Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор «Окислительные трансформации стероидов и экдистероидов и их биологическая активность» 9
1.1 Окисление по гидроксильным группам 9
1.2 Эпоксидирование двойной связи 20
1.3 Гидроксилирование двойной связи 31
1.4 Окисление двойной связи в аллильное положение 40
1.5 Озонолиз двойной связи 48
Глава 2. Обсуждение результатов 57
2.1 Гидроксилирование и эпимеризация экдистероидов в щелочной среде: стереоселективный синтез 9а-гидрокси-5а-экдистероидов 58
2.2 Регио- и стереоселективное гидридное восстановление 2-дегидро-3-эии-20-гидроксиэкдизона и его производных - продуктов озонирования в пиридине 64
2.3 Окислительные трансформации в боковой цепи производных гидроксиэкдизона и синтезы на основе ю-оксоэкдистероидов 68
2.3.1 Диастереоспецифическая конъюгация ю-формил-нор-аналогов экдистероидов с (Х)-аскорбиновой кислотой 69
2.3.2 Восстановительное аминирование производных ю-оксоэкдистероидов и синтез димерных экдистероидов 73
2.3.3 Регио- и стереоселективное ю-оксимирование в синтезе аминоэкдистероидов 76
Глава 3. Экспериментальная часть 80
3.1 Синтез 9а-гидрокси-5а-экдистероидов 81
3.2 Синтез 2,3-диэииэкдистероидов 87
3.3 Синтез конъюгатов ю-формил-нор-аналогов экдистероидов с (Х)-аскорбиновой кислотой 88
3.4 Синтез TV-алкил- и TV-ариламиноэкдистероидов з
3.5 Синтез димерных экдистероидов 97
3.6 Синтез ю-гидроксииминоэкдистероидов 100
3.7 Синтез оаминоэкдистероидов 102
Выводы 104
Список сокращений и условных обозначений 106
Список литературы
- Эпоксидирование двойной связи
- Окислительные трансформации в боковой цепи производных гидроксиэкдизона и синтезы на основе ю-оксоэкдистероидов
- Восстановительное аминирование производных ю-оксоэкдистероидов и синтез димерных экдистероидов
- Синтез конъюгатов ю-формил-нор-аналогов экдистероидов с (Х)-аскорбиновой кислотой
Введение к работе
Актуальность темы. Экдистероиды - гормоны линьки и метаморфоза насекомых и ракообразных, впервые обнаруженные в организме насекомых, спустя 10 лет были идентифицированы в растениях в значительно более высоких концентрациях, что позволило выделить, исследовать их свойства и провести химические трансформации. Установлено, что экдистероиды нетоксичны для млекопитающих и человека и обладают адаптогенными, иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами. В последние годы при разработке новых лекарственных средств особое внимание уделяется методам направленной функционализации природной матрицы биологически активных соединений с целью усиления активности нативного прототипа, пролонгации его действия, адресности доставки к нужному органу. Усиление или пролонгация действия биологически активного соединения может быть достигнута посредством конъюгации с известными фармакофорами. При этом можно ожидать также проявления качественно новых свойств. Обнаружение в морских организмах димерных стероидов, обладающих цитотоксическим действием, стимулировало синтез гомо- и гетеродимерных биологически активных соединений и изучение их свойств.
Основным компонентом экдистероидного состава растения Serratula coronata L. является 20-гидроксиэкдизон. Уникальность структуры этого соединения, обусловленная наличием 14а-гидрокси-7-ен-6-кетогруппировки, г/иосочленения колец А и В, 2р,Зр-конфигурации гидроксильных групп кольца А, С8-боковой изопреноидной цепи с тремя гидроксильными группами различной реакционной способности, предопределяет возможность его разнообразных трансформаций в редкие, труднодоступные экдистероиды и их аналоги с новыми био-фармакологическими свойствами.
В химии экдистероидов достаточно широко известны трансформации по гидроксильным группам кольца А и боковой цепи, а также восстановительные превращения 7-ен-6-кетогруппы. В меньшей степени исследованы окислительные трансформации экдистероидов и синтетические возможности продуктов окисления.
