Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1. Методические подходы для анализа видового состава грибов 10
1.1. Морфологические методы анализа грибных патогенов 10
1.2. Молекулярные методы исследования видового состава грибных сообществ 13
1.3. Фитопатогенные грибы - возбудители заболеваний листьев пасленовых культур 28
1.4. Методы молекулярной диагностики фитопатогенных грибов 45
Глава II. Материалы и методы исследований 66
Часть III. Результаты и их обсуждение 85
Глава 3.1. Молекулярная идентификация видового состава грибов и грибоподобных организмов в пораженных растительных тканях 85
3.1.1. Рестрикционный анализ клонов 86
3.1.2. Исследование видового состава грибов и грибоподобных организмов в пораженных листьях Solanum tuberosum 90
3.1.3. Видовой состав грибов и грибоподобных организмов в пораженных листьях Solanum lycopersicum 97
3.1.4. Видовой состав грибов и грибоподобных организмов в пораженных листьях Solanum dulcamara 102
Глава 3.2. Конструирование тест-систем для идентификации видов рода Alternaria 115
3.2.1. Выделение изолятов Alternaria 116
3.2.2. Вирулентность штаммов Alternaria sp. к сортам картофеля и томата 116
3.2.3. Изучение активности сериновых протеиназ, секретируемых двумя различающимися по вирулентности штаммами A. alternata 120
3.2.4. Определение нуклеотидных последовательностей видов Alternaria 122
3.2.4.1. Анализ нуклеотидных последовательностей ядерных рибосомных генов 123
3.2.4.2. Анализ последовательности нуклеотидов участка гена mt LSU
рДНК 128
3.2.5. Подбор праймеров для идентификации видов Alternaria и проверка их видоспецифичности 130
3.2.6. Разработка диагностических систем для идентификации видов Alternaria с использованием ПЦР в реальном времени (РВ ПЦР) 133
4.1. Молекулярная идентификация видов Alternaria alternata и A. solani в пораженных листьях с использованием ПЦР в реальном времени 141
4.2. Молекулярная идентификация видов Alternaria в пораженных листьях методом классической ПЦР 147
4.3. Идентификация Colletotrichum coccodes с помощью ПЦР. 153
Заключение 157
Выводы 158
Научно - практические рекомендации 159
Благодарности 160
Список работ, опубликованных по теме диссертации 161
- Морфологические методы анализа грибных патогенов
- Фитопатогенные грибы - возбудители заболеваний листьев пасленовых культур
- Исследование видового состава грибов и грибоподобных организмов в пораженных листьях Solanum tuberosum
- Подбор праймеров для идентификации видов Alternaria и проверка их видоспецифичности
Морфологические методы анализа грибных патогенов
В последние годы для анализа микробных сообществ разработано большое количество молекулярных методов, которые предоставляют широкие возможности для исследования в сравнении с традиционными подходами. Например, Торсвик и соавторы (Torsvik et al., 1998) показали, что только 1% почвенных бактерий могут быть выделены и культивированы с использованием традиционных методов. Многие грибы вообще не могут быть культивированы с использованием стандартных подходов (Thorn, 1997; van Elsas et al., 2000), что привело к разработке различных методов, не требующих выделения чистых культур.
Несмотря на большое фундаментальное и практическое значение, видовое разнообразие и функциональная роль грибов в различных сообществах сравнительно мало изучались до последнего времени. В основном такие исследования проводились для анализа грибных сообществ почвы. При определении таксонов грибов по морфологическим признакам, грибы, не образующие спороносных структур, требовательные к субстрату, могут не обнаруживаться исследователем. В настоящее время, благодаря современным молекулярным подходам, появилась возможность максимально выявлять и изучать члены сообществ, населяющих разнообразные экосистемы (Казарцев, 2013).
Современные методы молекулярной диагностики основываются на технологии полимеразной-цепной реакции (ПЦР), в которой тотальная ДНК/РНК, выделенная из почвы, используется для предварительной амплификации интересующего таксономически значимого участка геномной ДНК. В случае эукариотических организмов гены рибосомной РНК, (особенно малой субъединицы рибосомной РНК – 18S рРНК), являются основной мишенью при определении членов микробного сообщества (Kowalchuk et al., 2006). Гены большой субъединицы рибосомной РНК, 28S рРНК, также использовались для исследований (Mhlenhoff et al., 2001), но значительно реже, чем 18S рРНК. Эти участки интересны для таксономической идентификации благодаря следующим свойствам: (I) повсеместное присутствие во всех известных организмах; (II) присутствие консервативных и вариабельных областей; (III) экспоненциально расширяется число депонированных в Генбанке последовательностей, используемых для сравнения. В случае анализа сообщества в пробе окружающей среды, консервативные регионы служат сайтами отжига (в ПЦР) для соответствующих универсальных праймеров, тогда как вариабельные области могут быть использованы для филогенетической дифференциации. Кроме того, высокое число копий рДНК в клетках облегчает их обнаружение в пробах окружающей среды.
