Содержание к диссертации
Введение
1 Синтез, строение и пути образования частично гидрированных три-, тетра- и тиазолохиназолинов и пиримидинов (литературный обзор)
1.1 Реакции конденсации в синтезе три-, тетра- и тиазолохиназолинов (пиримидинов)
1.1.1 Реакции 1,3-дикарбонильных соединений с аминоазолами. Синтез три-, тетразолопиримидинов
1.1.2 Реакции 1,3-дикарбонильных соединений с аминотиазолом. Синтез тиазолопиримидинов
1.1.3 Реакции ,-непредельных кетонов с аминотри(тетр)азолами. Синтез три(тетр)азолоцикланопиримидинов
1.1.3.1 Реакции ,-непредельных кетонов с аминотиазолами. Синтез илидензамещенных тиазолохиназолинов
1.1.4 Многокомпонентные реакции в синтезе азолопиримидинов (хиназолинов)
1.1.4.1 Трехкомпонентный синтез тетразоло(триазоло)пиримидинов (хиназолинов)
1.1.4.2 Трехкомпонентные реакции в синтезе 23
функционольнозамещенных тиазолопиримидинов (хиназолинов) и родственных систем
1.1.5 Синтез триазоло(тиазоло)пиримидинов (хиназолинов) с использованием биокатализаторов (полимеры, наночастицы), ПАВов
1.1.6 Синтез азолопиримидинов (хиназолинов) в условиях микроволнового и ультразвукового воздействия
1.1.6.1 Синтез тиазолохиназолинов в условиях микроволнового и ультразвукового воздействия
1.1.6.2 Синтез триазоло(тетразоло)пиримидинов (хиназолинов) в условиях микроволнового и ультразвукового воздействия
1.1.7 Синтез азолопиримидинов (хиназолинов) с использованием ионных жидкостей
1.2 Механизм трехкомпонентной конденсации (аминоазол:альдегид:кетон)
1.3 Биологическая активность азолопиримидинов (хиназолинов) 43
2 Синтез, строение и пути образования азолоцикланопиримидинов (обсуждение результатов)
2.1 Синтез замещенных тетразоло(триазоло, тиазоло) цикланодигидропиримидинов
2.1.1 Трехкомпонентная конденсация тетразологексагидрохиназолинов
2.1.2 Соотношение позиционных изомеров о-R- фенилтетразологексагидрохиназолинов
2.1.3 Синтез изомерных тетразолоцикланодигидропиримидинов
2.1.4 Изомеризация тетразолоцикланопиримидинов 63
2.1.5 Синтез и строение 5-нитротиофен-2-илтетразоло-, триазолоцикланопиримидинов
2.1.6 Синтез 5-фенил-5Н-6,7,8,9-тетрагидро-1,3-тиазоло[2,3- b]хиназолина
2.2 Реакции 1,3-диоксосоединений с аминоазолами 81
2.2.1 Этоксикарбонил(ацетил)циклогексанолоны в реакциях с аминоазолами. Синтез функциональнозамещенных азолохиназолинов
2.3 Трехкомпонентный синтез азолопиримидинов
2.3.1 Синтез и строение триазолопиримидинов 93
2.3.2 Синтез тиазоло(тетразоло)пиримидинов в условиях УЗ-активации 97
2.4 Практически значимые свойства полученных веществ 103
2.4.1. Альгицидная активность орто- и мета-R- 103
фенилтетразолоцикланопиримидинов
2.4.2 Цитотоксическая активность орто-R- 110
фенилтетразолоцикланопиримидинов
3 Экспериментальная часть 114
3.1 Основные физико-химические методы, используемые в работе 114
3.2 Синтез тетразолоцикланопиримидинов 115
3.3 Изомеризация о-хлорфенилтетразолоцикланопиримидинов 119
3.4 Синтез изомерных триазолохиназолинов 120
3.5 Синтез тиазолохиназолина 122
3.6 Реакции 1,3-диоксосоединений с аминоазолами. 123
Этоксикарбонил(ацетил)циклогексанолоны в реакциях с аминоазолами.