В этой связи, разработка эффективных регио- и стереоселективных окислительных трансформаций в остове и боковой цепи экдистероидов с последующими направленными превращениями продуктов окисления в труднодоступные минорные экдистероиды, первичные и вторичные аминопроизводные, а также гибридные или димерные молекулы представляется актуальной задачей.
Работа выполнена в соответствии с планами НИР Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института нефтехимии и катализа Российской академии наук по теме: «Направленные трансформации природных и синтетических токоферолов, тритерпеноидов, экдистероидов и полисахаридов» (№ Госрегистрации 01201168019 в 2011-2013 гг.), «Направленные трансформации природных и синтетических ди- и
4 тритерпеноидов, экдистероидов и полисахаридов» (№ Госрегистрации 01201460335 в 2014-2016 гг.).
Цель работы и задачи исследования. Цель работы состояла в разработке эффективных методов синтеза труднодоступных из природных источников минорных экдистероидов, конъюгатов экдистероидов с известными биологически активными соединениями, синтезе ранее неизвестных азотсодержащих экдистероидов и их димеров на основе регио- и стереоселективных окислительных трансформаций в остове и боковой цепи экдистероидов. Для достижения поставленной цели решались задачи по разработке методов:
оксо- и гидроксифункционализации экдистероидов в стероидном остове и боковой цепи;
конъюгации ооксоаналогов 20-гидроксиэкдизона с (Х)-аскорбиновой кислотой; синтеза азотсодержащих экдистероидов и их димеров на основе продуктов окисления в боковой цепи.
Научная новизна. Установлено, что диацетониды экдистероидов в метанольном растворе, содержащем избыток гидроксида натрия, подвергаются аутоокислению и эпимеризации, превращаясь с высоким выходом в соответствующие производные ранее неизвестных 9а-гидрокси-5-эии-экдистероидов. Показано, что разработанный в лаборатории эффективный метод каталитического гидрирования в щелочной среде (10% Pd-C, MeONa-MeOH) малореакционноспособной стерически затрудненной А7-связи экдистероидов эффективен для гидрирования 9а-гидрокси-5а-экдистероидов и приводит с высоким выходом к соответствующим 7,8а-дигидропроизводным.
Найден короткий двухстадийный путь инверсии конфигурации 2,3-дигидроксильных групп экдистероидов (известный из литературы метод включает 5 стадий), базирующийся на озонолитическом превращении 20-гидроксиэкдизона в 2-дегидро-З-эии-20-гидроксиэкдизон и последующем регио- и стереоселективном гидридном восстановлении 2-кетогруппы с получением 2а,3а-20-гидроксиэкдизона.
Установлено, что впервые выполненная кислотно-катализируемая конъюгация 24-альдегида, полученного озонолизом производного А24(25)-ангидро-20-гидроксиэкдизона, с 2,3-дибензиловым эфиром аскорбиновой кислоты протекает диастереоспецифично с образованием нового конъюгата с ацетальным хиральным центром (^-конфигурации.
С помощью восстановительного аминирования (RNH2/NaBH(OAc)3) производных экдистероидного 24-альдегида впервые синтезированы 24-7У-алкил- и 24-7V-ариламиноэкдистероиды. С участием 1,2-этилендиамина и и-фенилендиамина впервые получены димерные экдистероиды с 1,2-этилендиаминным и и-фенилендиаминным спейсером по 24,24'-местоположениям экдистероидных фрагментов.
Установлено, что оксимирование производных ю-оксоэкдистероидов протекает региоселективно по кетогруппе в боковой цепи с образованием оксимов (Е)-конфигурации. Каталитическим (Ni-Ra) гидрированием полученных оксимов впервые
5 синтезированы оаминоэкдистероиды. Показано, что гидрирование оксима короткоцепочечного 2,3-диацетоксипостстерона протекает диастереоселективно с преимущественным (-2:1) образованием одного из диастереомерных 20-аминов, тогда как при гидрировании 25-гидроксииминопроизводного образуется эквимольная смесь (25R/S)-диастереомерных аминов.