Тем не менее, в связи с малым числом различий в генах 18S рДНК среди родственных видов грибов таксономическая идентификация обычно ограничивается на уровне рода или семейства. Для того чтобы увеличить уровень таксономической идентификации, для исследований обычно используют и внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS), которые находятся между 18S рДНК и 28S рДНК (White et al. 1990; Gardes, Bruns, 1993) (рис. 1.1.).
Строение участка рибосомной ДНК грибов. В связи с быстрой эволюцией некодирующие регионы ITS имеют гораздо большую вариацию последовательностей ДНК среди близкородственных видов, чем регионы, кодирующие гены рРНК. Гены, кодирующие функциональные белки, также были использованы в качестве генетических маркеров некоторых групп, например, ген лакказы аскомицетов (Lyons et al., 2003), или для того, чтобы получить более высокое разрешение у определенных таксонов грибов (Fusarium elongation factors; Yergeau et al., 2005). Эти генетические маркеры были амплифицированы с использованием специфических праймеров с ДНК или РНК почвы. В настоящее время доступны различные наборы праймеров для ПЦР, ориентированные на грибные последовательности ДНК (Anderson, Cairney, 2004). Выбор специфических праймеров для ПЦР является одним из самых важных факторов, влияющих на исходные результаты в анализе грибных сообществ (Jumpponen, 2007; Hoshino, Morimoto, 2010).
При анализе ДНК пораженного органа растения, ПЦР-продукты, как правило, являются смесью генов-мишеней, таких как рДНК, часто одного размера, полученных из различных видов грибов. Для идентификации видов должна быть проведена дифференциация этих последовательностей, что может быть сделано только на основе анализа нуклеотидного состава. Состав подобных комплексных ПЦР продуктов анализируют с помощью методов, основанных на электрофоретическом разделении фрагментов изучаемых последовательностей, либо на определении последовательностей нуклеотидов (клонирование с последующим секвенированием, технологии секвенирования второго поколения и др.) (Nocker et al., 2007).
Методы фингерпринтинга ДНК позволяют получать профили тотальной ДНК сообществ на основе прямого анализа ПЦР продуктов из окружающей среды (Muyzer, 1993). Эти методы включают денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ, DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Muyzer, 1993), термальный градиентный гель-электрофорез (ТГГЭ, TGGE — Temperature Gradient Gel Electrophoresis, Felske et al., 1998), анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP — Single strand conformation polymorphism, Callon et al., 2006), полиморфизм длин терминальных рестрикционных фрагментов (ТПДРФ, TRFLP erminal Restriction Fragment Length Polymorphism, Dickie, FitzJohn, 2007), рестрикционный анализ амплифицированной рибосомной ДНК (ARDRAAmplified Ribosomal DNA Restriction Analysis Schmidt, Moreth, 1999), автоматизированный анализ рибосомных межгенных спейсеров (АРИСА, ARISA - automated method of ribosomal intergenic spacer analysis, Ranjard et al., 2001), случайно амплифицированная полиморфная ДНК (RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA, Welsh, McClelland, 1990), и другие. В основе этих методов лежит дифференциация сообществ микроорганизмов по полиморфизму последовательностей ДНК или полиморфизму длин фрагментов ДНК. Эти подходы были разработаны для того, чтобы выявить какое-либо внешнее воздействие на исследуемые сообщества или показать различия между сообществами, однако они не дают возможность получать непосредственные таксономические данные о компонентах сообщества.
Методы, включающие электрофорез фрагментов ДНК, подходят для получения данных об общем генетическом разнообразии микробных сообществ почвы. Продукты ПЦР разделяют электрофорезом на основе нуклеотидного состава. Данные электрофоретических профилей, т.е. положение и относительная интенсивность различных групп или пиков, могут быть переведены в числовые данные, которые применимы для расчета индексов разнообразия и статистического анализа, что дает возможность сравнения различных образцов.