Синтез функциональнозамещенных азолохиназолинов
3.7 Трехкомпонентный синтез триазоло- и тиазолопиримидинов 127
3.8 Синтез азолоцикланопиримидинов в условиях УЗ-активации 130 Заключение (выводы) 133 Список использованных источников 135 Приложение
- Реакции ,-непредельных кетонов с аминотиазолами. Синтез илидензамещенных тиазолохиназолинов
- Соотношение позиционных изомеров о-R- фенилтетразологексагидрохиназолинов
- Этоксикарбонил(ацетил)циклогексанолоны в реакциях с аминоазолами. Синтез функциональнозамещенных азолохиназолинов
- Синтез тетразолоцикланопиримидинов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время многочисленные
исследования в области химии гетероциклических соединений связаны с
разработкой новых методов построения азолопиримидинов, -хиназолинов,
сложнопостроенных систем на их основе из-за структурного сходства с
пуриновыми основаниями. Вновь синтезированные соединения находят
применение в качестве лекарственных препаратов (антимикробных,
противовирусных, противоопухолевых, антиоксидантных), пестицидов,
соединения на их основе обладают люминесцентными, ферромагнитными свойствами, что используется в современных нанотехнологиях.
Среди синтетических подходов к азоло(пиримидинам), -хиназолинам широко используют методологию мультикомпонентных реакций, микроволновую активацию, сонохимические реакции, относящиеся к методам «зеленой химии», позволяющие проводить процессы однореакторно, в отсутствии растворителей, катализаторов, селективно, с высокими выходами.
Однако некоторые вопросы химии азолопиримидинов, -хиназолинов до сих пор остаются мало изученными. Например, влияние в трехкомпонентной конденсации положения и природы заместителей в бензольном кольце альдегидной компоненты, размера алицикла в кетоной компоненте на формирование продуктов, мало исследованы реакции с участием 2-амино-1,3-тиазола, изомерные превращения азологексагидрохиназолинов и их гомологов с различным размером приконденсированного алицикла.
Настоящая работа выполнена в русле решения этих задач и является продолжением и развитием исследований в области химии конденсированных азолопиримидинов с узловым атомом азота.
Работа является частью плановых научных исследований, проводимых на кафедре органической и биоорганической химии Института химии Саратовского национального исследовательского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского по теме «Фундаментальные и прикладные аспекты химии сложнопостроенных синтетических и природных веществ и материалов, новые подходы к синтезу и физико-химическому анализу» (№ гос.регистрации 01201169641).
Цель работы. Разработка подходов к синтезу замещенных
азолоцикланопиримидинов с узловым атомом азота на основе доступных аминоазолов (2-амино-1,3-тиазол, С-аминотетразол, C-аминотриазол) и моно-, поликарбонильных соединений, выявление путей их образования, установление строения новых соединений, поиск направлений их возможного практического применения.
Задачи исследования:
синтез азоло(циклано)дигидропиримидинов с узловым атомом азота на основе моно- и дикарбонильных соединений и аминоазолов с использованием принципов «зеленой химии»;
выявление влияния реагентов и условий на направление реакций, изомерный состав продуктов;
- синтез функциональнозамещенных азолопиримидинов, -хиназолинов с
использованием реакций трех-, двухкомпонентной конденсации;
- выявление путей образования триазоло-, тетразоло-,
тиазоло(циклано)пиримидинов посредствам выделения интермедиатов и изучения
превращений позиционных изомеров;
установление строения синтезированных соединений;
выявление перспектив практического применения полученных веществ.
Научная новизна.
Получена серия полигетероатомных гетероциклических соединений с узловым атомом азота (тетразоло-, триазоло-, тиазоло(циклано)пиримидины). Разработаны синтетические подходы к каждому типу соединений (трех-, двухкомпонентная конденсация, УЗ-воздействие, термическая изомеризация) на основе синтетически и коммерчески доступных реагентов.
При трехкомпонентной конденсации аминоазол-ароматический альдегид-
цикланон синтезированы тетразолоцикланопиримидины с различной
вариативностью заместителей в пиримидиновом фрагменте и размером
анелированного алицикла. Природа и положение (о-, м-, п-) замещающих групп в
бензольном кольце альдегидной компоненты и увеличение размера цикланона (С5-
С8) определяет соотношение позиционных изомеров образующихся
тетразолоцикланопиримидинов. Формированию изомеров с угловым сочленением
колец способствуют электронное и пространственное влияние орто-заместителя в
бензальдегиде и низкоэнергетическое взаимодействие по типу водородного
связывания NHR (ЯМР 1Н, ИК-спектры). Термическая зависимость спектров
ЯМР 1Н указывает на существование динамических процессов, связанных с
изомеризацией позиционных изомеров.
В зависимости от используемого аминоазола формируются
азолоцикланопиримидины, содержащие пиримидиновый фрагмент енаминного или иминного строения.
