Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 10
1.1. Общие сведения о фуллеренах С60 и С70 .10
1.2. Основные свойства фуллеренов 11
1.3. Органическая химия фуллеренов 13
1.4. [2+1]-циклоприсоединение при получении фуллереновых производных 14
1.5. [2+3]-циклоприсоединение при получении фуллереновых производных 19
1.6. Модификация фуллереновых производных с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения азидов и алкинов («клик-химия»)
1.6.1. Особенности реакции и условия ее проведения .23
1.6.2. Реакция CuAAC с участием фуллереновых производных 25
1.7. Бис -, трис- и гекса- фуллереновые производные 30
1.7.1. Бис - функционализированные фуллерены 30
1.7.2. Трис- функционализированные фуллерены 35
1.7.3. Гекса- функционализированные фуллерены .40
1.8. Фуллереновые производные в биологии и медицине .48
ГЛАВА 2. Обсуждение результатов .51
2.1. Синтез и строение аллильных производных фуллеренов С60 и С70 51
2.2. Синтез пропаргильных и триазольных производных фуллеренов С60 и С70 в условиях реакции «click-chemistry» .63
2.3. Синтез, строение и свойства новых тиофосфорилированных альдегидов и фуллеропирролидинов С60, содержащих одну и две реакционноспособные альдегидные группы 75
2.4. Синтез новых производных фуллерена С60, содержащих различные фармакофорные группы, и изучение их антилейкемической и антиоксидантной активности на биологических «тест-обьектах» 94
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 108
Заключение .148
Список литературы .
- Органическая химия фуллеренов
- Реакция CuAAC с участием фуллереновых производных
- Синтез пропаргильных и триазольных производных фуллеренов С60 и С70 в условиях реакции «click-chemistry»
- Синтез новых производных фуллерена С60, содержащих различные фармакофорные группы, и изучение их антилейкемической и антиоксидантной активности на биологических «тест-обьектах»
Введение к работе
Актуальность темы. Фуллерены, циклические молекулы из 60 или 70 атомов углерода,
открытые в середине 80- годов прошлого века, являются прекрасным примером широких
возможностей для химиков и биологов при получении новых биологически активных веществ и
создания устройств для нанотехнологии. Это обусловлено уникальными свойствами фуллеренов.
Фуллерены легко фотовозбуждаются и взаимодействуют с молекулами кислорода, растворенного
в тканях, с образованием очень реакционноспособного синглетного кислорода, который вызывает
гибель клеток злокачественных новообразований. Фуллерены легко вступают в реакции
циклоприсоединения с образованием моно- и поли-аддуктов. При этом гидрофобные молекулы
фуллеренов, плохо растворимые в органических и, особенно в полярных, растворителях, при
функционализации становятся более растворимыми. В последние годы активно развиваются
работы по получению на основе фуллеренов как биологически активных препаратов, так и
различных устройств для нанотехнологии. Было найдено, что комбинирование нитроксидного
малонатного метанофуллерена с известным противораковым препаратом циклофосфамидом
показывает высокую противораковую активность в опытах на животных, зараженных лейкемией
Р-388. Полученные результаты свидетельствуют об актуальности и перспективности дальнейшего
изучения фуллеренов в качестве модификаторов биологических реакций при химиотерапии
опухолей. Исходя из этого, разработка направленного синтеза новых функционально замещенных
фуллеренсодержащих продуктов с различными фармакофорными и реакционноспособными
группами, с целью создания молекул, сочетающих свойства, как самого фуллерена, так и
присоединенного фрагмента является актуальной проблемой современного органического
синтеза
Цель работы. Направленный синтез новых типов функционально замещенных
метанофуллеренов и фуллеропирролидинов, содержащих различные реакционноспособные и фармакофорные группы, изучение их свойств и биологической активности.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
Синтез аллильных и пропаргильных метанофуллеренов С60 и С70.
Синтез тиофосфорилированных моно- и поли-фуллеропирролидинов С60 с использованием ди- и трис-бензальдегидов в пара-, мета- и орто- положениях.
- Направленный синтез метанофуллеренов С60 или С70, содержащих различное число
фармакофорных групп: триазольного, триазол-тимидинового, нитроксидного и нитроксид-
бисхлорэтиламинного типов.
- Исследование антилейкемической и антиоксидантной активности производных фуллеренов С60 с
нитроксидными замистителями.
Научная новизна.
