Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Распространенность стронгилятозов пищеварительного тракта лошадей табунного содержания в Центральной и Западной Якутии .12
1.2. История изученности иособенностейхищных нематофаговых грибов Arthrobotrys oligospora 19
1.3. Природно-климатические условия Якутии 26
2. Собственные исследования .35
2.1. Материалы и методы исследований 35
2.2.Стронгилятозы пищеварительного тракта лошадей табунного содержания в Якутии и распространение их Центральной и Западной Якутии, лечение и профилактика с применением антгельминтного препарата Эквисект 41
3. Изучение отдельных представителей микологического биоценоза почвы Центральной и Западной Якутии 49
3.1. Изучение микологического биоценоза почвы в условиях Центральной и Западной Якутии 49
3.2. Разработка методики выделения штаммов нематофаговых грибов рода Arthrobotrys oligospora из мерзлотных почв Якутии 53
3.3. Изучение морфологической и физиологической характеристики нематофаговых грибов рода Arthrobotrys oligospora L3-1 и L3-2 68
3.4 Изучение нематофаговой активности штаммов хищных грибов Arthrobotrys oligospora L3-1 и L3-2 против стронгилят лошадей и их личинок .80
4. Биоэкологические основы борьбы со стронгилятозами лошадей табунного содержания в Якутии .88
4.1. Разработка методики получения биологически активного средства на основе миценальной массы нематофаговых грибов рода штаммов L3-1 и L3-2 Arthrobotrys oligospora 88
5. Обсуждение результатов исследований 99
6. Выводы .102
7. Практическое использование полученных научных результатов 104
8. Рекомендации по использованию научных результатов .105
9. Список использованной литературы 106
Приложения 122
- История изученности иособенностейхищных нематофаговых грибов Arthrobotrys oligospora
- Разработка методики выделения штаммов нематофаговых грибов рода Arthrobotrys oligospora из мерзлотных почв Якутии
- Изучение нематофаговой активности штаммов хищных грибов Arthrobotrys oligospora L3-1 и L3-2 против стронгилят лошадей и их личинок
- Обсуждение результатов исследований
История изученности иособенностейхищных нематофаговых грибов Arthrobotrys oligospora
Первыми описанными в литературе хищными грибами являются артроботрис пышный (Arthrobotrys superba) и артроботрис малоспоровый (Arthrobotrys oligospora), их долгое время считали обычными сапрофитными грибами. Однако, М.С. Воронин в 1864 г. наблюдая образование на мицелиях артроботриса малоспорового колец и сетей, описал их как вид несовершенных грибов, имеющих хорошо развитый мицелий, но гифы обладают способностью образовывать специальные, улавливающие нематод приспособления. В1871 годуу хищных грибов такие же кольца и сетинаблюдал Н.В. Сорокин и описал, что переплетаясь, соединяются в сложные сети, а роль сетей у хищного гриба в улавливании нематод была представлена в работахконца XIX векау немецкого ученого Zopf (1888, 1890). Однако, интенсивное изучение хищных грибов было начато значительно позже, после появления в 30-х годах прошлого столетия работ американского ученого Drechsler по морфологии и систематике хищных грибов.
В Советском Союзе и зарубежом была проведена относительно большая работа по изучению физиологии нематофаговых грибов и их культуральные характеристики (Малыгин, 1936; Сопрунов, 1958; Мехтиева, 1969Zopf, 1890; Drechsler, 1939;Diddington, 1959, 1963).
Отечественные исследователи еще в 1930-х годах вели исследовательские работы по изучению хищных грибов распространенных в Узбекистане, в Азербайджане, последующем, были определеныи занесены в определитель около 80 видов хищных грибов (Т.А. Лукьянченко 2000, С.А. Малыгин 1936, Ю.Ф. Петров, И.Б. Петров 1988, Р.М. Яхья-Заде 1987). Проведены,так же изучение близкородственных им групп, различных видов сапрофитных грибовотносящихся к группе хищников.