Реакция 5-нитротиофенкарбальдегида, С-аминотетразола и циклоалканонов
протекает полностью селективно с образованием тетразолоцикланопиримидинов
линейного строения, а при использовании 3-амино-1,2,4-триазола и
циклогексанона возникает смесь триазологексагидрохиназолинов, изомерных по типу сочленения колец и положению в них двойных связей. Схема реакции экспериментально подтверждена выделением интермедиатов – енамина и аминокетона в виде двух диастереомеров, разделенных с помощью ВЭЖХ.
Двухкомпонентная конденсация ацетил(этоксикарбонил)замещенных
циклогексанонов, содержащих 1,3-диоксофрагмент с С-, N-аминоазолами приводит к продуктам азоциклизации (в случае C-аминотриазола, -тиазола) или продуктам нуклеофильного замещения циклической карбонильной группы (в случае N-аминотриазола).
One-pot взаимодействие этилацетоацетата, ароматического альдегида и
аминотиазола позволяет получать этоксикарбонилзамещенные
тиазолопиримидины, образование которых протекает только в условиях УЗ-
воздействия, через ,-непредельные оксосоединения, что подтверждено
встречным синтезом. Использование при синтезе
тетразолоцикланодигидропиримидинов УЗ-активации выгодно отличается от термического воздействия за счет значительного сокращения времени и понижении температурного режима.
Получены, обобщены и проанализированы спектральные данные для широкого ряда вновь синтезированных соединений.
На защиту выносятся результаты исследований по:
синтезу (функционально)замещенных триазоло(тетразоло,
тиазоло)(циклано)пиримидинов, выявлению селективности реакций в зависимости от строения реагентов и условий; установлению соотношения позиционных изомеров в смесях;
выявлению сравнительного химического поведения аминоазолов
(аминотетразол, аминотиазол, С-, N-аминотриазолы) в реакциях трех- и двухкомпонентной конденсации с моно-, поликарбонильными соединениями;
изучению механизма образования продуктов реакции;
спектральному отнесению новых соединений;
изучению альгицидной и цитотоксической активности полученных веществ.
Практическая значимость. Синтезирована серия новых гетероциклических соединений с узловым атомом азота, содержащих в своем составе триазоло(тетразоло, тиазоло)пиримидиновый фрагмент, арильные, гетарильные, циклоалкильные заместители. Среди полученных веществ выделены соединения:
- обладающие заслуживающим внимания альгицидным действием в отношении
зеленых микроводорослей Dunaliella salina Teod;
- проявляющие значительную цитотоксическую активность в отношении
клеточных линий SPEV-2.
Апробация работы. Основные результаты работы представлялись на:
Всероссийской интерактивной (с международным участием) конференции
молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной
химии» (Саратов, 2010, 2012, 2013, 2015, 2016), Всероссийской конференции с
международным участием, посвященной 75- летию со дня рождения В.В.
Кормачева (Чебоксары, 2012), Международной научно-методической конференции
«Фармобразование» (Воронеж, 2013, 2016), IV Всероссийской конференции c
международным участием «Современные проблемы химической науки и
фармации, посвященной 80-летию В.В. Базыльчика» (Чебоксары, 2015),
Международной научной конференции «Проблемы и инновации» (Иваново, 2015),
Всероссийской молодежной конференции «Методы компьютерной диагностики в
биологии и химии» (Саратов, 2015), Международном молодежном научном форуме
«ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2015, 2016), Международной научной конференции,
посвященной 70-летию Победы в Великой отечественной войне «Теоретическая и
экспериментальная химия глазами молодежи-2015» (Иркутск, 2015),
Международной научной конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований 2015» (Одесса, 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 14 статей в сборниках научных трудов, 3 тезисов докладов Международных и Российских конференций.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 177 страницах
машинописного текста, включая введение, три главы (литературный обзор,
обсуждение результатов и экспериментальная часть), выводы, список
использованных источников из 115 наименований, 34 таблицы, 20 рисунков. Приложение содержит 26 стр.
Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, доктору химических наук, профессору, заслуженному работнику высшей школы РФ Кривенько Адель Павловне; к.б.н., доц. Бурыгину Г.Л.
(ИБФРМ РАН) за сотрудничество по изучению альгицидной и цитотоксической активности новых веществ, к.х.н., доц. Аниськову А.А. за помощь в интерпретации спектральных данных.