Впервые были получены малонатные монометанофуллерены С60, С70 и гекса-аддукт фуллерена С60 с концевыми реакционноспособными аллильными группами.
Получены новые фосфорилированные и малонатные производные фуллеренов С60 и С70, содержащие пропаргильные и 1,2,3-триазольные фрагменты с использованием метода «клик-химии».
Впервые получены тиофосфорилированные фуллеропирролидины С60 с одной и двумя свободными альдегидными группами, и на их основе получены фуллеропирролидиновые бис- и трис-аддукты с замыканием на фуллереновую сферу исключительно в экваториальное положение.
Впервые осуществлен направленный синтез бис-, трис-, гекса- и смешанных производных фуллерена С60, содержащих нитроксидные, а также бисхлорэтиламинную фармакофорные группы различного типа действия; изучено их строение и биологическая активность.
Практическая значимость данной работы заключается в разработке эффективных
методов синтеза ранее неизвестных моно- и поли-аддуктов фуллерена С60 c
реакционноспособными и фармакофорными группами в различном соотношении, и исследовании зависимости «структура-свойства» полученных соединений на штамме Р-388. Синтезированные соединения являются интересными объектами для дальнейшей функционализации по реакционноспособным группам и для создания новых типов лекарственных препаратов для лечения тяжелых заболеваний человека.
На защиту выносятся следующие положения:
-
Синтез новых моно- и гекса-метанофуллеренов С60 и С70, содержащих аллильные, пропаргильные и арилальдегидные реакционноспособные группы.
-
Синтез новых фосфорилированных и малонатных производных фуллеренов С60 и С70, содержащих в своей структуре фармакофорные триазольные и тимидиновые фрагменты.
-
Синтез новых тиофосфорилированных бис- и трис-фуллеропирролидинов С60.
-
Синтез новых бис-, трис-, гекса- и смешанных метанофуллеренов С60, содержащих 4, 6, 8, 10, 12 нитроксидных групп.
-
Результаты антилейкемической и антиоксидантной активности метанофуллеренов С60 с нитроксидными фрагментами.
Степень достоверности результатов. Достоверность результатов проведённых исследований подтверждается использованием большого набора физико-химических методов: ВЭЖХ, масс-спектрометрии, ИК-, УФ-спектроскопии, спектроскопии ЯМР и ЭПР, РСА.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на Всероссийской молодежной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности», Казань, 2012 г., Международной конференции «Углеродные наночастицы в конденсированных средах», г. Минск, 2013 г., XXII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» и XIII школа молодых ученых «Синтез, структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик-2015), г. Казань, 2015 г., итоговой научной конференции ИОФХ им. А.Е. Арбузова (Казань, 2016 г.)
Публикации.
По теме диссертации опубликованы 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.
Работа выполнена в лаборатории функциональных материалов Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук.
Личный вклад соискателя. Соискателем совместно с научным
руководителем сформулированы основные цели диссертационной работы. Экспериментальная часть работы диссертантом выполнена лично или при его непосредственном участии. Диссертантом самостоятельно проведен анализ литературы, обобщены результаты проделанной экспериментальной работы. Личный вклад соискателя состоит также в подготовке тезисов и научных статей по теме диссертационной работы к публикации, проведении анализа и обработке данных физико-химических методов исследования.
Автор выражает благодарность и глубокую признательность своему научному руководителю д.х.н., чл.-корр. АН РТ, проф. Нуретдинову Ильдус Аглямовичу за предложение новых идей в процессе выполнения работы и к.х.н., старшему научному сотруднику Губской Валентине Петровне за внимательное руководство на всех этапах выполнения работы, за обсуждение полученных результатов и их публикацию. Сердечную благодарность и искреннюю признательность автор выражает к.х.н., научному сотруднику Фазлеевой Гузяль Мидихатовне за ежедневную поддержку, ценные советы по синтезу и выделению новых производных фуллерена С60 и С70. Автор выражает благодарность д.х.н. Ш. К. Латыпову за ЯМР исследования, к.х.н. Д. Р. Шарафутдиновой за снятие масс-спектров, д.х.н. А. Т. Губайдуллину и д.х.н. О. Н. Катаевой за рентгеноструктурный анализ, к.х.н. В. И. Морозову за ЭПР- спектры, а также специалистам Института проблем химической физики РАН, г. Черноголовка, Московская область проф. Н.П. Коноваловой и В.Н. Варфоломееву за эксперименты по исследованию противоопухолевой активности и фармакокинетики полученных соединений, сотруднику Нижегородской государственной медицинской академии д.х.н., проф. Н.Б.Мельниковой за исследование антиоксидантной активности новых соединений.