Наш соотечественник И.И. Кораб, предпологал возможность практического использования хищных грибов, как естественных врагов нематод, на основании обнаружения хищного гриба Arthrobotrys oligosporа, который поглащал нематод паразитирующих у растений. Также указывают на использование высших «растений-приманок» или «ловчих» растений уже давноуказано, как один из методов борьбы с гельминтами в почве
Как мы знаем в разных природно-климатических зонах и условиях микроскопические грибы существуют в виде мицелия и спор, как в природе и при посевах на питательные среды развитие нематофаговых грибов происходит не только из спор, но и из фрагментов мицелия. Жизнеспособность фрагментов мицелия и прорастание спор могут достигать наибольших значений, в зависимости от различных факторов среды обитания и влияния экологических факторов, а жизнеспособность хищных грибов и их фрагментов, возможно, определять, особой способностью этих грибов питаться нематодами и их личинками (В.С. Ершов 1939, J.Eren 1968, A. S. Fernandes 1998). Также по данным А.А. Раджабовой, З.Э Беккер, 1990о развитии мицелий и гифов обладающих способностью образовывать специальные улавливающие аппараты разного типа, имеющие вид петель, колец или сложных сплетений покрытые липким веществом относятся к группе сесквитерпенов, типа политерпеновогоуглеводорода. Другие исследователи определяют жизнеспособность фрагментов исходной длиной фрагментов и строением мицелий, например, по описанию Дадингтона внутренняя поверхность активно сжимающихся колец сверхчувствительна по отношении нематод, т.е. если нематоды находятся вблизи фрагмента гриба, то клетки за долю секунды увеличиваются в несколько раз и нематода оказывается пойманной липким-клейким ловчим органом этого гриба. Имеются также данные о том, что нематоды сами приклеиваются к ловчим органам гриба, эти виды грибов отличаются своей способностью расщеплять и усваивать белки животного происхождения, а нематоды, в свою очередь стимулирует рост и образования улавливающих приспособлений. Также отмечали, что грибами в качестве источника органического азота используется первичные аминокислоты, такие как аспаргин и глютамин (Д.И. Шашко 1961, А.А. Шестеперов 2010)
По данным Gray (1987), Fritschand Lysek (1989),нематофаговые грибы– гифомицеты найдены практически во всех частях света и в разных климатических зонах. Вероятно, поэтому многими исследователями хищные грибы выделяются из всех образцов почвы, где только могут существовать нематоды.
Многие исследователи к хищным гифомицетам относят и представителей родов тридентария (Tridentaria) и трипоспорина (Triposporina) со звездчатыми спорами и другие грибы (A.Loos 1902). Они также отмечают, что в природе хищные гифомицеты многочисленны, но наиболее часто встречаются грибы из рода Arthrobotrys. Грибы из рода Arthrobotrys широко распространены и многочисленны, особенно в почве богатой органическим веществом, а увеличение в количественном отношении хищных грибов в почве, связывают с численностью коловраток и коллембол. Отмечено, что представители этого вида участвуют в процессе разложения органического веществаи занимают особое место среди микроскопических грибов по взаимоотношению со средой обитания и другими организмами, что можно использоватьих в качестве антогонистов для биологического контроля нематод (О.Л. Куликова 2009, Ф.Ф. Сопрунов 1958, В.Б. Удалова 1971). Повсеместное распространение нематофаговых грибовв природе свидетельствуетих значительной адаптационной возможности (С.А. Малыгин 1937, Ю.Ф. Петров 1988, Т.В. Теплякова 1999, A. Mclntosh).Многие авторы указывали, что применение нематофаговых грибов тормозило увеличение количество паразитующих у растений нематод (A.S.Fernandes 1998, A. Loos 1902). Имеются также сведения, что для определенного вида хищных грибов в почве существует определенный порог популяционной плотности нематод, например для рода Arthrobotrys oligospora это может составить 50 особей на 1 г. почвы, увеличение числа нематод в почве приводит к возрастанию хищнической активности гриба, значит,чем больше в почве нематод и их личинок, они становятся источником питания и способствуют к быстрому ростуи хищничествугрибов (Y.Mitsui1978). По мнению Мигуновой В.Д. (2002, 2004) штамм гриба Arthrobotrys oligospora А18 выделенный из дерново-подзолистой почвы, проявляет нематофаговую активность при наличии нематод в почве (А. Ш. Мамило 2000). Например авторы, нематофаговый эффект гриба рода Arthrobotrys oligospora по отношению к бактериоядной нематоде Caenorhabditis elegans отмечали не только на питательных средах, но и в почвенных микрокосмах, представляющих собой идеальную систему для изучения популяционной биологии нематофаговых грибов (C.S. Impey 1982).