Реакции ,-непредельных кетонов с аминотиазолами. Синтез илидензамещенных тиазолохиназолинов
Реакции 1,3-дикарбонильных соединений с аминотиазолами имеют свои особенности, обусловленные наличием атома серы. Так, взаимодействие этилацетоацетата и 2-амино-1,3-тиазола в более мягких условиях (100С) в присутствии кислот, исключающих окисление (ПФК, РОС1з+ПФК, 80-90С), приводит к образованию триазолопиримидинонов 10-16, отличающихся от триазол-, тетразолсодержащих аналогов положением двойных связей в пиримидиновом фрагменте /9, 10/.
Оксихлорид фосфора используют как поглотитель воды, делающий реакцию необратимой, что увеличивает выход продуктов.
В ИК-спектре соединений 10-16 присутствуют полосы валентных колебаний связи С=N (1615-1659 см"1). В ЯМР 1Н спектре регистрируют сигналы протонов метильной группы (1.31-2.39 м.д.), протонов тиазольного (6.92-7.76 м.д.) и пиримидинового циклов (5.91-6.28 м.д.).
В отсутствии катализатора и растворителя реакция останавливается на стадии образования основания Шиффа 17. Добавление к последнему смеси полифосфорной кислоты и оксихлорида фосфора приводит к циклизации с образованием тиазолопиримидинаїб /11/, что является подтверждением формирования последнего через интермедиат 17.
В отличие от ацетоуксусного эфира, N-арил-З-оксобутантиоамид взаимодействует с 2-аминотиазолами не селективно, образуя смеси тиазоло[3,2-а]пиримидин-5-тионов 18 а,Ь и 5-арилиминотиазолопиримидинов 19 a-f, соотношение которых зависит от природы заместителя в ароматическом кольце тиоамида /12/. 18 a,b ід a.f 18: R=H (a), R= CH=CH-CH=CH (b); 19 R=H; Ar= Ph (a), 4-MeOC6H4 (b), 4-CIC6H4 (c), 4-02NC6H4 (d); R=R= CH=CH-CH=CH, C6H5 (e), 4-EtOC6H4 (f) ЯМР lН спектры тиазоло[3,2-а]пиримидин-5-тионов 18 а,b и 5-арилиминотиазолопиримидинов 19 a-f содержат синглеты протонов метильной группы (2.32-2.35, 2.08-2.17 м.д.) и Н-6 (7.23-7.32, 5.90-6.10 м.д.). В ИК-спектрах присутствуют полосы валентных колебаний групп С=N (1570-1580 см"1) и =С-Н (3100 см"1). Однако, приведенные спектральные данные не убеждают и недостаточно точны для подтверждения строения полученных веществ.
При нуклеофильном замещении кетогруппы тиоамида образуется енаминотиоамид 20, дальнейшая циклизация которого зависит от природы заместителя в бензольном кольце. Электронодонорные заместители способствуют образованию тиазолопиримидинтионов 18 а,b с выходом 52%, в то время как выход соединения 19 a-f составляет 20%. Электроноакцепторные заместители напротив способствуют образованию соединения 19 a-f и резко уменьшают долю тиазолопиримидинтионов 18 а,b.
Внутримолекулярная циклизация енаминотиоамида 20 протекает двумя путями: через интермедиат А, стабилизирующийся отщеплением ариламина с дальнейшим формированием тиазолопиримидинтионов 18 а,b и через интемедиат В, с отщеплением сероводорода и образование арилиминотиазолопиримидинов 19 a-f. Интермедиаты А и В содержат ВВС S-H-N.
При сплавлении аминотиазола и 3-ацетил-хромен-2-она возникают смеси 2-ацетиламинотиазола 22 и тиазолопиримидинона 21 в виде таутомеров 21 а,Ь, которые разделены колоночной хроматографией (Si02) /13/. он о 9 9 о он о ЯМР !Н спектр тиазолопиримидинона 21 подтверждает его существование в н N Me 21 а виде таутомеров 21 а и 21 b по наличию в спектре сигналов СН2- (с, 4.18 м.д.) и СН- (с, 6.93 м.д.). В спектре амида 22 присутствуют сигналы метильной (с, 2,27 м.д.) и NH (с, 12,27 м.д.) групп. Объяснение полученного результата авторы представляют схемой реакции, включающей два возможных направления.
Экзоциклическая аминогруппа аминотиазола взаимодействует первоначально с карбонильной группой ацетильного фрагмента субстрата с образованием аддукта А, который дальше претерпевает перегруппировку с расщеплением (образование 4-гидрокси-6-метилпиран-2-она В и 2-ацетиламинотиазолa 19), либо дегидратацию с формированием имина В, его перегруппировку и азациклизацию, приводящую к тиазолопиримидину 18. Использование в реакции субстратов, содержащих функциональные группы, позволяет получать функциональнозамещенные тиазолопиримидины, перспективные с целью проведения реакций по этим функциональным группам.