В настоящее время, в основном, используются три метода электрофореза: денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ), терминальный рестрикционный анализ полиморфизма (Т-ПДРФ), и автоматизированный анализ рибосомных межгенных спейсеров (АРИСА). Эти подходы основаны на разных принципах (рис. 1.2.).
Фитопатогенные грибы - возбудители заболеваний листьев пасленовых культур
В работе использовали сорта картофеля разных групп спелости Российской и Белорусской селекции. Ранние - Зорачка и Лилея белорусская; среднеранние - Бриз, Манифест, Романо, Невский; среднеспелые - Волат, Лад, Скарб и Янка; среднепоздние - Вектар белорусский, Журавинка и Рагнеда (всего 13 сортов), а также коммерческие сорта крупноплодного томата - Дубрава, Томск, Ля-Ля-Фам, Верлиока, Бычье сердце. Все растения выращивали на обогащенном торфяном субстрате (производство ЗАО «МНПП «ФАРТ») при 20-24С и естественном фотопериодизме в изолированной от внешней среды теплице; для посадки использовали оздоровленные пробирочные растения. Полив проводили по мере необходимости, во время вегетации растения удобрениями не подкармливали. Для заражения брали листья 4-6 ярусов, считая от верхушки (средний ярус). Заражение проводили во влажных камерах, представляющих собой чашки Петри, на дно которых помещали увлажненную стерильной дистиллированной водой фильтровальную бумагу. На увлажненную бумагу клали предметные стекла, а на них - предназначенный для заражения лист.
В работе использовали изоляты, выделенные в чистые культуры из пораженных образцов картофеля и томата (таблица 2.3). Выделение изолятов проводили со свежесобранных листьев и клубней картофеля, а также листьев и плодов томата. Клубни картофеля брали в течение 10-30 дней после уборки, выделение проводили только с конидиеносцев, появившихся на живой ткани клубня. Пораженные образцы закладывали во влажные камеры; выделение проводили с границы живой и здоровой ткани. Штамм PPL 31 был передан сотрудниками лаборатории микологии и фитопатологии ВНИИ защиты растений. Таблица 2.3. Характеристики использованных в работе изолятов.
Для получения инокулюма изоляты выращивали на картофельно-морковной агаризованной питательной среде в течение времени, необходимого для формирования конидий (7-10 дней). Конидии A. alternata смывали с колоний в стеклянных чашках Петри, добавляя 10 мл стерильной воды. Для получения конидий A. solani применяли другой метод: после инкубации в течение 7-10 дней удаляли воздушный мицелий, после чего чашки облучали ультрафиолетом и помещали в холодильник (+5С) на ночь. Для заражения использовали суспензию конидий в концентрации 100 шт/мкл. Через 3 дня инкубации споры смывали с поверхности среды 10 мл стерильной дистиллированной воды. На поверхность листа дозатором наносили каплю (10 мкл) суспензии конидий и столько же стерильной воды в контроле. Учет заражения проводили на 7-е сутки инкубирования при комнатной температуре. Все эксперименты проводили в 3-х повторностях. 2.6. Подготовка материала для анализа ферментативной активности
Грибы выращивали на жидкой картофельной среде (Valueva et al, 2013). Через 5, 10, 18 суток роста мицелий отбирали на предварительно взвешенный бумажный фильтр Whatman No. 41. После отбора на фильтр, мицелий отмывали от остатков среды стерильной дистиллированной водой, высушивали в течение 8 часов (дальнейшей потери веса при более длительном периоде сушки не наблюдали) при температуре 90С, охлаждали в десикаторе и взвешивали. Культуральную жидкость, оставшуюся после извлечения мицелия, использовали при оценке ферментативной активности. Работа выполнялась совместно с Н.Н. Кудрявцевой в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН.
Ферментативную активность сериновых протеиназ определяли по методу Эрлангера (Erlanger et al, 1961) с использованием синтетических субстратов: BAPNA (N-benzoyl-DL-arginine-nitroanilide) при оценке трипсиноподобной активности и Z-AALpNA (N-carbobenzyloxy-L-Ala-L-Ala-L-Leu-pNa) при оценке субтилизиноподобной активности. Начальная концентрация субстрата составляла 0.5 ммоль. Одна единица активности (U) - количество фермента, которое гидролизует 1 нмоль субстрата за 1 мин. Все эксперименты, связанные с оценкой ферментативной активности, выполняли в 3-х повторностях.