В работах посвященныхвегетационным опытам нематофаговой эффективностигрибов на комплексы почвенных нематод в прикорневой зоне винограда и пшеницыотменили, что послевнесения препарата хищного гриба втечение двух месяцев наблюдалисокращение общей численности нематод паразитирующих в корневищахрастений (Ф.Ф. Сопрунов 1954).
В разных работах, также было отмеченоразвитиеArthrobotrys oligospora на питательных средах из конидий и мицелия имеются различные оптимумы. Например, формирования Arthrobotrys oligospora из конидий и развитие мицелий возможно и на более бедных и несбалансированных по питательности средах, как голодный агар илисреда лимитированная по азоту, так в богатых по питательному содержанию средах, таких дрожжевой морфологический агар или углеродно-азотная среда, был отмечен одинаковый рост. Как указывают литературные данные, впитательных средах для роста грибов прибавление витаминов и аминокислот может снизитьих хищническую активность, поэтому определяя хищническую активность грибов, это авторысвязывают с недостатком специфических соединений, которые отсутствуют в питательных средах (А. Ш. Мамилов 2000, J.Gronvold 1989).
Предлагается что хищничество грибов, является процесс, помогающий им преодолеть стресс в почве. Исследователи в лабораторных условиях при наличии личинок нематод увеличиваетсяспорообразования, для прохождения полного цикла развития, ускорения роста, репродукционного потенциалахищных грибов наличии личинок нематод необходимо (А. Ш. Мамилов 2000, Т.В. Теплякова 1982).
Известно, что грибы рода Arthrobotrys oligospora оказывают прямое влияние на минерализацию углерода и косвенную минерализацию азота в почве. При выборе хищнической стратегии гриба рода Arthrobotrys oligospora учитывается его дыхательная инициативность, следовательно, и интенсивность минерализации углеродом снижается на 25-35% при наличии органических веществна 12-е сутки (А.Ш. Мамилов 2000, Ю.Ф. Петров 1988).
Нематоды разнообразны и многочисленны из всех многоклеточных животных, живущих в почве, есть и нематоды – водные организмы и нуждаются, по крайней мере, в пленочной воде, по которой двигаются синусоидальным способом, а в почве движение нематод зависит от структуры, аэрации и влажности. Почвенные женематоды распространены во всех зонах земного шара – от жарких до полярных пустынь. Они способны переносить длительное воздействие неблагоприятных условий в неактивном состоянии, отличаются короткими циклами развития и могут быстро «накапливаться» в очагах разложения растительных остатков. Класс нематод в целом характеризуется признаками биологического прогресса: численность их постоянно возрастает, происходит захват новых сред обитания и увеличивается многообразие форм (М.Г. Сафронов 1996, C.L.Sears 1996).
Разработка методики выделения штаммов нематофаговых грибов рода Arthrobotrys oligospora из мерзлотных почв Якутии
Для выделения хищных нематофаговых грибов рода Arthrobotrys нами использованы пробы различных типов мерзлотных почв: мерзлотно-палевой, суглинистой, дерново-подзолистой, лугово-черноземной, а также различные субстраты: шерсть животных, содержимое кормушек ферм и др., растительный покров пастбищ, остатки стога сена и др., содержимое кишечника, фекалии лошадей.