Соотношение позиционных изомеров о-R- фенилтетразологексагидрохиназолинов
Появление изомеров с угловым сочленением колец «b» при использовании в качестве альдегидной компоненты о-хлор(нитро, гидрокси)бензальдегидов в отличие от незамещенного бензальдегида можно объяснить суммарным влиянием пространственного и электронного эффектов орто-заместителя в бензольном кольце на протонную подвижность NH-группы пиримидинового цикла, ответственного за изомеризацию. Нельзя исключать также и влияние никзкоэнергетического взаимодействия за счет образования ВВС NHR. Подтверждением является смещение в ЯМР 1Н спектре синглета NH-протона в слабую (для NO2 (10.21 м.д.), Cl (10.19 м.д.), CH3 (10.15 м.д.) групп) или в сильное поле (для ОН (9.10 м.д.) группы) по сравнению с незамещенным в бензольном кольце тетразологексагидрохиназолином 1а (10.03 м.д.). Вероятно метильная группа, оказывает только пространственное влияние (атомный радиус 2,01). Наличие ВВС на качественном уровне подтверждено подтверждено нами данными ИК-спектров. При изучении концентрационной зависимости (10-1 - -10-4 моль/л) валентных колебаний связи NH на примере орто нитрофенилтетразологексагидрохиназолинов 3 а, b при концентрации 10-4 моль/л регистрируется одна полоса (при 3550 см-1) из двух полос NH при 3550 см-1, 3190 см-1, что позволило отнести ее к ВВС. Подобная картина не наблюдалась для незамещенных тетразолохиназолинов 1 а,b; вне зависимости от концентрации в спектре регистрировались только валентные колебания МВС связи NH (3324 см-1).
При отсутствии орто-заместителя или перемещении его в мета(пара)-положение (на примере соединений 6а, 7а) угловой изомер не регистрируется.
Для определения возможности реализации внутримолекулярных взаимодействий (притяжения и отталкивания) и оценки их энергии нами проведен расчет энергетического профиля вращения связи С5- С1` о нитрофенилзамещенного тетразологексагидрохиназолина 3b в сравнении с незамещенным аналогом 1b (пакет программ Gaussian 9.0 в рамках теории функционала плотности (DFT) на уровне теории B3LYP 6-311++G(2d,2p)) (Приложение, таблица №1).
Связь С5- С1` является ключевой для решения задачи поскольку определяет способность к образованию внутримолекулярной водородной связи. Изменение торсионного угла (N4-C5-C1`-C2`) сможет дать адекватную оценку возможности существования ВВС и ее энергии. Квантово- химические расчеты проведены с учетом энергии нулевых колебаний, в вакууме и термической коррекции электронной энергии до энергии Гиббса при 298.15 K. На рис. 2.1.2.1. представлен график зависимости энергии от соответствующих значений торсионных углов для соединений 3b и 1b (энергетического профиля вращения). Профиль вращения для соединения 3b содержит два максимума (локальный-max1; глобальный- max2) и три минимума.
Расчеты показали, что ротамеры (торсионный угол 90) со сближенными атомами водорода бензольного и циклогексанового колец находятся в состоянии локального максимума (max1) с энергией 50 кДж/моль. Глобальный максимум (max2) с энергией 59.7 кДж/моль характеризуется сближенностью нитрогруппы с атомом водорода циклогексанового кольца. Таким образом, данные ротамеры является стерически напряженными.
Минимум (min3) (торсионный угол 290) и последующий спад энергии соответствуют стерически минимально нагруженным ротамерам. Последующее сближение атома кислорода нитро-группы и водорода NH-группы на расстояние 2.24 (из программ Gaussian9.0) свидетельствует о образовании слабой ВВС с энергией 12 кДж/моль (рис.2.1.2.2).
Для незамещенного тетразолохиназолина 1b профиль вращения содержит два локальных максимума за счет сближенности атомов водорода бензольного и циклогексанового колец (расстояние 3.92), атома водорода NH-группы и бензольного кольца (расстояние 3.51), что исключает наличие ВВС.
Таким образом, наличие и природа заместителя в орто-положении бензольного кольца альдегидной компоненты оказывает определяющее влияние (орто-эффект) на формирование изомерных тетразологексагидрохиназолинов. В продолжение этих исследований логичным представлялось изучение влияния размера алициклической кетоной компоненты на направление изучаемой реакции.
