сравнение базовой и индуцированной генной экспрессии между генетическими линиями 159

5.6. Анализ регуляторного влияния цестод на иммунную систему их хозяев – рыб 160

ГЛАВА 6. Анализ иммунологических аспектов взаимоотношений в системах «цестоды – рыбы » 184

Заключение 210

Список сокращений и условных обозначений 215

Список литературы

• Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография c ультрафиолетовым детектированием (ОФ-ВЭЖХ-УФ)
• Приготовление культуральной среды
• Исследование секреторной активности тегумента плероцеркоидов Ligula (Digramma) interrupta при воздействии сыворотки крови хозяина Carassius auratus
• Влияние нейромедиатора -аминомасляной кислоты (ГАМК)

Введение к работе

Актуальность и степень разработанности темы исследования. В последние годы значительно возрос интерес исследователей к выяснению механизмов, используемых паразитами для уклонения от иммунного ответа хозяина или регуляции его иммунной системы. Эти адаптивные механизмы были изучены, главным образом, у некоторых трематод и нематод, имеющих важнейшее медицинское и ветеринарное значение. Информации по исследованию цестод в этом отношении крайне мало (Давыдов, Микряков, 1988; Terrazas, 1998; Garg, Ranganathan, 2012; Pen et al., 2016). Исследование защитных механизмов было проведено на половозрелых стадиях паразитов и окончательных хозяевах – млекопитающих. Однако не меньшее значение имеет исследование защиты паразитов от иммунологических реакций промежуточных хозяев, принадлежащих к низшим позвоночным.

Огромную роль в жизненных циклах паразитов в качестве промежуточных хозяев играют рыбы (Sitja`-Bobadilla, 2008). В последние годы мировая аквакультура резко увеличила свою продукцию. Однако параллельно отмечается увеличение паразитарных заболеваний рыб, что приводит к серьезному урону в рыбоводной промышленности (Clifton-Hadley et al., 1986; Moran et al., 1999; Johnson et al., 2004; Krkosek et al., 2006).

Цестодозы в некоторых эндемичных регионах по своему эпидемиологическому и эпизоотическому значению выходят на первый план среди остальных гельминтозов. На территории России ежегодно дифиллоботриозом заболевает более 6 тысяч человек (Беляев и др., 2001; Верещагин и др., 2010, 2014). Причиной заболеваний являются лентецы рода Diphyllobothrium, паразитирующие на стадии плероцеркоида как в пресноводных, так и морских видах рыб (Сердюков, 1979; Делямуре и др., 1985; Довгалев и др., 1991, 1996; Довгалев, 1998; Arizono et al., 2009). В ряде северных районов Сибири и в Прибайкалье, включая Республику Бурятия, основным возбудителем дифиллоботриоза человека и животных является лентец чаечный Diphyllobothrium dendriticum.

Лигулез (диграммоз) рыб – тяжелая паразитарная болезнь карповых рыб, вызываемая плероцеркоидами ленточных червей рода Ligula (Digramma), которые локализуются в брюшной полости рыб. Заболевание приводит к дисфункции и атрофии внутренних органов, больная рыба всплывает на поверхность и в

большом количестве гибнет, становясь добычей рыбоядных птиц и хищных рыб. В настоящее время потери рыбопродукции от этого заболевания составляют, в среднем, 15% (Дубинина, 1966; Апсолихова, 2010).

Ранее изучалось регуляторное влияние целых паразитических организмов, либо их секреторно-экскреторных продуктов на иммунитет хозяев. На современном этапе развития паразитологии большое внимание уделяется идентификации отдельных иммунорегуляторных веществ, экскретируемых паразитами в ткани хозяев (Maizels et al., 2004; Fallon, Alcami, 2006; Adisakwattana et al., 2009; Hewitson et al., 2009; Johnston et al., 2009; Hernandez et al., 2013; McSorley et al., 2013; Hewitson et al., 2016). Актуальными стали разработки лечения аутоиммунных заболеваний с использованием иммунорегуляторных веществ, вырабатываемых гельминтами (Ebner et al., 2014).

Адаптивные механизмы защиты паразитов от иммунной системы хозяев
исследованы, главным образом, биохимическими методами.

Микроморфологические исследования реализации этих механизмов у паразитов, включая цестод, почти полностью отсутствуют. Данных литературы о локализации иммунорегуляторных молекул в организме паразитов чрезвычайно мало. К началу выполнения данной работы в литературе были представлены единственные данные о распределении иммунорегуляторного вещества – простагландина Е₂ в организме нематоды Onchocerca volvulus (Brattig et al., 2006). К настоящему времени механизмы защиты плероцеркоидов цестод от иммунной системы рыб не изучены совершенно, в том числе не изучен и спектр иммунорегуляторных молекул цестод. До сих пор неизвестно, какие типы клеток продуцируют иммунорегуляторные молекулы у цестод. Не известно также воздействие отдельных иммунорегуляторных молекул цестод на иммунную систему рыб. Несмотря на наличие данных по изменению показателей иммунной системы рыб при инвазии цестодами, остается не совсем ясным вклад иммунорегуляторного влияния цестод в эти изменения.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы – изучить морфофункциональные и биохимические аспекты адаптации плероцеркоидов цестод к воздействию иммунной системы их хозяев – рыб.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ультраструктурные особенности выведения плероцеркоидами цестод секреторных продуктов на поверхность тела в ответ на воздействие in vitro сыворотки крови хозяев – рыб.

1. Изучить на ультраструктурном уровне изменения в организме плероцеркоидов цестод в ответ на воздействие in vitro сыворотки крови хозяев – рыб.