Практическая значимость. Найденный метод аутоокисления экдистероидов в щелочной среде (10%-ный раствор гидроксида натрия в метаноле) открыл простой путь получения ранее труднодоступных 9а-гидрокси-5а-экдистероидов. Выявлена их стресс-и геропротекторная активность при концентрации 2-10" М в биотесте на модели комнатной мухи (Musca domestica) в ситуации теплового стресса.
Предложен короткий путь конфигурационной инверсии гидроксильных групп кольца А для синтеза экдистероид/брассиностероидного аналога.
Синтезированный конъюгат экдистероида и витамина С в in vitro тесте на гомогенате печени мышей проявил более высокую ингибирующую активность в процессах пероксидного окисления липидов чем каждый из компонентов конъюгата.
На основе ооксопроизводных 20-гидроксиэкдизона впервые синтезированы потенциально фармакозначимые гидроксиимино-, аминоэкдистероиды и их димеры.
Методология и методы исследования. Окислительное расщепление боковой цепи
20-гидроксиэкдизона по С -С положению, окисление (03/Ру) гидроксильных групп кольца А экдистероидного остова, озонолитическое окисление 25-ангидропроизводных 20-гидроксиэкдизона, оксимирование постстерона и ооксопроизводного 20-гидроксиэкдизона, каталитическое гидрирование (H2/Pd-C) оксимов постстерона и о гидроксииминопроизводного 20-гидроксиэкдизона, восстановительное аминирование о оксопроизводных 20-гидроксиэкдизона, аллильное окисление и эпимеризация 20-гидроксиэкдизона и его производных в щелочной среде, кислотно-катализируемая конденсация ооксопроизводных 20-гидроксиэкдизона с ()-аскорбиновой кислотой. Установление структуры и брутто-состава синтезированных соединений основано на ID и 2D методах ЯМР-спектроскопии, элементном и рентгеноструктурном анализах и масс-спектрометрии MALDI TOF/TOF.
Положения, выносимые на защиту. Гидроксилирование и эпимеризация экдистероидов в щелочной среде в синтезе новых 9а-гидрокси-5а-экдистероидов.
7 ?
Конфигурационная инверсия по С - и С -положениям экдистероидного остова в синтезе экдистероид/брассиностероидного аналога. Диастереоспецифическая конъюгация производных экдистероидов и витамина С. Восстановительное аминирование и оксимирование ооксопроизводных 20-гидроксиэкдизона в синтезе потенциальных фармакозначимых аминоэкдистероидов и их димеров.
Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на Всероссийской школе-конференции «Химия биологически активных веществ» молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «ХимБиоАктив-2012»
6 (Саратов, 2012), XV Молодежной школе-конференции по органической химии (Уфа, 2012), кластере конференций по органической химии «ОргХим-2013» (Санкт-Петербург, 2013), IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа, 2013), X Международном симпозиуме по химии природных соединений (Ташкент, 2013), VIII Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Калининград, 2013), Молодежной научной школе-конференции «Актуальные проблемы органической химии» (пос. Шерегеш, Кемеровская область, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ: 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и тезисы 7 докладов на научных конференциях.
Личный вклад автора состоит в проведении экспериментальных исследований, анализе и интерпретации полученных результатов, написании статей и других материалов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного набора (формат А4), включает введение, литературный обзор на тему «Окислительные трансформации стероидов и экдистероидов и их биологическая активность», обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список цитируемой литературы (239 наименований).
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н., в.н.с. лаборатории физиологической генетики Института биохимии и генетики УНЦ РАН Бенъковской Г.В.; д.м.н., профессору Сырову В.Н. и д.б.н., профессору Хушбактовой З.А. Института химии растительных веществ АН Узбекистана за исследование физиологической активности синтезированных экдистероидов.