Объем и структура диссертации. Основное содержание диссертационной работы изложено на 173 страницах машинописного текста, включает 39 рисунков, 47 схем, 2 таблицы и состоит из введения, литературного обзора (первая глава), обсуждения собственных результатов (вторая глава), экспериментальной части (третья глава), заключения, списка литературы с библиографическими ссылками (203 наименований) на отечественные и зарубежные работы.
Первая глава посвящена обзору литературы по синтезу и свойствам фуллерена С60 и С70 и их производных. Вторая глава содержит данные по разработке методов синтеза новых моно- и гекса-метанофуллеренов, а также фуллеропирролидинов, содержащих различные реакционно-способные и фармакофорные группы, исследование зависимости биологической активности от их строения. В третьей главе приводится описание методик проведённых экспериментов и данные физико-химических характеристик полученных соединений.
Органическая химия фуллеренов
Реакцией [2+1]-циклоприсоединения получают метанофуллерены, фуллероазиридины или фуллерооксираны. Эти реакции могут протекать по различным механизмам и включать такие процессы как присоединение карбенов, нитренов, стабилизироваться карбанионами, окисляться и т.д.
В литературе известны три группы синтетических процедур для получения метанофуллеренов: 1) реакция фуллерена со стабилизированным карбанионом, протекающая по механизму присоединение – элиминирование (реакция Бингеля -Хирша); 2) присоединение карбенов к С60; 3) термическое циклоприсоединение диазосоединений, сопровождающееся термолизом или фотолизом образующихся интермедиатов.
Циклоприсоединение стабилизированного -галогенкарбаниона к фуллерену С60 (реакция Бингеля) [18] является наиболее эффективным направлением в синтезе метанофуллеренов. Поэтому в данной работе большое внимание уделяется этому подходу. Реакция Бингеля протекает путем изначального нуклеофильного присоединения -галогенкарбаниона к С60 с последующим внутримолекулярным замещением атома галогена анионным центром, который генерируется на фуллереновой сфере. Реакция протекает быстро и в большинстве случаев с хорошим выходом. Классический тип реакции Бингеля заключается в обработке С60 2-броммалоновым эфиром в присутствии основания NaH (Схема 1.2) [18].
Метанофуллерены, содержащие другие электроноакцепторные заместители циклопропановом фрагменте, были синтезированы аналогично.
Хиршем была усовершенствована эта реакция [19]. А именно: образование -моногалогензамещенного малонового продукта (2-бром- или 2-иодмалоната) происходит in situ в самом фуллереновом синтезе, вследствие добавления в реакцию нового бромирующего или иодирующего реагента (CBr4 или I) и нового основания DBU. Фуллерен С60 взаимодействует с моноэфирами малоновой кислоты 1а-с в присутствии 12 и DBU при комнатной температуре, образуя 61-иодо-1,2-метано[60]фуллерен-61-карбоксилаты 2а-с с выходом от 25 до 28% (Схема 1.3) [19-21].
Образование соединений 2 а-с связано с тем, что фуллереновые производные малоновой кислоты легко декарбоксилируются при основных условиях, генерируя карбанион, который реагирует с I2.
С помощью реакции Бингеля были получены и охарактеризованы также метанофуллерены на основе С70 [22, 23]. Ожидалось, что присоединение произойдет по одному из трех возможных [6,6]-двойных связей в области самой высокой кривизны. Реакция С70 с DBU и бромдиэтилмалонатом в толуоле при комнатной температуре привела к соединению За с выходом 60%, в то время как ЗЬ не был обнаружен в реакционной смеси.
Универсальность реакции Бингеля-Хирша была подтвеждена при получении новых фосфорных производных фуллерена (Схема 1.4) [24, 25]. О О II II (EtO)2P P(OEt)2 (38%) Схема 1.4 Реакция Бингеля-Хирша имеет много преимуществ, таких как мягкие условия реакции, хороший выход и региоселективность при образовании [6,6]-аддукта. С помощью этого метода были синтезированы многочисленные метанофуллерены [26-38].