2. Провести иммуноцитохимическое исследование распределения в организме плероцеркоидов цестод потенциальных регуляторов иммунной системы – простагландинов (PG) E₂ и D₂, нейроактивных субстанций серотонина, гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), нейропептида FMRFамида.

3. Определить наличие и концентрацию в организме плероцеркоидов цестод потенциальных регуляторов иммунной системы – простагландинов E₂ и D₂, а также выведение этих веществ наружу в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев.

4. Изучить in vitro влияние потенциальных регуляторов иммунной системы – простагландинов E₂ и D₂, серотонина, ГАМК на показатели лейкоцитов рыб.

5. Исследовать изменения лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб при инвазии плероцеркоидами цестод.

6. Провести сравнительный анализ иммунологических реакций промежуточных и окончательных хозяев при инвазии их цестодами.

7. Провести сравнительный анализ иммунологических реакций рыб при инвазии цестодами и заражении патогенными бактериями.

Научная новизна исследования. Работа представляет собой первое комплексное исследование механизмов адаптации паразитов к антипаразитарной иммунологической реакции хозяев, с одной стороны, а с другой стороны – иммунологической реакции хозяев в ответ на заражение паразитами. Впервые показано, что плероцеркоиды цестод обладают морфологическими и биохимическими механизмами защиты от воздействия иммунной системы хозяев – рыб.

Впервые изучены микроморфологические и биохимические особенности реакций плероцеркоидов в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев. Установлено, что при таком воздействии усиливается секреторная активность тегумента. Обнаружены две разновидности вывода секрета на поверхность тела плероцеркоидов: оформленные и неоформленные секреторные продукты. В тегументе выявлены апокриновый и мерокриновый типы секреции, а также экскреция везикул с поверхности свободных нервных окончаний в поры

тегумента. Показано, что плероцеркоиды способны секретировать широкий спектр мембранно-ограниченных продуктов. Впервые установлена важная роль органоидов дистальной цитоплазмы тегумента – палочковидных гранул, дисковидных тел, везикул и вакуолей – в защитных реакциях цестод. Доказана секреция цестодами простагландинов (PG) Е₂ и D₂ в ответ на стимуляцию сывороткой крови хозяев.

Впервые для плероцеркоидов доказана выработка иммунорегуляторных молекул – простагландинов Е₂ и D₂ и установлена их концентрация в организме плероцеркоидов. Впервые установлена локализация этих простагландинов в организме плероцеркоидов: PGЕ₂ – впервые для паразитических плоских червей; PGD₂ – для группы паразитических червей в целом. Показана возможность секреции этих простагландинов в ткани хозяина с поверхности свободных нервных окончаний в тегументе, через протоки фронтальных желез и выделительную систему. Впервые исследованы микроморфологические особенности локализации нейроактивных субстанций, потенциальных нейро- и иммунорегуляторов в организме плероцеркоидов: серотонина, ГАМК и FMRFамида – для Ligula interrupta и ГАМК – для Diphyllobothrium dendriticum. Впервые исследованы особенности ко-локализации этих веществ в организме плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta.

Установлена регуляторная роль в отношении иммунной системы рыб выявленных в организме плероцеркоидов веществ: простагландина Е₂, серотонина и ГАМК. Впервые показано, что при воздействии этих веществ изменяются жизнеспособность и продукция реактивных форм кислорода лейкоцитами рыб. Доказано регуляторное влияние плероцеркоидов цестод на иммунную систему хозяев – рыб. Впервые установлены изменения лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб при заражении плероцеркоидами. Показано, что инвазия плероцеркоидами цестод D. dendriticum и L. interrupta у рыб, наряду с активацией гуморального звена адаптивного иммунитета, вызывает угнетение пролиферации бластных форм лейкоцитов и супрессию клеточного звена иммунитета. Установлено, что при инвазии D. dendriticum у окончательного хозяина – сирийского хомячка – в иммунокомпетентных органах и тканях также наблюдаются противоположные процессы: активация неспецифических и специфических звеньев иммунного ответа и супрессивное влияние паразита на иммунологические реакции хозяев.

Впервые применен метод мультиплексной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции для изучения дифференциальной экспрессии иммунокомпетентных генов рыб при бактериальных заболеваниях. Впервые у радужной форели изучена динамика экспрессии провоспалительных цитокинов tnfa1, tnfa2, tnfa3, il1b1, il1b2, рецепторов этих цитокинов tnfrsf1a, tnfrsf1a-like-a, tnfrsf1a-like-b, tnfrsf9, il1r-like-1, il1r1-like-b, il1r2, il1r2-like и генов острофазных белков saa и drtp при заражении флавобактериями Flavobacterium psychrophilum.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные внесли значительный вклад в изучение адаптаций паразитов к воздействию иммунной системы их хозяев. Доказано, что плероцеркоиды цестод обладают морфологическими и биохимическими механизмами защиты от воздействия иммунной системы хозяев – рыб. Установлено, что тегумент – место непосредственного контакта паразита с тканями хозяина – играет важную роль в защите плероцеркоидов от иммунологических реакций хозяев – рыб. В ответ на контакт с факторами внутренней среды (сывороткой крови) хозяев – рыб в тегументе происходит усиление секреторной активности по апокриновому и мерокриновому типу, а также экскреция везикул с поверхности свободных нервных окончаний в поры тегумента. В результате образуется широкий спектр мембранно-ограниченных секреторных продуктов, потенциально содержащих иммунорегуляторные вещества.