Многие авторы исследований при выделении нематофоговых грибов использовали питательные среды, простой агар или среды МПА, на основании данных собственных экспериментов мы пришли к выводу, что питательные среды Чапека для грибов, пептонно-кукурузный агар являются полноценным питательным субстратом для хищных грибов рода Arthrobotrys oligospora. Разработана методика выделения нематофаговых грибов из мерзлотных почв Якутии. Использованы обогащенные среды Чапека для грибов, пептонно-кукурузный агар для получения от разных субстратов от почвы и фекалий, шерсти, растенийчистой культуры штаммов нематофаговых грибов рода Arthrobotrys oligospora и хранение хламидоспор.
Среда 1: Среда Чапека для грибов состав: сахароза - 30 г, NaNO3 - 2 г, KH2PO4 - 1 г, MgSO4х 7H2O – 5 г, KCl – 0,5 г, FeSO4х 7H2O - 0,1 г, дрожжевой экстракт – 10 г, вода - 1 л, агар-агар - 20 г. эта среда, является полусинтетической средой содержащий нитрат натрия в качестве единственного источника азота. Перед каждым посевом варили новую среду, для раствора брали 49,0 г порошка АгарЧапека-Докса для грибов 500 г (М075) или 35,0 г порошка М076 (агар бульон Чапека для грибов) размешивали в 1000 мл в дистиллированной воде. Полученную массу в водяной бане кипятили для полного растворения частиц порошка. Готовые среды стерилизовали путем автоклавирования при 1,1 атм. (121С) в течение 15 мин. Таким образом, получали среду, соответствующую по плотности 1,5%-ному агаровому гелю. Эта среда одна из наиболее широко распространенных для общего назначения культивирования грибов. Среда Чапека для грибов благодаря присутствию солей натрия, калия хорошо забуферена, pH имеет слабощелочное значение. Эту среду также использовали для чистой культуры выделенных грибов рода Arthrobotrys oligospora, а также в опытах их нематофаговой активности.
Среда 2: Среда солодового агара Чапека (для грибов), содержит солодовый экстракт 40 г, сахарозу 30 г, натрия нитрат 2,00 г, калия хлорид 0,5 г, магния сульфат 0,5 г, сульфат железа 0,01 г, калия гидрофосфат 1,0 г, агар-агар 20,0 г. для приготовления среды размешиваем 94,0 г готового для применения среды в 1000 мл дистиллированной воды до полного растворения, кипятили для получение однородной массы и полного растворения частиц. Стерилизуем среду автоклавированием при 1,1 атм. (121С) в течение 20 мин. Эта среда нами часто использована для выделения и культивирования сапрофитных видов и плесневых грибов, главным образом пенициллов. Среда содержит нитрат натрия в качестве единственного источника азота, и солодовый экстракт являются источниками углеводов для роста грибов, среда слаба кислая, значение рН 5-5,2 поэтому способствует росту несовершенных, низших и сапрофитных грибов, на этом агаре обильно растутв т.ч. Mucor, Aspergillus, поэтому при опытах проводились повторные пересевы, также среду можно использовать для хранения выделенных нами грибов рода Arthrobotrys oligospora в чистой культуре, т.к. питательная среда обогащенная источником углеводов солодовым экстрактом дает обильный рост на косом агаре в биологических пробирках, обеспечивает хорошее питание и длительное время хранения чистой культуры.
Среда 3: Среда агар пептонно-кукурузный, содержащий настой кукурузной муки 50 г., глюкозу 2 г, дрожжевой экстракт 4 г., агар-агар 15 г. Размешать 17,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды, прокипятить для полного растворения частиц, среду стерилизуем автоклавированием при 1,1 атм. (121С) в течение 15 мин.
В наших опытах они стали основными питательными средами для выделения штаммов нематофаговых грибоврода Arthrobotrys oligospora рода Arthrobotrys oligospora, а также для получения и формирования хламидоспор при культивировании штаммов. Эти средысодержат достаточное количество питательных веществ, а содержание глюкозы способствует обильному росту мицелий и хламидоспор.