Наращивание мицелия для выделения ДНК проводили в чашках Петри на жидкой гороховой среде. При достижении необходимой биомассы мицелий снимали с чашек, отмывали стерильной дистиллированной водой, подсушивали, при необходимости хранили в микропробирках при -20С несколько дней до начала выделения. Выделение ДНК из штаммов проводили по ниже приведенной стандартной методике (Колесников и др., 2003): 1. Небольшой фрагмент мицелия растирали с жидким азотом в стерильной керамической ступке; 2. В пробирку с 0,25 мл растёртого мицелия добавляли 700 мкл лизирующего СТАВ - буфера и инкубировали при 65C в течение часа; 3. К полученной смеси добавляли 500 мкл хлороформа и центрифугировали 10 мин. при 13 000 об./мин.; 4. Отбирали 500 мкл надосадочной жидкости, добавляли к ней ещё 500 мкл хлороформа и повторяли центрифугирование; 5. К полученному супернатанту добавляли 400 мкл изопропанола и 60 мкл 5М ацетата калия, центрифугировали 10 мин при 13 000 об/мин.; 6. Выпавший осадок ДНК дважды промывали охлаждённым 70 %-ным этанолом и ресуспендировали в 100 мкл деионизированной воды. ДНК хранили при температуре -20С. Состав лизирующего СТАВ буфера: 0,2 М Tris pH 8; 2 М NaСl; 0,05 М ЕDTA; 2 % CТАВ.
Выделение ДНК проводили из фиксированных в 70 % спиртовом растворе пораженных листьев картофеля и томата. Листья предварительно отмывали в стерильной дистиллированной воде, затем подсушивали на фильтровальной бумаге. Фрагмент листовой пластинки с большим очагом поражения или целую листовую пластинку с множественными очагами поражения растирали в стерильной ступке с жидким азотом. Дальнейшее выделение ДНК проводилось с использованием стандартного CTAB метода, описанного в разделе 2.7.1.
Исследование видового состава грибов и грибоподобных организмов в пораженных листьях Solanum tuberosum
Ни один из выделенных изолятов не показал себя вирулентным в отношении всех исследуемых сортов картофеля. Наибольшей вирулентностью отличались 2 изолята, выделенные из клубней картофеля (KPT 1 и KPT 4), и один - из листьев томата METL 5, которые смогли заразить листья в 10-11 из 13 исследованных сортов. Наименьшей вирулентностью отличался штамм, выделенный из пораженного плода томата (MTF 7), заразивший листья 7 сортов. Изолят A. solani (PPL 31) не показал высокой вирулентности, заразив листья 8 из 13 сортов картофеля.
Аналогичная ситуация наблюдалась при изучении вирулентности в отношении сортов томата. Листья всех исследуемых сортов были заражены только изолятом A. solani. Изоляты A. alternata, выделенные с плода (MTF 7) и с листа (METL 5) томата, заразили листья 4 сортов, а изолят METL 12 -листья только 1 сорта (таблица 3.8.).
В работе был рассмотрен только один компонент агрессивности диаметр некроза на зараженном листе. Исследования показали, что наиболее агрессивными в отношении листьев картофеля разных сортов были штаммы, выделенные из клубня картофеля (KPT 1 и KPT 4) и METL 5 из листа томата (средний размер диаметра некроза у всех пораженных сортов составил 8,9-10,8 мм). Эти же штаммы были вирулентны в отношении максимального числа сортов картофеля (поражали листья 10 - 11 сортов, таблица 3.7.). Изоляты METL 5 и KPT 4 вызвали значительные некрозы (диаметром по 20 мм) на листьях сорта Рагнеда, который не поразился другими изолятами, включая A. solani. Изолят KPT 4 был единственным, заразившим сорт Лилея белорусская, а KPT 1 - сорт Янка.
Сильные отличия в диаметрах некрозов отмечены и при заражении сортов томата (таблица 3.8.). Штамм METL 12 заражал листья сорта Дубрава, но не инфицировал остальные сорта. Штамм METL 5 вызывал сильное поражение листьев сортов Дубрава и Бычье сердце (диаметры поражения 18 -20 мм), а штамм A. solani значительно поражал сорт Дубрава (диаметр - 35 мм).