Нами впервые начата идентификация иммунорегуляторных молекул в организме плероцеркоидов. На примере D. dendriticum впервые продемонстрировано, что плероцеркоиды секретируют простагландины Е₂ и D₂ в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев. Установлены возможные пути секреции этих простагландинов в ткани хозяина: с поверхности свободных нервных окончаний в тегументе, через протоки фронтальных желез и выделительную систему плероцеркоидов. На основании того факта, что у плероцеркоидов наблюдается экскреция везикул с поверхности свободных нервных окончаний при воздействии сыворотки крови хозяев, нами была выдвинута гипотеза об иммунорегуляторной роли нейроактивных субстанций, вырабатываемых плероцеркоидами.

Экспериментальными исследованиями in vitro доказана регуляторная роль в отношении иммунной системы рыб выявленных в организме плероцеркоидов

веществ: простагландина Е₂, нейроактивных субстанций серотонина и ГАМК. Доказано регуляторное влияние цестод на иммунную систему промежуточных (рыб) и окончательных (сирийский хомячок) хозяев. Следовательно, иммунорегуляция присуща цестодам как на личиночной стадии развития, так и в половозрелом состоянии.

Результаты настоящего исследования имеют фундаментальное значение для более глубокого изучения тонких механизмов регуляции плероцеркоидами иммунной системы хозяина. Данная работа является первым этапом идентификации иммунорегуляторных молекул в организме плероцеркоидов, определению клеточных источников их синтеза и путей вывода в ткани хозяина, а также механизмам воздействия иммунорегуляторных веществ на иммунную систему хозяев.

Результаты работы позволяют глубже понять механизмы патогенеза при инвазии человека и животных цестодами, имеющими важное эпидемиологическое и эпизоотическое значение. Данные о тонких механизмах регуляции иммунной системы хозяина дифиллоботриидами могут быть приняты во внимание при разработке методов профилактики, диагностики и лечения гельминтозов человека и животных. Выявленные паразитарные иммунорегуляторы могут быть использованы при разработке и создании эффективных средств для лечения аутоиммунных заболеваний.

Мультидисциплинарный подход, а также набор методов с характеристиками, специально подобранными для изучения адаптации цестод к воздействию иммунной системы хозяев – рыб могут служить основой для исследования иммунологических аспектов взаимоотношений в других системах «паразит – хозяин», включая паразитарные заболевания у человека.

Результаты исследований могут быть использованы:

– для подготовки справочной и учебной литературы по паразитологии, иммунологии, зоологии, ихтиологии;

– в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий со студентами биологических, медицинских и ветеринарных факультетов высших и среднеспециальных учебных заведений.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Плероцеркоиды цестод в естественных условиях оказывают регуляторное воздействие на иммунную систему хозяев – рыб. Инвазия плероцеркоидами

вызывает у рыб, с одной стороны, развитие воспалительных реакций и активацию гуморального звена адаптивного иммунитета, с другой стороны – угнетение пролиферации бластных форм лейкоцитов и супрессию клеточного звена иммунитета. Простагландины и нейроактивные субстанции, идентифицированные в организме плероцеркоидов, изменяют жизнеспособность лейкоцитов и их способность к продукции реактивных форм кислорода в культуре лейкоцитов рыб. Эти вещества могут использоваться цестодами для регуляции иммунитета промежуточных хозяев – рыб.

2. Плероцеркоиды цестод синтезируют потенциальные иммунорегуляторы – простагландины E₂ и D₂ и секретируют эти вещества на поверхность тегумента в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев. Возможные пути секреции этих простагландинов в ткани хозяина: с поверхности свободных нервных окончаний в тегументе, через протоки фронтальных желез и выделительную систему плероцеркоидов. Тегумент плероцеркоидов цестод играет важную роль в их защите от иммунологических реакций хозяина. При воздействии сыворотки крови хозяев плероцеркоиды реагируют увеличением количества отдельных органоидов в дистальной цитоплазме тегумента и усилением секреторной активности на поверхности тегумента.

Апробация результатов. Результаты исследований были доложены на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инвазионной и инфекционной патологии животных» (Улан-Удэ, 2008), международной конференции «Влияние окружающей среды на врожденный иммунитет: угроза заболеваний» (Австрия, Обергугль 2009), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы электрофизиологии и незаразной патологии животных» (Улан-Удэ, 2009), Гордоновской научной конференции по иммунохимии и иммунобиологии (Швейцария, Лес Диаблеретс, 2010), международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2010), II Международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты северной и центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011), международной научно-практической конференции «Пресноводная аквакультура Европы и Азии: реалии и перспективы развития и сотрудничества» (Улан-Удэ, 2011), XI европейском мультиколлоквиуме по паразитологии (Румыния, Клуж-Напока, 2012), III всероссийской конференции молодых ученых «Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы» (Улан-Удэ, 2013), VI всероссийской конференции с

международным участием «Школа по теоретической и морской паразитологии» (Севастополь, 2016).