Эпоксидирование двойной связи
Эпоксидирование эндоциклической двойной связи стероидного остова или двойной связи боковой цепи - распространенный метод окислительной трансформации стероидной молекулы. Известно, что эпоксистероиды обладают высокой биологической активностью, а также могут быть использованы в качестве важных промежуточных продуктов синтеза других биологически активных соединений [3, 63, 64]. В этой связи в последние годы возрастает интерес к направленному синтезу эпоксидов стероидного ряда.
Получение эпоксидов с высокой степенью стереоселективности является сложной задачей. Стереохимия эпоксидирования двойной связи в ряду стероидов определяется экранирующим эффектом ангулярных С18- и С79-метильных групп с Р-стороны стероидного скелета и природой окислительного реагента. Основным методом получения а-эпоксидов является использование надкислот, таких как С6Н5СОООН и 7W-CPBA, возможно также применение в качестве окислителей H202/NaOH, VO(acac)2/TBHP, MTO-UHP, ММРА. Для р-селективного эпоксидирования стероидных олефинов используются ОКСОНЫ, КМПО4-CuS04-5H20, H202/Fe(II) или Mn(II), 2,6-Cl2PyNO.
При эпоксидировании стероидных гидроксикетонов важное значение придается выбору защитных групп. Для изучения влияния природы защитной группы Сі9-ОН на стереоселективность эпоксидирования А5(6)-стероидов 72-80 авторами [65] синтезирован ряд эпоксидов 81-89 (схема 19). Установлено, что в исследуемом ряду стероидов 72-80, окисление 19-гидроксиандростанового производного 72 т-СРВА протекает стереоселективно с образованием исключительно Р-эпоксида 81 с выходом 93%, тогда как при защите 19-ОН функции наблюдается образование изомерной смеси эпоксидов, причем в случае бензоилпроизводного 78 окисление протекает с образованием 50:50 смеси а- и Р-эпоксидов (таблица 1).
Регио- и стереоселективно протекает окисление диена 90 с образованием Р-эпоксида 91 (выход 35% при 60% конверсии субстрата) при использовании оксона (калий моноперсульфат) с производным фруктозы как катализатора (схема 20). При окислении диена 90 т-СРВА образуется смесь 5,6-эпоксида и 3,4:5,6-диэпоксида. Эпоксид 91 является интермедиатом в синтезе потенциально нейроактивного стероида - За-гидрокси-А-гомо-5-прегнен-20-кетона 92 [66].
Схема Окисление в мягких условиях прогестерона 93 2,6-Cl2PyNO, катализируемое комплексом Run(tmp)CO, приводило к образованию смеси 4р,5р-эпоксида 94 (65%) и минорного продукта реакции - 6-оксо-производного 95 (10%) при 75% конверсии субстрата 93 (схема 21) [67]. Надо отметить, что 4р,5р-эпоксистероиды широко используются в синтезе ингибиторов ароматаз [68] и стероидных сульфатаз [69]. Известен метод окисления 3-кето-А4(5)-стероида 2,6-Cl2PyNO до соответствующего 4р,5р-эпоксида с выходом 89% при использовании в качестве катализатора комплекса RuIV(2,6-Cl2tpp)Cl2 [39].
Эпоксидирование А17(20)-связи эстранового производного 96 2,6-CbPyNO в присутствии дендрита рутений(П)-порфирина стереоселективно приводило к образованию 17р,20р-эпоксипроизводного 97 с выходом 95% [70]. При использовании в качестве катализатора RuIV(tmp)Cl2 или RuIV(2,6-Cl2tpp)Cl2 наряду с окислением А -связи наблюдалось образование продукта окисления метиленовой группы кольца В до 6-кетона 98 с выходом 88 и 90%, соответственно (схема 22) [39].