В целом, реакция Бингеля требует сильного основания, таких как NaH и DBU, используемых в качестве катализатора, которые способствуют образованию карбаниона через депротонирование бром-замещенных метиленов [39, 40]. Однако некоторые производные метанофуллерена, содержащие кислотную группу или основные-лабильные группы, не могут быть непосредственно синтезированы этим методом. Например, метанофуллерен фосфоновой кислоты или малоновой кислоты не могут быть получены с помощью реакции Бингеля, так как в первую очередь должны быть получены соответствующие метанофуллерены фосфонового или малонового эфира, а затем уже проводят их гидролиз [41-43, 25]. Чтобы расширить возможности реакции Бингеля в нейтральных и кислых условиях B. Jin и другие [44] предложили новый метод синтеза метанофуллеренов, а именно - взаимодействие фуллерена С60 с бром-замещеными активными метиленовыми соединениями 5 в присутствии аминокислоты и диметилсульфоксида (Схема 1.5). Это исследование является первым в развитии реакции циклопропанирования фуллерена С60 без использования основания, хотя перенос электрона между аминами или аминокислотами и фуллереном был изучен ранее [45, 46]. ДМСО также облегчает перенос электрона от амина к фуллерену, о чем сообщал Isobe [47].
Среди большого количества функционализированных [60]фуллереновых соединений фуллеропирролидиновые производные являются одним из наиболее интенсивно изучаемых классов [48-55]. 1,3-Диполярное циклоприсоединение азометинилидов к фуллерену, известное как реакция Прато [56], является одним из наиболее эффективных путей в получении фуллеропирролидинов. Механизм данной реакции включает конденсацию -аминокислоты с альдегидом, ведущую к образованию иммониевой соли, которая претерпевает процесс декарбоксилирования, с получением in situ азометинового илида. Последний реагирует с 6,6-двойной связью фуллерена путем 1,3-диполярного циклоприсоединения, образуя пирролидиновый цикл (Схема 1.6).
Реакция CuAAC с участием фуллереновых производных
Одними из первых исследователей, которые разрабатывали концепцию полифункционализации фуллерена, были группы A. Hirsch и F. Diederich, при этом подходы немецких и швейцарских групп отличались. Hirsch подробно исследовал поэтапное циклоприсоединение броммалонатов к С60, обеспечивая отличные статистические данные и пользуясь высокой склонностью малонатных анионов преимущественно атаковать экваториальные и транс-3 положения [113-119]. А. Хирш и М. Прато показали, что если в качестве реагентов используются малонатный эфир (реакция Бингеля) и моноальдегиды (реакция Прато), то основными продуктами бис-присоединения являются trans-3- и экваториальные изомеры, бис-аддукты cis-1 и cis-2 почти не наблюдаются из-за стерической загруженности аддендов.
Стратегия Дидериха основана на тезер-управляемой мультифункционализации (tether-directed): путем тщательного выбора длины тезера были получены исключительно экваториальные или цис-2 бис-аддукты [120-132]. Контролируемая мультифункционализация фуллерена С60 является крайне важной для улучшения выхода специфических изомерных бис-аддуктов без использования процедур хроматографического разделения. Этот метод был использован для проведения бис-1,3-диполярного циклоприсоединения D Souza [133], G. Zhou [134] и другими [135]. Селективный синтез бис-аддуктов С60 был достигнут авторами с использованием 1,3 диполярного циклоприсоединения тезерных бис-азометиновых илидов (реакция Прато) (Рисунок 1.4). Были получены новые бис-(бензальдегиды), связанные мостиком (тезером), и использованы для двойного циклоприсоединения азометиновых илидов к С60. Благодаря этому подходу были селективно получены экваториальные, trans-4, trans-3, trans-2, trans-1- бис-аддукты. Однако появление хиральных центров в пирролидиновом цикле в ходе реакции усложняет химию, а также число теоретически возможных стереоизомеров. Это сообщение представляет первый пример систематического исследования тезер направленного селективного синтеза фуллеропирролидиновых бис-аддуктов С60.