Результаты проведенных экспериментов показали наличие внутривидовых различий в вирулентности и агрессивности у A. alternata в отношении листьев разных сортов картофеля и томата. Некоторые изоляты заражали сорта, не поражаемые другими изолятами, что может свидетельствовать об экспрессии генов специфической устойчивости к A. alternata у исследованных сортов картофеля и томата.
Изучение активности сериновых протеиназ, секретируемых двумя различающимися по вирулентности штаммами A. alternata На двух штаммах, различавшихся по патогенности, нами совместно с институтом биохимии имени А.Н. Баха РАН проводилось изучение активности сериновых протеиназ. Данная работа осуществлялась в связи с тем, что большую роль в питании фитопатогенов, к которым относятся и возбудители альтернариоза, играют секретируемые во внешнюю среду гидролитические ферменты, которые делают макромолекулярные соединения доступными для использования в пищевых целях. К группе гидролитических ферментов относятся и протеазы. Внеклеточные протеазы, выделяемые грибами, способны мацерировать ткани растения и разрушать компоненты клеточной стенки, что позволяет преодолевать естественную резистентность растения-хозяина. Таким образом, они выполняют функцию не только пищеварительных ферментов грибов, но и во многих случаях участвуют в процессе патогенеза (Dunaevskii et al., 2006).
В настоящее время имеются данные, позволяющие предположить, что сериновые экзопротеиназы, секретируемые некоторыми растительными патогенными грибами, могут рассматриваться как факторы патогенности. Так, в работе (Dunaevskii et al., 2006) было показано, что фитопатогенные грибы, в том числе и A. alternata, секретируют в окружающую среду трипсиноподобные и субтилизиноподобные протеазы. Хотя синтез протеиназ – конститутивный, спектр протеаз фитопатогенных видов, в том числе и некротрофных, должен отличаться от спектра протеаз сапротрофов.
Проведенная работа показала (табл. 3.9.), что различия в активности сериновых протеиназ наблюдаются не только на межвидовом, но и на внутривидовом уровне и связаны с вирулентностью и агрессивностью штаммов.
Оба изолята, исследованные по активности, были выделены из живого листа томата с симптомами поражения альтернариозом. Возможно, различия в секреции трипсиноподобных и субтилизиноподобных протеиназ связаны с различиями штаммов по трофической приуроченности: более патогенный с высоким уровнем трипсиноподобной активности штамм METL 5 способен поражать живые ткани листьев, а значительно менее агрессивный и вирулентный METL 12 с высоким уровнем субтилизиноподобной активности, развивается на отмершей ткани и активно утилизирует субстрат как сапротроф.
Полученные нами данные соответствуют результатам других исследователей. Так, в работе Дунаевского и др. (2006) показано, что сапротрофные виды Trichoderma harcianum, Penicillium terlikowskii, Penicillium chrysogenum отличаются высокой активностью субтилизиноподобных протеиназ и не производят трипсиноподобные протеиназы, в то время как фитопатогенные виды Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Ulocladium botrytis наряду с субтилизиноподобной производят и трипсиноподобную протеиназу. По мнению Дунаевского и др. (2006) высокий уровень трипсиноподобной активности внеклеточных сериновых протеиназ наблюдается у изолятов с высокой патогенностью, в связи с чем этот показатель может использоваться в качестве маркера при исследовании вирулентности и агрессивности разных видов грибов. Наша работа показывает, что секреция трипсиноподобных протеиназ связана с патогенностью и на внутривидовом уровне.
Подбор праймеров для идентификации видов Alternaria и проверка их видоспецифичности
Согласно литературным данным в качестве основного возбудителя альтернариоза пасленовых культур указывается A. solani (Dang et al., 2015). В то же время, наши результаты показывают, что вид А. alternata (sensu lato), в целом, чаще встречался в исследованных образцах картофеля и томата. Крупноспоровый вид А. solani в Московской области и в Краснодарском крае превосходил по встречаемости остальные виды, как в пораженных листьях картофеля, так и томата. В то же время вид не был обнаружен на листьях томата в Ростовской области и картофеля в Анапском районе Краснодарского края.
Вид A. infectoria встречался значительно реже, был выявлен не во всех исследованных образцах. Однако, были обнаружены образцы, в которых встречался только этот вид, что свидетельствует в пользу возможности самостоятельного заражения растений штаммами A. infectoria.