Система, состоящая из 30% перекиси водорода и гексафторацетона, широко используется для регио- и стереоселективного окисления А5(10)-связи в стероидах [71, 72]. С помощью данной окислительной системы пентафторэтил-эстрадиен 100, полученный взаимодействием 3,3-этилендиоксиэстра-5(10),9(11)-диен-17-кетона 99 с пентафторэтиллитием, был превращен в соответствующий 5а, 10а-эпоксид 101 с выходом 57% (схема 23) [72]. Моноэпоксид 101 является промежуточным соединением в синтезе стероида 102 - перспективного агента для лечения различных эстроген-зависимых заболеваний, таких как миома матки, эндометриоз, рак молочной железы [73].
Для синтеза 18-норстероидов, выполняющих роль агонистов при взаимодействии с ГАМК-рецепторами [74], авторами [75] предложен одностадийный метод синтеза 13а,14а-эпоксида 104 с выходом 81% из прегнадиена 103 (схема 24), основанный на последовательном проведении тандемных реакций эпоксидирования-перегруппировки-эпоксидирования под действием 15% раствора АсООН в АсОН.
Согласно предполагаемому авторами механизму [75] реакция протекает в 3 этапа (схема 25): на первом этапе прегнадиен 103 избирательно реагирует с надкислотой, образуя 17а,20а-эпоксид 105. На второй стадии в кислой среде эпоксид 105 протонируется с раскрытием эпоксидного кольца и образованием стероида 106 с третичным карбкатионом на С атоме, который затем индуцирует стереоселективную 1,2-миграцию С -Me группы в С -положение по Вагнеру-Меервейну с образованием стероида 107 с карбкатионом на С13 атоме, депротонирование которого дает диен 108, содержащий А13(14)-связь. На третьем этапе стероид 108 хемоселективно реагирует с надкислотой, давая целевой эпоксид 104.
Регио- и стереоселективно протекает окисление А24(25)-связи эргостанового производного 109 под действием ТВНР в присутствии УО(асас)г с образованием 24а,25а-эпоксида 110 (92%) [76] (схема 26). Стереоселективность реакции при использовании ванадиевых комплексов связана со способностью олефинов координироваться с ванадием [77]. Введение 24,25-эпоксидного фрагмента в боковую цепь стероидной молекулы способствует поддержанию гомеостаза холестерина [78]. Эпоксид 110 служит также интермедиатом в синтезе петуниастерона D 111, обладающего инсектицидной активностью [76].
Стереоселективный метод эпоксидирования А14(15)-связи стероида 112 с помощью ММРА до соответствующего 14а,15а-эпоксида 113 (73%) был предложен в работе [79] (схема 27). ММРА - ЕЮ Окислением диена 114 системой MTO-UHP был синтезирован 5а,6а-эпоксихолест-7-ен-Зр-ил ацетат 115 с выходом 90% (схема 28) [80]. Для выделенных из природных источников 5а,6а-эпоксистероидов выявлены цитотоксические свойства [81-85], а также способность ингибировать Заре дуктазы [13]. Схема
Под действием 30% перекиси водорода в присутствии 5% едкого натра или т-СРВА происходит регио- и стереоселективное окисление синтезированного из доступного прегненолона 1 - прегнатриенового производного 116, с образованием 1а,2а- или 6а,7а-эпоксипроизводных прегненолона 117 и 118, соответственно (схема 29) [86].
В аналогичных условиях из доступного 5(6)-дегидро-Зр-гидроксиандростана 119 получен триен 120, окисление которого селективно привело к моноэпоксиду 121 (69%) (схема 30) - промежуточному соединению в синтезе 1а,25-дигидроксивитамина D3, ответственного за гомеостаз кальция и фосфора в организме [87]. Стоит отметить, что окислительная система H202-NaOH широко используется для эпоксидирования А4(5)-связи стероидного остова [88-91].