Методика выделение штаммов нематофаговых грибов рода Arthrobotrys oligospora из мерзлотных почв Якутии разрабатывался для получения и выращивания хищного гриба в оптимальных условиях, с учетом соотношения питательных элементов, температуры культивирования, роста и развития спорообразования грибов, способов инокуляции культуры и изучение нематофаговой активности.
Для выделение нематофагового гриба использованы пробы почв – мерзлотно-палевая, суглинистая, дерново-подзолистая, лугово-черноземная, а также содержимое кормушек, растительный покров пастбищ, остатка стога сена, фекалии из прямого кишечника молодняка и основного поголовья лошадей, перегнившего навоза, компоста, мульчи, древестная труха, шерсть лошади.
Пробы для посева на питательную среду брали по 1 г. и переносим в 10 мл дистиллированной воды,периодически встряхиваем иотстаиваем 30 мин., затем из водной суспензии пробы набираем0,5 мл инокурируем на питательную среду. Для этого питательную среду разливаем по стерильным чашкам Петри с толщиной 0,3 мм для того, чтобы хорошо просматривался рост колоний грибов и выдерживаем трое суток при комнатной температуре, затем на четвертые сутки вносим культивированные личинки стронгилят: на опытных чашках с № 1 - 3 по 10 экз. личинок, № 4-6 по 30 экз. личинок, № 7-9 по 100 экз. личинок. Ставим в термостат при постоянной температуре + 28С.
Схема опытов:
1 опыт: разливаем по три чашки: № 1-3среду Чапекадля грибов содержащий дрожжевой экстракт, № 4-6 среда Чапека на солодовом агаре (для грибов), №7-9 среда агар пептонно-кукурузный толщина 0,3 мм: на 4 суткикак тест-объект вносим в опытные чашки +0,5 мл суспензии 0,5 мл водной суспензии гнилой древесиныставим на 3 день при комнатной температуре, на 7 день начала опыта ставим в термостат при температуре +28С на 7 суток, с 11 дня начинаем учет роста грибов: №1-3 – 10 экз. культивированных личинок стронгилят; №4-6 – 30 экз.культивированных личинок стронгилят; №7-9 – 100 экз. культивированных личинок стронгилят.
2 опыт: разливаем по 3 чашки Петри: №1-3 среду Чапека для грибов содержащий дрожжевой экстракт (толщина 0,3 мм), № 4-6 среда Чапека на солодовом агаре (для грибов), № 7-9 среда агар пептонно-кукурузный +0,5 мл водной суспензии мерзлотно-палевой почвы, на 4 суткикак тест-объект вносим культивированные личинки стронгилят: №1-3 – 10 экз.; №4-6 – 30 экз.; №7-9 – 100 экз.;
3 опыт: разливаем по 3 чашки Петри: №1-3 среда Чапека для грибов содержащий дрожжевой экстракт (толщина 0,3 мм), №4-6 среда Чапека на солодовом агаре (для грибов), №7-9 среда агар пептонно-кукурузный +0,5 мл водной суспензии пробы суглинистой почвы, как тест-объект на 4 сутки вносим: №1-3 – 10 экз.; №4-6 – 30 экз.; №7-9 – 100 экз.;
4 опыт: разливаем по 3 чашки Петри: №1-3 среда Чапека для грибов содержащий дрожжевой экстракт (толщина 0,3 мм), №4-6 среда Чапека на солодовом агаре (для грибов), №7-9 среда агар пептонно-кукурузный +0,5 мл водной суспензии пробы почвы дерново-подзолистой, как тест-объект на 4 сутки вносим культивированных личинок стронгилят в чашках: №1-3 – 10 экз.; №4-6 – 30 экз.; №7-9 – 100 экз.;
5 опыт: разливаем по 3 чашки Петри: №1-3 среда Чапека для грибов содержащий дрожжевой экстракт (толщина 0,3 мм), №4-6 среда Чапека на солодовом агаре (для грибов), №7-9 среда агар пептонно-кукурузный, +0,5 мл водной суспензии пробы лугово-черноземной, как тест-объект на 4 сутки вносим культивированных личинок стронгилят в чашках: №1-3 – 10 экз.; №4-6 – 30 экз.; №7-9 – 100 экз.