Публикации. Всего за период научной деятельности автором опубликовано 60 научных работ. По теме диссертации опубликовано 38 работ, из которых 15 статей – в ведущих рецензируемых журналах (список ВАК и WoS), включая 6 статей на английском языке.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, шести глав, заключения, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 462 страницах (основной текст – 267 страниц, приложение – 195 страниц), включает 171 рисунок и 18 таблиц (169 рисунков и 16 таблиц – в приложении). Список литературы содержит 476 источников, в том числе 366 – иностранных.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту Н.М. Бисеровой за критическое отношение и анализ работы, терпение, неоценимую помощь и поддержку, а также многочисленным коллегам, оказавшим помощь в получении материала, литературы, техническую поддержку исследований: всем бывшим и настоящим сотрудникам лаборатории паразитологии и экологии гидробионтов ИОЭБ СО РАН, сотруднику лаборатории медико-биологических исследований ИОЭБ СО РАН Д.Н. Оленникову, сотруднику Бурятской республиканской станции по борьбе с болезнями животных А.В. Молчанову, директору Большереченского рыборазводного завода В.Ю. Матанцеву, сотруднику Байкальского филиала Госрыбцентра А.В. Базову; сотрудникам Биологического факультета МГУ: коллективу кафедры зоологии беспозвоночных, О.П. Ильинской, И.А. Демьяненко (кафедра клеточной биологии и гистологии), И.А. Кондратьевой, Д.Б. Киселевскому (кафедра иммунологии); сотрудникам ИБВВ РАН Ж.В. Корневой, В.Р. Микрякову, Д.В. Микрякову, Л.В. Балабановой, Е.А. Заботкиной, коллективу лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов ИЦиГ СО РАН во главе с В.А. Мордвиновым. Особую благодарность автор выражает сотрудникам кабинета электронной микроскопии ИБВВ РАН во главе с С.И. Метелевым, коллективу лаборатории конфокальной микроскопии Биологического факультета МГУ во главе с М.М. Мойсеновичем, сотруднику ИБР РАН Е.Б. Цитрину, сотруднику межкафедральной лаборатории электронной микроскопии МГУ А.Г. Богданову. Автор глубоко признателен своим зарубежным коллегам за идейную и методическую поддержку исследований: коллективу группы эволюционной

экологии животных университета г. Мюнстер, Германия во главе с Й. Куртцем, сотрудникам Национального центра прохладно- и холодноводной аквакультуры, США Г. Уайенсу, Б. Кливленд, Т. Лидсу, Д. Карену.

Работа выполнена при поддержке грантов Фулбрайта (68140211), ДААД (A/11/04242), РФФИ (08-04-98035, 09-04-01056, 09-04-90767, 10-04-09260, 10-04-90750, 12-04-98002, 12-04-98003, 12-04-90731, 13-04-90702, 16-04-01213), OPTEC Group (2012 г.), Бурятского государственного университета (2006, 2007 гг.).

Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография c ультрафиолетовым детектированием (ОФ-ВЭЖХ-УФ)

Важной в развитии антипаразитарного иммунного ответа является хелпер-ная популяция Т-лимфоцитов (Th), несущая на своей поверхности молекулярный маркер CD4+. Хелперные Т-клетки подразделяются на две субпопуляции: Th1 и Th2. Th1-лимфоциты вырабатывают большое количество интерлейкина-2 IL-2 и гамма-интерферона IFN-, которые являются мощными индукторами клеточного иммунитета, тогда как Th2-лимфоциты вырабатывают такие цитокины как IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13, которые посылают сигналы для активации В-лимфоцитов и продукции антител (Mosmann, Sad, 1996; Rodrguez-Sosa et al., 2002). На начальной стадии инвазии гельминтами в организме хозяина развивается Th1-иммунный ответ (иммунный ответ 1 типа), ограничивающий развитие паразитов. Однако в дальнейшем гельминты стимулируют постепенный сдвиг в сторону Th2-иммунного ответа (иммунного ответа 2 типа), лояльного по отношению к паразитирующим гельминтам (Villa, Kuhn, 1996; Terrazas et al., 1998). Важную роль в пусковом механизме, вызывающем сдвиг с сторону иммунного ответа 2 типа играет группа макрофагов, именуемых альтернативно активированных (Rodrguez-Sosa et al., 2002).

Паразиты индуцируют образование неспецифических и специфических антител. При многих паразитарных инвазиях развивается неспецифическая гипер-гаммаглобулинемия, в основном, вероятно, под действием высвобождаемых паразитами соединений, вызывающих В-митогенный эффект. Повышается общее содержание иммуноглобулинов: IgM при трипаносомозе и малярии, IgG – при малярии и висцеральном лейшманиозе. Относительное значение антителозависимого и антителонезависимого ответов определяется видом инвазии. Механизмы действия антител при паразитарных инвазиях многообразны. Антитела могут действовать на клетки простейших непосредственным образом или путем активации комплемента. Антитела способны непосредственно нейтрализовывать паразитов, препятствуя их прикреплению к новым клеткам. Осуществляемый макрофагами фагоцитоз усиливается антителами, наиболее эффективно при участии комплемента. Антитела участвуют в реакциях антителозависимой клеточной цитотоксичности. Цитотоксические клетки, такие как макрофаги, нейтрофилы и эозинофилы, прикрепляются к покрытым антителами простейшим и гельминтам посредством Fc- и С3-рецепторов и осуществляют экзоцитоз паразитов (Moreau, Chauvin, 2010; Grencis, 2014; Pen et al., 2016).

Для многих инвазий трудно разграничить клеточный и гуморальный ответы, поскольку они развиваются одновременно.

Таким образом, на сегодняшний день большинство имеющихся данных по иммунологическим реакциям при паразитозах получены для человека и лабораторных млекопитающих – окончательных хозяев изученных паразитов, поскольку данная научная проблема имеет важнейшее медицинское значение. Однако важное фундаментальное значение имеет исследование иммунологических реакций промежуточных хозяев, принадлежащих к низшим позвоночным, у которых в эволюционном плане иммунная система менее развита, по сравнению с высшими позвоночными. Огромную роль в жизненных циклах паразитов в качестве промежуточных хозяев играют рыбы (A. Sitja`-Bobadilla, 2008). В иммунной системе рыб уже представлены как врожденные, так и адаптивные механизмы, однако ан-тигенраспознающая система несовершенна и в значительной мере зависит от различных внешних воздействий, таких как температура, жесткость, кислотность и соленость воды, загрязняющие вещества, а также от питания рыб (Кондратьева и др., 2001).