Наличие большого количества пораженных образцов с симптомами альтернариоза, в которых не было выявлено грибов рода Alternaria может объясняться тем фактом, что схожие симптомы пятнистостей были вызваны другими возбудителями (Cladosporium fulvum, Xantomonas sp. и пр.).
Данная работа по идентификации возбудителей альтернариоза и изучению их распространенности на территории Российской Федерации с помощью ПЦР проводилась впервые. Работы, проводимые ранее, по изучению видов Alternaria с помощью исследования чистых культур показали схожие результаты (Ганнибал и др., 2010). Однако, нами не был обнаружен вид A. tomatophyla, описанный как основной патоген томата (Simmons, 2007).
Полученные нами праймеры могут использоваться для диагностики видов Alternaria и способствовать идентификации данных видов в случаях, когда патогены образуют похожие симптомы поражения или если их идентификация по морфологическим признакам вызывает затруднения.
Colletotrichum coccodes вызывает заболевания, известные под названием антракноз (язвы на корнях, стеблях и плодах) и черная пятнистость (симптомы типа "серебристая парша" на клубнях). Общим для всех типов поражений, вызываемых C. coccodes является наличие точечных черных склероциев на пораженных тканях. ДНК этого вида также была найдена нами среди клонированных фрагментов ДНК листьев картофеля. Для избирательной амплификации C. coccodes выбраны праймеры, разработанные шотландскими исследователями (Cullen et al., 2002, таблица 3.16.). Данная пара праймеров подобрана к ITS региону рДНК и в их работе применялась во втором раунде nested ПЦР, после амплификации ITS региона.
C. coccodes, выделенных нами из клубней картофеля. Амплифицированный фрагмент составил 349 пн. Отрицательный результат получен на выборке других грибных патогенов картофеля и томата (рис. 3.45.). 153 Рис. 3.46. Электрофореграмма контрольных ПЦР амплификаций с праймерами Cc1NF1/Cc2NR1. Данный набор праймеров был проверен в амплификации с образцами ДНК, выделенных из здоровых и пораженных клубней (рис. 3.47.).
Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК C. сoccodes. 1-5 - клубни сорта Удача без симптомов поражений из Костромской области, 6 -11 -пораженные клубни разных сортов из Гусь-Хрустального, 12-14 - клубни сорта Джелли, без симптомов поражений из Брянской области, 15 - 16 – положительный контроль.
В результате амплификация прошла успешно с ДНК из пораженных антракнозом клубней и наблюдалось отсутствие продукта амплификации с ДНК здоровых клубней. Вероятно, в части клубней сорта Удача из Костромской области существовало скрытое поражение указанным патогеном и амплификация прошла с 1- 3 образцами. Праймеры также были протестированы для амплификации с ДНК 89 образцов, выделенных из
Таким образом, в настоящей работе впервые были применены праймеры для идентификации C. сoccodes в фиксированных пораженных листьях картофеля и томата, и впервые в России проведена ПЦР -идентификация возбудителя антракноза в клубнях.
Выбранные диагностические праймеры позволяют эффективно выявлять C. сoccodes в разных органах картофеля и томата. Полученные в процессе исследования результаты подтверждают данные, установленные с помощью клонирования и секвенирования (глава 3.1.), где было обнаружено присутствие возбудителя антракноза C. coccodes на листьях картофеля. С помощью ПЦР-идентификации впервые в России патоген был обнаружен и в листьях томата. Кроме того, было показано одновременное присутствие C. coccodes в некрозах с A. alternata.
Данные праймеры использовались для детекции C. coccodes в плодах авокадо, манго, маракуйи и персика в Бразилии (Tozze Jnior H. J. et al., 2015). Они были применены для подтверждения морфологической идентификации чистой культуры вида, выделенного вместе с другими видами рода Colletotrichum из пораженных плодов перца в США (Lewis Ivey et al., 2004), а также для идентификации C. coccodes в почве из полей, используемых для коммерческих посадок картофеля (Brierley et al., 2009).
Данный вид обычно идентифицируют в почве и в клубнях, а его присутствие в некротизированных участках листьев до настоящего времени не было выявлено в Европе (Lees, 2003). В то же время в России C. coccodes был выделен из пораженных листьев картофеля в Ленинградской области (Ганнибал, 2007). Полученные результаты подтверждают нашу гипотезу о необходимости комплексного исследования некрозов из-за возможного развития на них нескольких видов патогенных микроорганизмов, не выявляемых при микроскопическом иссследовании.