Изучение нематофаговой активности штаммов хищных грибов Arthrobotrys oligospora L3-1 и L3-2 против стронгилят лошадей и их личинок
Хищные нематофаговые грибы рода Arthrobotrys oligospora, занимают определенное место в системе микробиомедов, которые способны уничтожать нематод, бороться с возбудителями паразитарных болезней и энтомовредителями. О возможности практического использования естественных врагов нематод-хищных грибов предлогал наш соотечественник И.И. Кораб, и высказал сожаление, что эти грибы не нашли применение в борьбе с фитонематодами.
Хищные нематофаговые грибы, в том числе и представители рода Arthrobotrys, как и другие несовершенные грибы, имеют хорошо развитый мицелий, но их гифы обладают способностью образовавать специальные, улавливающие нематод приспособления. Эти приспособления у выделенных нами штаммов Arthrobotrys oligospora L3-1 имеют вид колец и Arthrobotrys oligospora L3-2 петель и их сложное сплетение, покрытых липким веществом.
Такие сети образуются в результате обильного ветвления гиф, веточки которых загибаются и анастомозируют с соседними веточками или родительской гифой, образуя сложную трехмерную сеть из многочисленных колец. Поверхность гиф сети покрыта клейким веществом неизвестной природы. Такого типа ловушки были изучены у выделенных штаммов L3-1 и L3-2 Arthrobotrys oligospora.
Для определения нематофаговой активности штаммов хищных грибов рода Arthrobotrys oligospora нами проведены лабораторные опыты.
Посев мицелий проводили на питательных средах:
I- среда Чапека (для грибов) содержащий дрожжевой экстракт;
II- среда Чапека на солодовом агаре (для грибов);
III- среда агар пептонно-кукурузный;
IV- контроль.
1 опыт: пробы–по 5 чашек Петри с питательной средой Чапека (для грибов) содержащий дрожжевой экстракт внесена мицелиальная культура с титром4,0 104 спор 10, 25, 50, 75 и 100 личинок стронгилят;
2 опыт: пробы – по 5 чашек Петри с питательной средой Чапека на солодовом агаре (для грибов) Arthrobotrys oligospora L3-1 и L3-2+ №10, 25, 50, 75 и 100 личинок стронгилят;
3 опыт: пробы – по 5 чашек Петри с питательной среда агар пептонно-кукурузный Arthrobotrys oligospora L3-1 и L3-2 + №10, 25, 50, 75 и 100 личинок стронгилят;
4 опыт контроль: пробы – 5 чашек Петри с питательной средой Чапека вносили №10, 25, 50, 75 и 100 личинок стронгилят без хищных грибов;
5 опыт контроль: пробы – 5 чашек Петри с питательной средой Чапека вносили хищные грибы без личинок.
Повторность опытов 4-кратная.
Для посева штаммов берем мицелии из 3-х суточной культуры гриба в объеме с титром 4,0 104 спор (с расчетом 4 мл с на 100 мл среды). Учет роста гриба начинаем с 4-го сут. На опытных и контрольных чашках тщательно просматриваем рост гриба на среде, под малым увеличением микроскопа. После посадки личинок стронгилят (на 7 сутки) в количестве 100 экз. отметили бурный рост обоих штаммов, L3-1 и L3-2. Проводимизмерения макроконидий для определения скорости разрастания штаммов. После посадки личинок стронгилят в 3-х опытах наблюдаем увеличение биомассы грибов, подсчет биомассы проводим по абсолютно сухому весу. На 4 суток роста достигало значения 12-18 г/л. что свидетельствует формирование к третьим суткам роста многочисленных спиралевидных гиф, отмеченных ранее в условиях маточной культуры, в этот же период отмечали, что на гифах формируются петли и кольца (рис.13), характерные для данных штаммов. На 2- 3 сутки мицелий исследуемого штаммаL3-2 пронизывает тела личинки нематод и разрастается внутри них (рис.14). При этом в полости личинки проникают многочисленные споры грибов и изменяют структуру, личинок опустощая их содержимое.