С целью синтеза тетразолоцикланопиримидинов, установления влияния строения кетонной компоненты на их изомерный состав нами осуществлена трехкомпонентная конденсация на примере циклоалканонов С5, С7, С8, С-аминотетразола и о-хлор(гидрокси)бензальдегидов (кипячение эквимолярных соотношений реагентов в ледяной уксусной кислоте). При этом были получены ранее неизвестные о-хлор(гидрокси)фенилтетразолоцикланопиримидины в форме изомеров линейного (8 а-12 а) и углового (8 b-12 b) строения, соотношение которых определялось не только природой замещающей группы в бензольном кольце, но и размером приконденсированного алицикла и колебалось от 1:20 до 6:1 (таблица 2.1.3.1). N-N L ) / = П N XT/\ N-N Y н о R н н 8-12 а 8-12 b R= СІ: п=1 (8 а,Ь), 3 (9 а,Ь), 4 (10 a,b); R= ОН: п=3 (11 а,Ь), 4 (12 а,Ь) Различные выходы продуктов (28-83%) можно объяснить уменьшением СН-кислотности цикланонов (при переходе от С5 к С8) и, следовательно, их активности на стадии формирования аминокетона В.
В спектре ЯМР !Н линейных изомеров 8 а - 10 а синглеты протонов NH (10.01-10.45 м.д.) и Н8-10-11 (6.43-6.89 м.д.) смещены в сильное поле по сравнению с угловыми 8 b-10 b - NH (10.31-10.97 м.д.) и Н5 (6.51-6.95 м.д.) (Приложение, рис. № 12-14).
В ЯМР 1Н спектре изомерной смеси о-гидроксифенилзамещенных систем с циклогептановым (11 а, Ь) и циклооктановым (12 а, Ь) фграгментами присутствуют ключевые сигналы протонов Н5, геминального узла (Н10, Н11), NH (два сигнала), позволяющие отнести их в соответствии с данными /61/ к формам «а», «Ь», которые находятся для изомеров 11 а, 12 а при 5.47 м.д. (Н10), 5.00 м.д. (Н11) и при 5.82, 5.26 м.д. (Н5) для изомера 11 Ь, 12 Ь.
Этоксикарбонил(ацетил)циклогексанолоны в реакциях с аминоазолами. Синтез функциональнозамещенных азолохиназолинов
«Цветущая вода», вызванная нежелательными зелеными водорослями, затрудняет доступ света и воздуха в толщу воды, загрязняет ее продуктами химического распада отмирающей водоросли и животных, вызывает гибель всего планктона и является важной экологической проблемой.
Существующие физические, биологические способы (ультрафиолетовое облучение, ультразвук, электролиз воды) борьбы с микроводорослями имеют ряд недостатков (низкая эффективность, снижение рН, содержания общего азота и фосфора, повышение температуры, большие финансовые затраты), из-за которых они не нашли широкого использования /110, 111/. Альтернативным решение является использование химических препаратов (альгицидов), ингибирующих процесс фотолиза воды и фотосинтеза в зеленых частях растений. Известными альгицидами являются производные мочевины, соединения, фрагментарно включающие в свой состав азагетерокольца - пиримидиновое, имидазольное, триазольное. Основу современного рынка альгицидов составляют зарубежные препараты. Поэтому поиск новых более эффективных, нетоксичных альгицидов, отечественного производства, с низким расходом по действующему веществу, является актуальным и значимым в экологическом аспекте.
В ИБФРМ РАН исследована альгицидная активность полученных нами R-арилзамещенных тетразолоцикланопиримидинов 1-4 а,b, 8-10 а,b, 4а, 6a, содержащих фармакофорные фрагменты (таблица 2.4.1.1).
Испытания проводились in vitro на одноклеточных зеленых микроводорослях Dunaliella salina Teod в ИБФРМ РАН по известной методике /112/. Навески исследуемых соединений растворяли в ДМСО (С=10мг/мл), затем переносили в полистироловые планшеты и последовательно разводили в концентрациях от 200 до 1.625 мкг/мл. Далее, в планшеты вносилась солевая среда Ben-Amotz 1.5M NaCl, для роста микроводорослей и осуществлялся засев.