В последние годы изучены иммунологические реакции рыб при паразити-ровании других организмов в различных органах локализации: мозге (Bechmann, 2007; Dezfuli, 2007; Osset, 2005 и др.); глазах (Jones, 2006; Kalbe, 2006; Seppl, 2004 и др.); половых продуктах (Catalano, 2007; Fijak, 2006; Sitja`-Bobadilla, 1993 и др.); плавательном пузыре (Knopf, 2006; 2008). В перечисленных работах описаны особенности реакций врожденного и приобретенного иммунитета рыб при пара-зитозах. Установлено, что важную роль в иммунологическом ответе играют врожденные механизмы защиты: система комплемента, цитотоксическое действие макрофагов, эозинофилов и др. Вместе с тем, при инвазиях вырабатываются и специфические антитела к паразитирующим организмам, и формируется приобретенный иммунитет, при котором специфические иммуноглобулины синтезируются, главным образом, против антигенных компонент наружного покрова паразитов.

Большинство публикаций посвящено исследованию иммунного ответа на инвазию одноклеточными паразитами (миксоспоридиями, трипаносомами и др.); из Metazoa в этом плане больше изучалось влияние трематод и нематод. Влиянию цестод посвящены лишь отдельные работы (Киташова, 2002; Мазур, 2006; Fletcher, 1980; Scharsack, 2004; Taylor, Hoole, 1993), в которых описаны некоторые растворимые иммуноактивные фракции крови или популяции клеток, участвующих в иммунном ответе при цестодозах. Отсутствует анализ, дающий целостную картину развития антипаразитарного иммунитета при цестодозах. По исследованию изменений микроморфологии органов иммунной системы рыб при инвазии гельминтами данные отсутствуют. В связи с этим, крайне важным является всестороннее изучение механизмов развития иммунологического ответа рыб при наличии в организме паразитических червей.

Следующим блоком в иммунологических взаимоотношениях паразитов и хозяев является эволюционное формирование адаптивных механизмов, обеспечивающих уклонение паразита от иммунного ответа хозяина, либо направленных на подавление этого ответа.

Паразитарная иммунорегуляция – это общее для всех паразитов свойство, включающее в себя уклонение, подавление или изменение иммунного ответа хозяина. Для успешного внедрения и развития в организме хозяина паразитам необходимо избежать действия его защитных механизмов, поэтому паразитические организмы обладают способностью обходить их разнообразными способами. Паразиту жизненно необходимо выжить в среде хозяина для внедрения в дальнейшем в окончательного хозяина (при наличии сложного жизненного цикла) и в конечном итоге – для генерации потомства. Агрессивная инвазия, приводящая к гибели хозяина, является контрпродуктивной для паразитов. Следовательно, в большинстве случаев, «целью» паразитов является создание в организме хозяина ниши, в которой паразиты способны выжить и дать потомство без значительного снижения жизнеспособности хозяина. На данный момент для паразитических организмов, имеющих медицинское значение, выявлен широкий круг подобных механизмов (Riffkin et al., 1996; Roitt, 2000; Maizels et al., 2004).

Приготовление культуральной среды

Для количественной оценки уровня транскрипции генов нами был использован секвенатор GenomeLab (Beckman Coulter, США) с применением ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). На этом секвенаторе был использован капиллярный электрофорез для определения количественной характеристики размеров и флуоресцентной интенсивности ампликонов, полученных в ходе отдельных реакций ПЦР. Праймеры были использованы либо из опубликованных ранее работ (Husain et al., 2012; Hong et al., 2013; Cleveland, Weber, 2015, 2016) или были сконструированы заново, используя программное обеспечение eXpress Designer (Beckman Counter), таким образом, чтобы длина ампликонов находилась в пределах 100–400 пар оснований (п. о.), различающихся между собой по длине не менее 3 п. о (Таблица 2.2). В мультиплексной ПЦР 21 пара праймеров амплифици-ровала гены, связанные с иммунологическим ответом рыб, и 4 использовались в качестве референсных генов (Таблица 2.3.). Последовательности праймеров сравнивались с последовательностями других генов радужной форели для исключения амплификации нежелательных последовательностей. Для этого использовалась функция BLAST в базе данных NCBI. Оптимизацию мультиплексной ПЦР, построение стандартной кривой (с разведениями 3 – 50 нг на 1 реакцию), реакции обратной транскрипции и ПЦР, капиллярный электрофорез проводили согласно рекомендациям производителя (GeXP Chemistry protocol A29143AC; Февраль, 2009) с использованием реагентов в наборе GeXP Start Kit (Beckman Coulter).

Реакционная смесь (всего 10 мкл) для обратной транскрипции включала в себя: 100 нг в 1 мкл РНК, обработанной ДНКазой (Promega, США); 1 мкл смеси ген-специфичных праймеров, 0,5 мкл обратной транскриптазы и 1,25 мкл РНК ка-намицина (внутренний контроль). Реакционная смесь инкубировалась согласно инструкции производителя: при 48 C 1 мин, при 42 C 60 мин, затем при 95 C 4 мин. Аликвота (4,65 мкл) результирующей кДНК использовалась в реакции ПЦР вместе с 2 мкл 25 мМ MgCl2, 2 мкл 5Х ПЦР буфера, 1 мкл смеси прямых праймеров и 0,35 мкл ДНК Taq-полимеразы. Реакционная смесь инкубировалась согласно инструкции производителя: при 95 C 10 мин, затем 34 цикла - при 94 C 30 с, при 55 C 30 с, при 70 C 60 с. Один мкл ПЦР продуктов был смешан с 38,5 мкл загрузочного раствора и 0,25 мкл стандарта размеров 400 (size standard 400). Продукты ПЦР разделялись методом капиллярного электрофореза в секвенаторе GeXP (Beckman Coulter Inc.; Pasadena, C A, USA), используя протокол Frag-3, и с разделительным напряжением 6,0 кВ в течение 45 мин.