Еще одним подходом в региоселективном образовании фуллереновых бис-аддуктов стала последовательная двустадийная реакция моно-присоединения азометиновых илидов к фуллерену С60, в которой трифениламин используется в качестве жесткого тезера (Схема 1.17) [136]. На первой стадии 1,3-диполярное циклоприсоединение азометиновых илидов, образуемых in situ при нагревании трифениламинового бис-альдегида 34 и саркозина с С60, привело к моно 33 фуллеропирролидиновому аддукту 35, имеющего свободную альдегидную группу. На следующей стадии повторная термическая обработка саркозином привела к образованию второго пирролидинового цикла на той же фуллереновой сфере 36 в экваториальном положении. N 4CH3 Схема 1.17
Пример региоселективного синтеза бис-аддуктов с cis-1 присоединением был сообщен Мартином и др., который использовал внутримолекулярную реакцию Pauson-Khand [137], термическое [2+2]-циклоприсоединение [138] и нуклеофильное присоединение [139]. Известны также работы Прато и др. по получению сis-1 бис-аддуктов с использованием тандемного присоединения нитрил-оксидов и азометиновых илидов, которое контролируется длиной тезера [140, 141].
Приведенные выше примеры реакций циклоприсоединения [113-136], которые привели к полному разделению и характеристике всех синтезированных бис-аддуктов, показали, что транс-1 и цис-1 положения являются наименее благоприятными во всех типах реакций циклоприсоединения. Транс-3 и экваториальные аддукты являются основными продуктами в реакции Дильса-Альдера и Бингеля, в то время как наличие цис-изомеров практически не заметно. Вклад цис-аддуктов в бис-присоединении по реакции Прато значительно выше, что делает цис-2 аддукт в этой реакции одним из основных продуктов.
Всецело региоселективными, но не стереоселективными, были выше представленные синтезы. Для того, чтобы избежать образования стереоцентра, а также стерического влияния С-пирролидино-заместителей на селективность реакции, недавно авторами [142, 143] был применен другой подход для бис присоединения по реакции Прато с использованием формальдегида и простых диглицинов 39 a-e с алкильным-мостиком в качестве модельной системы (Схема 1.18). При использовании исходных соединений, содержащих длинный алкильный тезер, количество выделенных бис-(пирролидино)фуллеренов резко сократилось, во всех экспериментах образовалось только два изомера (цис-2 и цис-3) из восьми теоретически возможных. В реакционной смеси не были обнаружены моноаддукты, другие бис-региоизомеры и бис-фуллереновые производные гантельного типа. Относительное соотношение двух синтезированных бис-аддуктов оставалось почти постоянным, но общий выход изменялся в зависимости от условий проведения реакции. Использование о-ДХБ в качестве растворителя при термических условиях, обеспечивающего лучшую растворимость реагентов и возможность достижения высоких температур по сравнению с толуолом, дало заметно выше общий выход продукта и высокую конверсию фуллерена. Повышение температуры реакции в о-ДХБ позволило улучшить превращение С60, но не улучшило выход бис-аддуктов и не наблюдалось существенных изменений в соотношении цис-2/цис-3. Микроволновое облучение так же не улучшает эффективность и селективность синтеза.
Синтез пропаргильных и триазольных производных фуллеренов С60 и С70 в условиях реакции «click-chemistry»
Анализ межмолекулярных взаимодействий в кристалле метанофуллерена 2 свидетельствует о наличии …, С-Н… контактов и водородных связей С-Н…О типа. Каждая молекула метанофуллерена 2 участвует в восьми … контактах с фуллереновыми фрагментами соседних молекул, что приводит к образованию трехмерных сеток в кристалле (Рисунок 2.7), при этом расстояния между центрами тяжести ароматических циклов взаимодействующих молекул фуллерена 2 лежат в диапазоне величин 3.90-4.49 , а диэдральные углы между их плоскостями - в диапазоне углов 0 - 31. Взаимодействия наблюдаются всех трех возможных типов - 6:6, 5:5 и 6:5. а б
Дополнительная стабилизация образующихся трехмерных сеток осуществляется за счет водородных связей С-Н…О типа и С-Н… контактов между атомами водородов аддендов и фуллереновыми сферами. Несмотря на разупорядоченность одного из аллильных заместителей, в кристалле моноаддукта фуллерена 2 достигается достаточно компактная взаимная упаковка молекул, так что в элементарной ячейке остаются лишь незначительные пустоты, доступные для молекул растворителя – потенциально доступный объем равен 95 3.