Измерения оптической плотности проводились на планшетном спектрофотометре (Multiskan Ascent, Thermo, Финляндия) в области красного пика поглощения хлорофилла «а», при 690 нм. Препаратом сравнения являлся распространенный гербицид – глифосат в составе коммерческого препарата «Round up» Monsanto Co., USA (соль изопропил-N-фосфонометил-глицина)-гербицидом сплошного спектра действия, разрешенный в подсобных хозяйствах. Контрольный опыт ставился для растворителя (ДМСО).
Согласно методике хлорофилл поврежденных клеток подвергается фотодеструкции, что дает возможность оценить жизнеспособность популяции по обесцвечиванию клеточной суспензии в лунках планшета и понижению оптической плотности (рис. 2.4.1.1.-2.4.1.3).
Оптическая плотность суспензии микроводоросли, существенно понижается через 48 часов, в лунках с тетразолоцикланопиримидинами 2-4 a,b, 6а, в концентрациях от 25 до 200 мкг/мл (рис. 2.4.1.1, 2.4.1.3 а, б). Значительное изменение оптической плотности под действием соединений 9, 10 a,b в этих концентрациях не наблюдается, так же как и под действием чистого растворителя ДМСО (рис. 2.4.1.2 а,б).
Результат гибели клеток визуально подтверждается обесцвечиванием взвеси в лунках с соединениями 2-4 а,b, 8 а,b, 4 а, 6а. Нами проведено микроскопирование проб (15мкл) из этих лунок на микроскопе лазерного диссектора (Leica Microsystems, Германия) с использованием флуоресцентной лампы, светофильтр «I3». Мертвые клетки, при таких условиях, флуоресцируют зеленым, живые - красным. По результатам этого исследования гибель около 100 % клеток наблюдается для смесей 3 a,b в конц 200 мкг/мл, 2 a,b от 100мкг/мл, 4 a,b - 100 мкг/мл, 8 a,b от 200 мкг/мл.
Определены максимальная толерантная концентрация (МТК), при которой оптическая плотность еще схожа с контролем (ДМСО) и минимальная ингибирующая концентрация (МИК), после которой, кривая по оптической плотности выходит на плато. Показатель ингибирования IC50 - концентрация вызывающая ингибирование роста половины микроводорослей (таблица 2.4.1.2). МТК и МИК тестируемых соединений определяются из графика по спаду оптической плотности через 48 часов (рис. 2.4.1.1-2.4.1.3 б), IС50 концентрация при которой осуществляется 50% ингибирование, процент ингибирования рассчитывается по формуле: [Ak-A0/Ak] 100%, где Ak – оптическая плотность контроля, A0 – оптическая плотность изучаемого вещества.
Тетразолоцикланопиримидины 8-10 a,b, анелированные карбоциклами С5-С8 не проявляют активность (либо ингибируют рост микроводорослей при высокой концентрации соед. 8 a,b), тем самым выгодно выделяя хиназолиновые структуры.
Полуингибирующая концентрация линейного 2-метилфенил тетразолохиназолина 4 а (индивидуальное соединение), в 2,5 раза ниже его изомерной смеси 4 а,b (32 мкг/мл и 81 мкг/мл), а максимальная толерантная концентрация ниже в 8 раз (3 мкг/мл и 25 мкг/мл), что свидетельствует об ответственности за альгицидную активность линейной формы.
Перемещение в бензольном кольце нитро группы из орто- (соед. 3 a,b) в мета- (соед. 6 a) положение приводит к повышению активности в 4 раза.
Таким образом, в отношении микроводорослей Dunaliella salina Teod тетразолохиназолины 4 a, 6 a показали достаточную, для дальниейших исследований IС50, но уступают коммерческому гербициду сравнения «глифосату» в составе препарата «Round up» (соль изопропил-N-фосфонометил-глицина).
Аналогичные испытания были проведены для этил 7-метил-5-фенил-5H-тиазоло[3,2-a]пиримидин-6-карбоксилата (34) в концентрациях 1,56-200 мкг/мл в растворе ДМСО по известной методике /112/ (рис. 2.4.1.4).
Синтез тетразолоцикланопиримидинов
Пиримидиновый, тетразольный циклы являются фрагментами многих антимикробных, противовирусных, противоопухолевых препаратов /113, 114/. Биологическую активность азолопиримидинов определяет их структурное сходство с пуриновыми основаниями, такими как аденин, гуанин.
Разработка новых лекарственных средств, способных подавлять развитие злокачественных опухолей, является одним из главных направлений исследований в области онкологии, биомедицинской химии.
Поэтому поиск новых представителей ряда азолопиримидинов, являющихся потенциальными противоопухолевыми препаратами, является широко развивающимся направлением в химии гетероциклических соединений.