Количественные данные по флуоресценции, связанной с каждым амплико-ном, экспортировались в программу eXpress Profiler (Beckman Coulter) для анализа и нормализации по внутреннему контролю (канамицину). Количество флуоресценции оценивалось, используя стандартные кривые для каждого гена. Для каждого гена концентрация транскриптов измерялась в относительных единицах плотности (arbitrary density units, A.U.). Показатели стандартной кривой R2 находились в пределах 0.81-0.97 (Таблица 2.3), за исключением tnfrsflb, который не мог быть достоверно количественно охарактеризован и поэтому исключен из анализа. С помощью программы GeNorm были определены три наиболее стабильные референсные гена - arp, gapdh, efla с коэффициентом М 0,810, 0,697, 0,620, соответственно. С помощью программы GeNorm было получено геометрическое среднее значение для референсных генов и сгенерирован нормализующий коэффициент для каждого образца. Уровень транскрипции для всех генов был нормализован по референсным генам и определен как частное от деления концентрации транскриптов на нормализующий коэффициент.

Статистический анализ данных Нормальность распределения наборов данных тестировалась при помощи теста Шапиро-Уилка и визуальной инспекцией гистограмм. Нормально распределенные данные анализировались при помощи дисперсионного анализа с применением критерия Фишера. Если дисперсионный анализ выявлял достоверное влияние факторов, достоверные различия между группами определялись с помощью апостериорного критерия Тюки. Для сравнения групп данных, не обладающих нормальным распределением, применялся непараметрический дисперсионный анализ с критерием Краскела-Уолиса. Апостериорный анализ проводился с использованием критерия Манна-Уитни. Различия считались достоверными при p 0,05. Все статистические анализы проведены с использованием программы Statistica 6.0. Морфометрические показатели у плероцеркоидов, инкубированных в растворе Хенкса, достоверно не отличались от показателей плероцеркоидов, непосредственно извлеченных из хозяев. Поэтому в качестве контроля использовались плероцеркоиды, непосредственно извлеченные из хозяев.

При анализе экспрессии иммунокомпетентных генов у радужной форели все данные были увеличены на 1 и затем трансформированы через логарифмирование (log2). Данные по патогенной нагрузке Fp были анализированы с применением двухфакторного дисперсионного анализа для определения достоверных различий между генетическими линиями и по времени отбора проб с помощью программы GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, США). Подобным образом двух-факторный дисперсионный анализ использовался раздельно для оценки влияния: 1) генетической линии (внутри эксперимента по заражению), времени отбора проб и взаимодействия этих факторов; 2) заражения (внутри генетической линии), времени отбора проб и взаимодействия этих факторов. Нулевая гипотеза (отсутствие различия между группами) отвергалась при p 0.05. Применение метода принципиальных компонент и построение тепловых карт производилось с использованием программы Qlucore Omics Explorer 3.1. Для идентификации генов, регулируемых инфекцией, было произведено сравнение групп контрольных и зараженных рыб с использованием ожидаемой доли ложных отклонений q 0.05 и уровнем изменений 2.0 (p = 0.006). Для идентификации генов, дифференциально регулируемых между генетическими линиями, было произведено сравнение между рыбами ARS-Fp-R и ARS-Fp-S генетических линий с использованием ожидаемой доли ложных отклонений q 0.05 и уровнем изменений 2.0 (p = 0.002). Для группировки генов был применен метод иерархической кластеризаци. Для оценки попарных взаимоотношений уровня экспрессии различных генов между собой, а также с уровнем патогенной нагрузки и размером селезенки был определен коэффициент корреляции Пирсона (r). Для этого использовалась программа GraphPad Prism 6.0. Корреляции считались достоверными при p 0.05.

Исследование секреторной активности тегумента плероцеркоидов Ligula (Digramma) interrupta при воздействии сыворотки крови хозяина Carassius auratus

Из вышеизложенного анализа литературных данных следует, что на современном этапе развития молекулярной паразитологии иммунорегуляторы были исследованы, главным образом, у трематод и нематод, вызывающих гельминтозы человека и представляющих большую практическую значимость в медицине (Jenkins, 2005; Hewitson, 2009; Balic, 2004). Информации об иммунорегуляторах в классе Cestoda крайне мало, до начала наших исследований существовала единственная работа, посвященная влиянию экскреторно-секреторных экстрактов це-стод на иммунитет мышей, в результате которого происходит супрессия Th1 – иммунного ответа (Terrazas, 1998).

Простагландины синтезируются у всех представителей царства животных, начиная с простейших. Простагландины представляют собой группу синтезируемых паразитами структурно взаимосвязанных биоактивных липидных медиаторов, вовлеченных в развитие разнообразных симптомов, сопровождающих пара-зитозы. В частности, простагландины являются одним из важных классов имму-норегуляторов (Kubata et al., 2007; Averina, Kutyrev, 2011). Простагландины синтезируются в организме животных из арахидоновой кислоты в присутствии цик-лооксигеназы (СОХ-1 и COX-2) в PGН2, а далее – в PGE2, PGD2, PGF2 (Kubata, 2007).