Окислительные трансформации в боковой цепи производных гидроксиэкдизона и синтезы на основе ю-оксоэкдистероидов
Структурной особенностью экдистероидов является г/ис-сочленение колец А и В, чему отвечает Р-конфигурация протона при атоме С5. Вместе с тем, сообщалось об идентификации 5а-20-гидроксиэкдизона в растениях вида Achyranthes fauriei [204, 205] и Leuzea carthamoides [206], а также 22-О-бензоил-5а-20-гидроксиэкдизона в растениях вида Silene scabrifolia [207]. Отмечалась эпимеризация 20-гидроксиэкдизона [207, 208] по хиральному атому С5 в присутствии основания, приводящая к частичному образованию 5а-эпимера. Наряду с цис- или шанс-сочленением циклов А и В существенное влияние на биологическую активность экдистероидов оказывают гидроксильные группы и их число, местоположение и конфигурация. В ряде случаев синтез или модификация структуры экдистероидов предполагают введение новых гидроксильных групп. Одной из таких проблем является введение гидроксильной группы в Соположение стероидного скелета. Первые представители 9-гидроксилированных экдистероидов - 9а,20-дигидрокси- [209] и 9р,20-дигидроксиэкдизоны [210] были обнаружены в растениях вида Silene italica ssp. nemoralis. Эти и другие 9-гидроксилированные экдистероиды интересны в качестве потенциальных низкомолекулярных биорегуляторов нового типа. Сообщалось о 9-гидроксилировании 20-гидроксиэкдизона в водно-метанольном растворе NaOH или NH4OH [168] и синтезе диацетонида 9а,20-дигидроксиэкдизона при расщеплении 14а-триметилсилилового эфира под действием избытка тетрабутиламмоний фторида [170].
Нами исследована трансформация экдистероидов в щелочной среде (МеОН-NaOH). Установлено, что диацетониды 20-гидроксиэкдизона 1 и понастерона А 2 в 10% растворе NaOH в МеОН за 3 часа при комнатной температуре нацело превращались в 9а-гидроксилированные 5а-экдистероиды - диацетонид 9а,20-дигидрокси-5а-экдизона 3 и, соответственно, диацетонид 9а-гидрокси-5а-понастерона А 4. Их выходы после очистки колоночной хроматографией составили 68 и 70%, соответственно (схема 1).
Гидролизом (10% НСЮ4-МеОН) диацетонида 3 получены 9а,20-дигидрокси-5а-экдизон 5 и его 20,22-ацетонид 6. Соединение 5 является 5а-эпимером природного экдистероида, выделенного из растения Silene italica ssp. nemoralis. Аналогично, гидролизом диацетонида 4 получены 9а-гидроксипонастерон А (7) (выход 44%) и его 20,22-ацетонид (8) (выход 51%) (схема 1).
Структура соединений 3-8 установлена на основании данных ЯМР Ни С (отнесение сигналов выполнено с помощью гомо- и гетерокорреляционных методик COSY, NOESY, ROESY, HSQC, HMBC). Появлению гидроксильной группы в Соположении стероидного остова, например соединения 3, отвечает новый, дополнительный (к имеющемуся в области 8с 70.53 м.д. С -атому) синглетный сигнал углеродного атома в области 8С 74.00 м.д. спектра ЯМР С (эксперимент DEPTq) вместо дублетного сигнала атома С9 в области дс 34.3 м.д. в спектре исходного соединения 1. В спектре ЯМР !Н соединения 3 отсутствует сигнал протона (8Н 2.7 м.д.), связанного с углеродным атомом С9 в исходном соединении 1, а сигнал протона Н из дублета ( J 2.0 Гц) трансформируется в синглет (8Н 5.9 м.д.). Гетерокорреляционные взаимодействия (спектр НМВС) протонов Зн3.0\ м.д. (Н5), 5.90 м.д. (Н7) и 1.11 м.д. (И19) с четверичным углеродом при дс 74.00 м.д. свидетельствует о принадлежности последнего атому С9. а-Конфигурация протона при атоме С5 и, следовательно, Tw/мносочленение колец А и В в соединениях 3-8 установлена на основании ROESY/NOESY спектральных данных соединения 5, согласно которым наблюдается кросс-взаимодействие между аксиальными протонами 8Н 2.70 м.д. (Н ), 4.02 м.д. (Н ) и 3.63 м.д. (Н5). Наличие NOE-взаимо действия между протонами 18-Ме и 19-Ме, а также между этими протонами и аксиальным протоном при С11 атоме свидетельствуют о транс-транс-сочяєнєнии колец А/В/С и а-конфигурации 9-ОН группы (рисунок 2). Брутто-состав синтезированных соединений 3, 5, 6 подтвержден регистрацией положительных ионов [Щ+ в спектре MALDI TOF/TOF.