В ИБФРМ РАН была изучена цитотоксичность полученных нами тетразолоцикланопиримидинов, отличающихся природой и положением замещающих групп, размером алицикла, в форме смеси позиционных изомеров и индивидуальных веществ. н н 1а-5а, 9а, 10а 2Ь-5Ъ, 9 Ь, 10 b 6а n=l: R=H (la), CI (2a,b), CH3 (4a,b), N02 (6a, 3a,b) OH (5a,b); n=2: R=C1 (9 a,b); n=3: R=C1 (10 a,b)
Исследование проводили на культуре клеток почек эмбрионов свиньи, несущих онковирусы A и С (SPEV-2). Жизнеспособность клеток проверяли с помощью MTT-теста (колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток). Клетки культивировали в 96-луночном планшете в питательной среде DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) до образования 70% заполненности монослоя и затем инкубировали с токсикантами (0,01-0,35 мМ тестируемого соединения в растворе ДМСО) в течение 24 часов, в качестве контроля использовали ДМСО.
MTT-реагент готовили ex tempore в концентрации 1 мг/мл на фосфатно-солевом буфере (10мМ). Среду DMEM сливали, клетки не снимали с планшета, и в каждую лунку добавляли 200 мкл MTT-реагента. Инкубировали 1 час при 37 С в атмосфере 5% CO2. После инкубации MTT-реагент сливали и в каждую лунку добавляли 200 мкл ДМСО. Инкубировали 15 минут при 37 С на термостатируемом шейкере для равномерного растворения кристаллов формазана. Показания оптической плотности считывали на микропланшетном спектрофотометре Multiscan Ascent (Bioek Instruments, США) на длине волны 540 нм.
Зависимость оптической плотности от концентрации тестируемых соединений после МТТ теста представлена на рис. 2.4.2.1. Зависимость оптической плотности от концентрации соединений 1-5 а,b, 6а, 9 a,b, 10 а,b после МТТ-теста По значениям оптической плотности рассчитана дыхательная активность клеточной линии SPEV-2 (рис. 2.4.2.2.). Дыхательная активность, % = [Ak-A0/Ak] 100, где Ak – оптическая плотность контроля, A0 – оптическая плотность изучаемого вещества.
Дыхательная активность культуры клеток SPEV-2 в отношении соединений 1а, 2-5 а,b, 6а, 9 a,b, 10 а,b Эксперименты ставили в 3 повторностях. Для проведения статистического анализа использовалась программа Microsoft Excel. Рассчитывали параметры среднего арифметического значения и стандартной ошибки. На основании этих данных производили расчет дыхательной активности в % для каждой концентрации испытуемого препарата. За достоверные принимали различия средних величин по t-критерию Стьюдента при p 0.05. Максимальное снижение дыхательной активности клеток, инкубированных с тестируемыми соединениями, наблюдалось при концентрации 0,35 мМ и составило 5,1% (для соединения 1 a), 91,7% (для соед. 2 a,b), 53,3% (для соед. 9 a,b), 56,3% (для соед. 10 a,b), 93,9% (для соед. 4 a,b), 46,5% (для соед. 6 a), 32,9% (для соед.3 a,b), 16,2% (для соед. 5 a,b), что показано на рис.2.4.2.2.
Известно, что высокоцитотоксичные вещества проявляют активность в концентрациях C 10-4 М /115/. Согласно этому критерию соединения 2 a,b, 4 a,b обладают цитотоксической активностью близкой к высокой, ингибируя рост более 90% клеток в концентрации 0,35 мМ.
Анализ полученных данных позволил сделать некоторые выводы о влиянии строения тестируемых веществ на их цитотоксическое действие. Введение заместителя в бензольное кольцо значительно увеличивает активность. Самыми активными оказались тетразологексагидрохиназолины, содержащие о-хлор(метил)фенильные заместители (соед. 2 a,b; 4 a,b). Введение гидроксильной группы в орто-положение фенильного заместителя (соед. 5 a,b) и переход от тетразолохиназолинов к гомологам с большим размером аннелированного карбоцикла (С7, С8) (соед. 9 a,b; 10 a,b) приводит к резкому снижению активности на 40%. Перемещение нитро-группы из орто- в мета-положение повышает активность (соед. 3 a,b; 6 a). Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований по изучению цитотоксичности о хлор(метил)фенилтетразологексагидрохиназолинов (2 a,b; 4 a,b) в форме индивидуальных изомеров.