PGE2 и PGD2 были выявлены у представителей паразитических простейших (Hadas, 1997), трематод (Noverr, 2003), нематод (Liu, 1990), цестод (Leid, McConnell, 1983). Установлено, что эти простагландины являются иммунорегуля-торами организма хозяев. PGE2 снижает продукцию цитокинов. PGD2 способствует уклонению гельминтов от иммунного ответа хозяев путем ингибирования TNF--зависимой миграции антигенпрезентирующих клеток (Kubata, 2007).

Кроме PG, иммуномодулирующее действие способны оказывать нейроак-тивные субстанции (Kawli et al., 2010). Известно, что нейроактивные субстанции способны оказывать иммунорегулирующее действие. Так, например, R. Bhat et al. (2010) показали, что ГАМК способна уменьшать фосфориллирование сигнальных киназ макрофагов, а также снижать аутоиммунный воспалительный процесс в нервной системе, главным образом, воздействуя не на нервные, а на иммунные клетки. Дофамин- и ГАМКергические системы участвуют в стимулирующем влиянии на иммунннореактивность, а серотонинергические системы вовлечены в ин-гибиторные механизмы нейроиммуномодуляции (Devoino, 1994). Катехоламины, выделяющиеся нервными окончаниями, способны воздействовать на пролиферацию и дифференцировку иммуннокомпетентных клеток. Катехоламины оказывают подавляющее влияние на пролиферацию Т-клеток, ускоряя дифференцировку Т-супрессоров. Известно, что ацетилхолин обладает способностью как стимулировать, так и подавлять пролиферацию лимфоцитов. Активация симпатических адренергических волокон приводит к ингибирующему эффекту у макрофагов селезенки, продукции цитокинов. С другой стороны, известно, что лимфоциты экс-прессируют рецепторы для многих гормонов, медиаторов и нейропептидов, включая рецепторы для стероидов, катехоламинов (адреналина и норадреналина), энкефалинов, эндорфинов, вещества Р и вазоактивного интестинального пептида (Roitt, 2000).

Работы, посвященные нейроиммунорегулирующим молекулам цестод, немногочисленны. Имеются сведения о наличии нейропептидов и гормоноподобных субстанций в центральной нервной системе цестод отряда Pseudophyllidea sensu lato (Biserova et al., 1996; Gustafsson et al. 1986, 1994; Halton, Gustafsson, 1996). Показано, что некоторые цестоды выделяют активные субстанции с поверхности свободных нервных окончаний, расположенных в тегументе, и таким образом оказывают влияние на хозяина (Бисерова 1987; 2004; Бисерова, Корнева, 1999; Плужников и др., 1986; 1990). Предполагается, что специализированные железы выделяют секреторные продукты для защиты гельминта от иммунного ответа хозяина (Kuperman, Davydov, 1982 а, в; Давыдов, Бисерова, 1985). Сведений о химическом составе секрета фронтальных желез или экскретируемых нейромедиаторов в литературе нет.

К настоящему времени накоплены определенные сведения о спектре нейро-активных субстанций в нервной системе цестод (Hariri, 1974; Webb, Eklove, 1989; Webb, Mizukawa, 1985; Hrckova et al., 1993; Maule et al., 1991, 1993; Halton, Gusafsson, 1996), которые одновременно показывают распределение этих веществ в разных отделах центральной и периферической НС. Имеются данные о составе и распределении медиаторов у цестод Mesocestoides corti, Moniezia expansa и Hyme-nolepis diminuta (Теренина и др., 2014; Fairweather et al., 1988; Hariri 1974; Hrckova et al., 1993; Maule et al., 1991, 1993; Terenina et al., 1995; Webb, Eklove, 1989), Gril-lotia erinaceus (Halton et al., 1994), Trilocularia acanthiaevulgaris , Amphilina foli-acea (Biserova et al., 2000), Triaenophorus nodulosus (Biserova et al., 1996), Diphyl-lobothrium dendriticum (Gustafsson et al., 1985, 1986, 1989, 1993, 1994; Gustafsson, Eriksson, 1991), Cyatocephallus truncatus (Теренина и др., 2014; Terenina et al., 2009), Echinococcus multilocularis (Теренина и др., 2010, 2014), Phyllobothrium caudatum (Теренина и др., 2012, 2014). В нервной системе плероцеркоида D. den-driticum выявлены серотонин (5-НТ) и катехоламин, нейропептид FMRFамид, лей-энкефалин, нейротензин, субстанция Р и гистамин-позитивные клетки.

Влияние нейромедиатора -аминомасляной кислоты (ГАМК)

Ранее иммуногистохимическим методом PGE2 был выявлен в гиподермисе взрослой паразитической нематоды Onchocerca volvulus (Brattig et al., 2006). Также как и у D. dendriticum, мышцы были PGE2-негативными. Эпителий кишки и матки, а также мужских половых путей проявлял только слабое окрашивание. Интенсивную окраску имели ооциты, тогда как эмбрионы и сперма не проявляли реакции на PGE2.

Другой тип клеток, показавший позитивную иммунореакцию на PGE2 и PGD2 у плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta, – это циртоциты. Данные простагландины были обнаружены в цитоплазме циртоцитов. Слой цитоплазмы между ядром и пучком ресничек имеет большую толщину, и поэтому – более интенсивную PGE2-ИР. Цитоплазма, окружающая пучок ресничек, имеет менее интенсивную PGE2-ИР благодаря меньшей толщине. В настоящем исследовании, также как и в предыдущих (Gustafsson et al., 1994), показана иннервация экскреторного канала 5-HT-ИР and ГАМК-ИР нервами. Циртоциты являются частью осморегуляторной системы. Циртоциты фильтруют межклеточную жидкость тела цестод и выводят ненужные вещества в систему каналов. Продольные экскреторные каналы открываются в самой последней проглоттиде, где и происходит непосредственный выход секреторно-экскреторных продуктов во внутреннюю среду организма хозяина. Таким образом, осморегуляторная система – следующая система, задействованная в выработке и, потенциально – экскреции – PGE2 и PGD2 и других возможных иммуномодуляторов в ткани хозяина.