Если рассмотреть по опытам:
1 опыт: питательная среда Чапека (для грибов) содержащий дрожжевой экстракт в пробах №4 и 5 с суспензией штаммов Arthrobotrys oligospora L3-1 наблюдаем обильное спорообразование, пышное разрастание мицелия, формирование улавливающего аппарата высокую степень хищничества до 150-160 колец в поле зрения микроскопау штамма. 1 опыт питательная средасолодовый агар (для грибов) в пробах №4 и 5 с суспензией штаммов Arthrobotrys oligospora L3-1 наблюдаем обильное спорообразование, пышное разрастание мицелия, формирование улавливающей сети, высокую степень хищничества.
В опытах 2: на питательной среде Чапека для грибов во всех чашках 5 пробах с суспензией штаммов Arthrobotrys oligospora L3-1 и L3-2, также, наблюдали сильный рост и формирование улавливающих аппаратов, высокую степень хищничества у L3-1300-480 колец в поле зрения микроскопа во всех пробах обнаруженытолько кутикулы нематод, заполненные трофическими гифами гриба и 30 неподвижных личинок, L3-2 сплошной рост гифа личинок нет. Рис. 13. Личинка схваченная петлей гриба (ув.15х20)
В опытах 3: на питательной среде агар пептонно-кукурузныйс суспензией штаммов Arthrobotrys oligospora L3-1 и L3-2, также, наблюдали сильный рост и формирование улавливающих аппаратов, высокую степень хищничества уL3-1 до 200 колец в поле зрения микроскопа во всех пробах. Также у штамма L3-2 были обнаружены только кутикулы нематод.
В контрольном опыте 4 на чашках №1-5 при микроскопическом исследовании обнаружены подвижные личинки стронгилят, на чашках №2-4 обнаружен незначительный рост Mucor sp.
Быстрый рост колоний гриба и образование ловчих колец в результате разветвления веточек гифа, образуют сложную сеть из ловчих колец. В сетях этого кольца и удерживаются личинки стронгилят. Под микроскопом наблюдали, изменениев структуре личинок, полость личинок заполнялась трофическими гифами штаммов нематофагового гриба (рис.15).
При сравнении улавливающих аппаратов штаммов L3-1 и L3-2 во всех подопытных пробах: улавливающие кольца у штамма L3-1,быстро захватывают стронгилятв нескольких местах, сжимают заселяя в них свои гифыуничтожают личинки стронгилят (рис. 16 а). У штамма L3-2 отходящий от него росток при захвате нематоды быстро создает сеть улавливающих петель, обивая нематоду быстро разрастает образуя новые улавливающие сетки, поглащая в них стронгилят и их содержимоезаселяя в них свои гифы. (рис. 16 б). Во всех пробах у штаммов L3-1 и L3-2 на 7 сутки, число же улавливающих приспособлений разрастало и состояло из сплошных сплетений ловчего аппарата, по всей поверхности питательной среды обнаружены личинки стронгилятсостоящий из клейкой сети.
Значит, как видно в опыте штаммы L3-1 и L3-2, образуютмеханическую ловушку для личинок ввиде колец и сетей, они обильно разрастают при наличии личинок стронгилят. У штамма L3-1 внутренняя поверхность ловчих клеток чувствительна к прикосновению попавшихся в них личинок реагируют на них, увеличиваясь в объеме, плотно сжимают схваченную личинку. Ловчая сетка штамма L3-2 полностью прикрывает личинку и сети. Схватывая жертву (личинку) вследствие увеличения обьема ловчего аппарата опустощается содержимое личинки и агрессивно разрастают по всей поверхности питательной среды.
Получены результаты экспериментальных лабораторных опытов по определению скорости роста штаммов L3-1 и L3-2 и сравнения нематофаговых грибов и увеличение спор на 1 см2 площади культуры свидетельствуют об определенном влиянии на рост, нарастание биомассы и интенсивности споруляции нематофаговых грибов. Хищнические свойства грибов проявлялись на 7 сутки после посева чистой культуральной суспензии штаммов и на 4 сутки после внесения культивированных личинок стронгилятпри температуре +26....+28С. Образования ловчих аппаратов (колец и петель) у обоих штаммов грибов начинается с 7 по 14 сутки.