NOE- и НМВС-взаимодействия 9а-гидрокси-5а-экдистероида 5 На примере диацетонида 1 показано, что за 0.5 ч гидроксилирование не происходило, а через 3 ч оно полностью завершилось. Гидроксилирование не наблюдалось в инертной атмосфере как в присутствии NaOH, так и при замене NaOH на К2С03 [207]. Анализ реакционной смеси, выдержанной в инертной атмосфере, показал наличие исходного соединения 1 и его 5а-эпимера 1а в соотношении -85:15 (из относительной интенсивности сигналов Н в области 8 5.8-5.9 м.д. спектра ЯМР !H). Смесь выделенных эпимеров 1 и 1а нацело превращалась в конечный продукт 3 при последующем выдерживании в 10% растворе NaOH в метаноле в течение 3 ч при доступе воздуха, что свидетельствует об участии кислорода воздуха в щелочном гидроксилировании.
9а-Гидроксилирование протекает после известной 5-эпимеризации в щелочной среде 5р-экдистероида 1 в 5а-эпимер la [195] через промежуточный диенолят-анион А. Последующее депротонирование 1а в метанольном растворе NaOH приводит к сопряженному диенолят-аниону В, окисление которого кислородом воздуха до 9а-гидропероксида С, и его последующее расщепление приводят к 9а-гидрокси-5а-экдистероиду 3 [168] (схема 2). Стоит отметить, что в инертной атмосфере гидроксилирования экдистероидов в щелочной среде не наблюдалось.
Схема Найденный ранее метод каталитического гидрирования [211] малореакционноспособной А -связи экдистероидов в щелочных условиях (MeONa-MeOH) проявил себя эффективно при гидрировании соединений 3 и 4. Однако, в отличие от 5р-экдистероидов, не имеющих гидроксильной функции в положении С9, при гидрировании 9а-гидроксилированных 5а-экдистероидов 3 и 4 наряду с соответствующими 7,8а-дигидроаналогами 9 и 11 (выход 73-75%) образуются ба-спирты 10 и 12 (выход 17-20%) (схема 3). Очевидно, 9а-гидроксильная группа способствует протеканию побочного процесса восстановления 6-кетогруппы.
Таким образом, при каталитическом (Pd-C) гидрировании в щелочных условиях (MeONa-MeOH) 9а-гидроксилированных 5а-экдистероидов имеет место 1,4- и 1,2-восстановление сопряженной еноновой группировки с преобладанием 1,4-процесса, приводящего к восстановлению двойной связи.
Схема В спектре ЯМР С вновь синтезированных соединений 9 и 11 отсутствуют сигналы sp -гибридизованных С и С атомов, а сигнал кето-группы смещается в более слабое поле Адс 9-9.2 м.д. Структуры аллильных спиртов 10 и 12 аналогичны структуре 5а-Н,6а-ОН-аллильного спирта, полученного ранее гидридным восстановлением диацетонида 1 [212]. Однако, 5а-Н,6а-ОН-спирты 10 и 12 содержат дополнительную 9-ОН группу. Наличие нового синглетного сигнала (эксперимент DEPTq) четвертичного атома углерода для соединений 10 (Sc 74.65 м.д.) и 12 (Sc 74.32 м.д.) и отсутствие сигнала протона при С9 в спектре ЯМР !Н свидетельствует о появлении гидроксильной группы в положении С9.