В отличие от D. dendriticum, у плероцеркоидов L. interrupta специфическая реакция на PGE2 была выявлена также в цитонах тегумента. Потенциально, вырабатываемый цитонами тегумента PGE2, выводится в наружную цитоплазму тегу-мента. Такая интенсивная реакция на PGE2 у плероцеркоидов L. interrupta, по сравнению с D. dendriticum, может быть адаптацией к открытому обитанию плероцеркоидов L. interrupta в полости тела С. auratus, тогда как D. dendriticum в полости тела С. migratorius защищен капсулой. В этом случае плероцеркоиды L. inerrupta подвергаются более интенсивной антипаразитарной иммунологической реакции со стороны организма хозяина. В связи с чем, у плероцеркоидов L. inter-rupta возникает необходимость оказывать более сильное иммуномодулирующее воздействие на организм хозяина, что позволяет паразиту успешно завершить свой жизненный цикл.

Локализация PGD2, главным образом, связана с мышечными волокнами плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta. PGD2 был обнаружен во всех мышечных слоях: кольцевых и продольных субтегументальных; продольных, дорзо-вентральных и поперечных мышцах тела. Среди паразитических червей PGD2 был обнаружен биохимическими методами у трематод и нематод (Daugschies and Joachim, 2000; Angeli et al., 2001; Noverr et al., 2003). Известно, что одна из функций PGD2 – расслабление гладкой мускулатуры (Narumiya et al., 1999). Настоящими исследованиями показано, что иннервация мышечных волокон D. dendriticum осуществляется ГАМКергическими и серотонинергическими мотонейронами (Би-серова, Кутырев, 2014; Biserova et al., 2014), также FMRFамид-ИР перикарионы и нервные волокна были найдены в тесной ассоциации с мускулатурой (Gustafsson et al., 1985; Gustafsson, 1990). В настоящем исследовании также показана иннервация мускулатуры L. interrupta ГАМК-, FMRFамид- и серотонинергическими нейронами. Вероятно, простагландин D2, выявленный в мышечных клетках пле-роцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta, играет модуляторную роль в отношении медиаторов, обеспечивающих сокращение и расслабление мышц.

Роль простагландинов, как иммуномодуляторов, активно изучается на протяжении последних 20 лет (Noverr et al., 2003; Kubata et al., 2007; Averina, Kutyrev, 2011). PGE2 является модулятором иммунитета, воздействующим на ключевые клеточные элементы (Kalinski, 2012). Известно, что при паразитозах у млекопитающих, PGE2 паразитов модулирует воспалительный процесс и последующую активацию адаптивной иммунной системы (Bowman et al., 1996; Harris et al., 2002). Кроме того, PGE2 ингибирует IL-12 и TNF- и усиливает выработку IL-4 и IL-10, которые подавляют Th1 (Т-хелперы 1 типа) иммунный ответ (Ramaswamy et al., 2000; Harizi et al., 2002; Vassiliou et al.; 2003; Winzler et al., 1997; Iwasaki, 2007; Demeure et al., 1997). PGE2 подавляет секрецию IFN- и IL-2, что приводит к активации Th2 (Т-хелперы 2 типа) иммунного ответа (Betz, Fox, 1991). Таким образом, используя PGE2, паразиты изменяют иммунный ответ хозяина с типа Th1 на Th2. Иммунный ответ хозяина типа Th1 является защитным против инвазии паразитами, и подавление этого ответа является благоприятным для выживания паразитов.

Простагландины также играют важную роль и в регуляции иммунитета рыб. Главным образом, они обладают иммуносупрессивным и противовоспалительным эффектами (Gmez-Abelln et al., 2016). Ранее было показано, что PGE2 оказывает ингибиторное действие на пролиферацию лейкоцитов радужной форели (Secombes, 1994). Кроме того, PGE2 стимулирует у лейкоцитов радужной форели экспрессию таких цитокинов, как интерлейкин-6 (IL-6) и IL-10, и подавляет экспрессию tnf, мембранного иммуноглобулина IgM (mIgM), мембранного и растворимого IgT (m/sIgT) и генов, вовлеченных в клеточный иммунитет, таких как гамма-интерферон (INF), и белок, индуцированный гамма-интерфероном (-IP) (Belmonte et al., 2014). PGE2 также подавляет экспрессию главного комплекса ги-стосовместимости II типа (MHCII) в лейкоцитах головной почки форели (Secombes, 2001). Воздействие PGE2 на макрофаги морского карася вызывает их М2-поляризацию, выражающуюся в высокой экспрессии IL-10, генов маннозного рецептора 1 типа и аргиназы-2. В противоположность этому, у ацидофильных гранулоцитов головной почки PGE2 вызывает деактивацию, поскольку снижается продукция реактивных форм кислорода и экспрессия генов, кодирующих провос-палительные цитокины (Montero et al., 2016). dHyKePGD2 и dMePGD2 – синтетические аналоги PGD2 – ингибируют индукцию активных форм кислорода и экспрессию IL-1 в ацидофильных гранулоцитах головной почки морского карася, стимулированных Vibrio anguillarum (Gmez-Abelln et al., 2015).