Обсуждение результатов исследований
Одной из серьезных проблем табунного коневодства по-прежнему является значительная зараженность животных паразитическими нематодами семейства Strongylidae. Наибольший экономический урон причиняют стронгилез, альфортиоз и деляфондиоз, которые регистрируется во всех коневодческих хозяйствах республики.
По обзору литературных данных нематодозы лошадей табунного содержания на территории Якутии распространены повсеместно, к настоящему времени насчитывается около 50 видов нематод паразитирующих у лошадей, относящихся к семейству стронгилят.
Кишечные стронгилятозы лошадей – комплекс гельминтозных заболеваний (нематодозов), вызываемые представителями подотряда ylata, сем.ylidae и Trichonematidae, паразитирующим в половозрелой стадии в толстом отделе кишечника животных. Личиночные стадии локализуются в различных тканях, в зависимости от вида возбудителя. К настоящему времени насчитывают около 45 видов нематод -возбудителей кишечных стронгилятозов лошадей и других однокопытных (ослы, мулы). Все они сходное развитие во внешней среде и характеризуются общим – потенцированным патогенным воздействием на организм, складывающимся из болезнетворного влияния многочисленных отдельных видов стронгилид и трихонематид, которые, как правило, в форме «чистой инвазии» у лошадей не встречаются.
Основным методом оздоровления животных от паразитических нематод в настоящее время является применение химических антигельминтных препаратов на основе полусинтетических авермиктинов, которые практически не подвергаются разложению, при выведении из организма с фекалиями во внешнюю среду они оказывают сильное токсическое влияние на копрофильных беспозвоночных, микроорганизмов и на других компонентов пастбищного биоценоза, что приводит к замедлению процесса разложения навоза на пастбище.
Одним из наиболее широко распространенных и часто встречающихся в почве хищных грибов является, нематофаговый гриб рода Arthrobotrys oligospora обладает широким диапазоном адаптаций. В большинстве работ, посвященных данному виду, рассматривается его роль как регулятора численности паразитических нематод и в связи с этим потенциальная возможность использование его, как агента биологического контроля.
Широкая распространенность в природе нематофаговых грибов образующих ловушки для нематод и их личинок, и среди них наиболее часто встречающегося Arthrobotrys oligospora свидетельствует о значительных адаптационных возможностях этого гриба.
Замена химических антгельминтных препаратов биологически активными средствами позволяетснизить степень загрязнения окружающей среды, успешно бороться нематодами животных. Но на сегодняшний день биологические активные нематоцидные средства крайне ограничены, а технология их производства далека от совершенства. Поэтому нам необходимо создать конкурентоспособное биологически активное средство на основе мицелиальной массы нематофагового гриба рода Arthrobotrys oligospora.
В связи с этим для защиты и сохранения биологического разнообразия живой природы особенно макрофагов особое значение придали получению экологически чистого, биологически активного средства против стронгилятозов лошадей табунного содержания на основе мицелиальной массы штаммов нематофагового гриба Arthrobortrys oligospora.
Исследования нематофаговой активности этих штаммов показали, что гифомицеты грибов эффективны по отношению стронгилят и их личинок,как в лабораторных опытах, так и экспериментальных опытах получены одинаковыепоказатели нематофаговой активности грибов, споры и мицелии грибов достотачно устойчивы в естественных условиях, появление ловчих колец инициируется присутствием личинок стронгилят.
Разработанные нами биологически активные средства на основе мицелиальной массы штаммов нематофаговых грибов Arthrobotrys oligospora L3-1 и L3-2 и применение их в экспериментальных опытах для обеззараживания пастбищ от стронгилят и их личинок получены положительные результаты и в перспективе могут иметь большое значение, как обладающие сильно выраженными антогонистическими свойствами средство биологического происхождения.