В отличие от моноаддукта 2, гексааддукт 4 кристаллизуется с хлороформом в соотношении 1:6, образуя тригональные кристаллы (пространственная группа R-3). Геометрия молекулы в кристалле показана на рисунке 2.8. Несмотря на то, что аллилмалонатный заместитель является довольно конформационно гибким, гекса-аддукт 4 не теряет молекулярной симметрии в кристалле и независимой является только одна шестая его часть. Интересно отметить, что и в случае гексааддукта наблюдается разупорядочение одной из аллильных групп по двум положениям, причем с близкими к полученным для моноаддукта значениями относительных заселенностей - 0.65:0.35. Однако даже этот факт не препятствует реализации собственной симметрии молекулы в кристалле гексааддукта 4.
Трехчленный цикл с плоскостями прилегающих шестичленных циклов фуллеренового фрагмента образует диэдральные углы равные 117.6 и 113.0 Разворот аллилмалонатных групп гекса-аддукта 4 различен: торсионные углы С1-С61-С66-О66 и С1-С61-С62-О62 равны 121.9(8) и 35.8(9), соответственно.
Расположение аддендов на фуллереновой сфере таково, что образование взаимодействий фуллерен…фуллерен невозможно, расстояния между центрами тяжести ближайших фуллереновых фрагментов оказывается равным 14.1 . Формирование супрамолекулярной структуры в кристалле гекса-аддукта 4 происходит за счет неклассических водородных связей С-Н…О типа. При этом характер межмолекулярных взаимодействий с участием карбонильных групп двух аллильных фрагментов оказывается сильно различающимся. В то время как одна из них (062) исключительно участвует в образовании водородной связи с молекулой хлороформа, то кислород Обб второго аллильного фрагмента связывает молекулы гексааддукта между собой за счет образования водородной связи С-Н…О типа с водородом метиленовой группы соседней молекулы. Учитывая расположение молекулы соединения 4 в кристалле, множественные подобные взаимодействия приводят к образованию трехмерных сеток в кристалле и достаточно плотной взаимной упаковке молекул. Согласно расчетам, в элементарной ячейке кристалла потенциально доступным для растворителя объемом является лишь 73 3, причем и этот совокупный объем состоит из трех малых пустот.
Взаимодействием фуллеренов С60 и С70 с диаллилмалонамидом 5 в условиях реакции Бингеля -Хирша были получены новые метано фуллерены 6 и 7 (Схема 2.2). Следует отметить, что в случае фуллерена С60 реакция с диаллилмалонамидом 5 протекает почти мгновенно и продукт 6, содержащий полярные амидные группы, выпадает из реакционной смеси в виде коричневого осадка. Осадок тщательно промыли от исходных реагентов и высушили. Выход соединения 6 с расчетом на прореагировавший фуллерен составил 66 % (0.146 г). В случае фуллерена С70 реакция так же протекает быстро, но образуется много бис- аддуктов. Флеш-хроматографией на Si02 (элюент о-ДХБ) был выделен метанофуллерен 7 с выходом 20 % (0.024 г) с расчетом на прореагировавший фуллерен С70 (Схема 2.2).
Синтез новых производных фуллерена С60, содержащих различные фармакофорные группы, и изучение их антилейкемической и антиоксидантной активности на биологических «тест-обьектах»
ВЭЖХ-анализ проводили на хроматографе AgilentTechnologies 1200 Series c УФ детектором при использовании колонки с обращенной фазой Ci8 (Partisil-5 ODS-3), элюент толуол/CH3CN (объемное соотношение 1:1). Органические растворители использовали высушенными и перегнанными по общепринятым методикам [199]. В работе использовали фуллерен С60 99.9% чистоты и С70 99.5% чистоты (производства «Фуллерен-Центр», Нижний Новгород).
Спектры УФ записывали на спектрофотометре Perkin Elmer Lambda 35 в хлористом метилене и в пиридине, спектры ИК - на Фурье-спектрометре «Brukerensor 27» (Bruker).
Спектры ЯМР регистрировались на ЯМР спектрометре Avance-600 (Bruker) (600 МГц (Н) и 150.926 МГц (13С)) при температуре 30С в CDC13 и в С5D5N. В качестве внутреннего стандарта использовали остаточный сигнал CDCb (5Н 7.26 м.д. и 5С 77.0 м.д.). Структура соединений была установлена на основании ряда ID и 2D корреляционных ЯМР экспериментов (DEPT, WH COSY, !Н-13С HSQC, !Н-13С НМВС).
Масс-спектры МАЛДИ (MALDI) получены на масс-спектрометре UltraFlex III TOF/TOF (Bruker Daltonik GmbH, Бремен, Германия) в линейном режиме. Лазер Nd:YAG, =355 нм. Данные обрабатывались с помощью программы FlexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonik GmbH, Бремен, Германия). Фиксировались положительно заряженные ионы. Использовалась металлическая мишень. В качестве матрицы был использован пара-нтроанилин (p-NA) и транс-2-[3-(4-тер -бутилфенил)-2-метил-2-пропенилиден]малононитрил (DCTB). В масс-спектрах, наряду с протонированным молекулярным [М + Н]+ ионом, часто присутствуют ионы [М + Na]+ и [М + К]+.
Масс-спектры ионизации электрораспылением (ИЭР, ESI) получены на масс-спектрометре AmazonX (Bruker Daltonik GmbH, Бремен, Германия). Измерения проводились в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне m/z от 100 до 2800. Напряжение на капилляре -4500 В. В качестве газа-осушителя использовался азот с температурой 300С и расходом 10 лмин1. В качестве элюента использовали раствор состава изопропанол/вода (80:20), скорость элюента 0,2 мл/мин. Соединение растворяли в ацетонитриле до концентрации 10 6 г/л. Объем вкалываемой пробы 20 мкл. Данные обрабатывались с помощью программы DataAnalysis 4.0 (Bruker Daltonik GmbH, Бремен, Германия).
Рентгеноструктурный анализ монокристаллов соединений 2 и 4 проведен в федеральном спектроаналитическом центре коллективного пользования Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН на базе Лаборатории дифракционных методов исследования. Эксперименты выполнены на автоматическом рентгеновском дифрактометре Bruker Kappa Apex II CCD (Cii a, графитовый монохроматор, X 1.54178, -сканирование) при температуре 23 оС. Сбор, редактирование данных и уточнение параметров элементарных ячеек выполнены по программе APEX2. Проведен полуэмпирический учёт поглощения с использованием программы SADABS. Структуры расшифрованы прямым методом и уточнены методом наименьших квадратов вначале в изотропном, затем в анизотропном приближении (для всех неводородных атомов) c использованием программ SHELXL. Координаты атомов водорода рассчитаны на основе стереохимических критериев и уточнены по соответствующим моделям «наездника». Все расчеты проведены на персональном компьютере с использованием программы WinGX. Анализ межмолекулярных взаимодействий и рисунки выполнены с использованием программ PLATON и Mercury.
Методика эксперимента при исследовании антиоксидантной активности, определялась по известным в литературе методам: по интенсивности свободно-радикального окисления методом хемилюминисценции, индуцированной железом и пероксидом водорода [200, 201]. Анализировались следующие параметры: Imax (mV), характеризующий максимальную вспышку хемилюминесценции и по отражающий потенциальную способность биологического объекта к свободно радикальному окислению; S(mV) – суммарная хемилюминесценция за 30 сек., величина, обратно пропорциональная антиоксидантной активности; tg2 – параметр, показывающий скорость нормализации процессов свободно радикального окисления; безразмерная величина Imax/S – фактор антиоксидантной активности, не учитывающий уровень общих лигандов. Исследования проводили in vitro в тест-системе (плазма крови больных) в присутствии и отсутствии исследуемых композиций с последующим измерением антиоксидантной активности по степени затухания биохемилюминисценции (гашения процессов ПОЛ).
Методика эксперимента при исследовании фармакокинетики. Мышам внутрибрюшинно вводили спин-меченый бисметанофуллерен в дозе 250 мг/кг. На разные сроки после введения препарата мышей забивали декапитацией с применением эфирного наркоза, затем извлекали внутренние органы (печень, почки, сердце, селезенку, мозг, содержимое желудка, а у животных с опухолью – опухоль на 14 сутки после ее перевивки). Образцы тканей измельчали ножницами до гомогенного состояния и добавляли свежеприготовленный окислитель из расчета три объема последнего на грамм ткани. Состав окислителя: 1 V Н2О + 1V 5 N KOH + 2 V 0,2 M H2O2 . Смесь тщательно перемешивали, подвергали действию ультразвука в течение 10 сек для более полной дезинтеграции кусочков тканей и заполняли полученной смесью стеклянные капилляры с внутренним диаметром 1 мм. Капилляры помещали в резонатор ЭПР спектрометра (Varian-104) и регистрировали спектры ЭПР спин-меченного фуллерена при комнатной температуре. Концентрацию препарата в органах выражали в относительных единицах по амплитуде сигнала ЭПР.