Таким образом, 5р-производные экдистероидов в щелочных условиях (10% раствор NaOH в абсолютном метаноле) подвергаются аутоокислению со стереоселективным образованием 5а-эпимеров 9а-гидроксипроизводных, каталитическое гидрирование которых приводит к соответствующим 7,8а-дигидроаналогам.
В Институте биохимии и генетики УНЦ РАН исследована стресс- и геропротекторная активность 9а-гидроксилированных 5а-экдистероидов 5-9 и 11 на экспериментальной модели насекомых - выведенных короткоживущих (Sh gen) и долгоживущих (L gen) линий комнатной мухи Musca domestica, в условиях спровоцированного теплового стресса, в сравнении с истинным гормоном линьки и метаморфоза - 20-гидроксиэкдизоном (20-Е). В результате проведенных биологических экспериментов установлено, что в исследуемом ряду синтезированных соединений с дополнительной 9а-гидроксильной группой, в концентрации 2-10" М, стресс- и геропротекторные эффекты согласованны между собой и в высокой степени зависят от генотипа и онтогенетической стадии развития тест-объекта. Максимальный стрессопротекторный эффект (снижение смертности испытуемых насекомых в результате теплового стресса) выявлен для соединения 9 (рисунок 3), тогда как 5а,9а-дигидроксиэкдистероид 5 проявляет стабильный геропротекторный эффект (увеличивает продолжительность жизни насекомого после перенесенного стресса в 2 раза) (рисунок 4).
Восстановительное аминирование производных ю-оксоэкдистероидов и синтез димерных экдистероидов
Выделение стероидных оксимов из морских губок Cynachyrella alloclada и C.apion [228], проявивших противоопухолевую [229], фунгицидную [230], антималярийную [231] активности обусловили интерес к синтезу оксимов стероидов и структурно родственных соединений.
Оксимы экдистероидов мало изучены. Сообщалось лишь о синтезе оксимов производных 20-гидроксиэкдизона по 6-кетогруппе и их перегруппировке в лактамы [232, 233].
Нами впервые синтезированы оксимы ю-оксоэкдистероидов - 2,3-(9 диацетил-20,22-О-изопропилиден-25-оксо-27-деметилпонастерона А 24, полученного озонолизом ю-ангидропроизводного 20-гидроксиэкдизона 21 и 2,3-(9-диацетилпостстерона 49, образующегося из 20-гидроксиэкдизона 48 путем 70 77 окислительного расщепления С -С связи с последующим ацетилированием. Оксимирование кетонов 24 и 49 под действием хлоргидрата гидроксиламина (2 мол.-экв.) в растворе пиридин-триэтиламин (100С, 3 ч) привело к соответствующим оксимам 50 (выход 86%) и 51 (выход 89%) (Е)-конфигурации (схема 10).
Схема Региоселективности протекания реакции оксимирования (только по кетону боковой цепи) отвечает сохранение сигналов 6-кетогруппы (дс -202 м.д.). Появление в спектрах ЯМР С соединений 50 и 51 сигналов в области с)с 158 м.д. (C=N) вместо сигналов кетогрупп в области дс -209 м.д. свидетельствует о трансформации кето-группы в гидроксииминогруппу. Сигналы метильной группы при связи C=N оксимов 50 и 51 обнаруживаются в существенно более сильном поле (Аде 6-9 м.д.) относительно соответствующих сигналов метилкетонов 24 и 49, что свидетельствует об их сш-ориентации по отношению к гидроксильной группе и, следовательно -конфигурации оксимов 50 и 51, тогда как при анти-ориентации сигналы а-СН3 групп (Z)-OKCHMOB ДОЛЖНЫ были бы находиться в более слабом поле (Адс 5-7 м.д.) [234].
Структура оксима 51 была однозначно подтверждена рентгеноструктурным анализом (рисунок 5). Брутто-составу оксимов 50 и 51 отвечают соответствующие молекулярные ионы [Щ+ в масс-спектрах MALDI TOF/TOF. Рисунок 5 - структура 20-гидроксиимино-2,3-(9-диацетилпостстерона (51) в кристалле
Каталитическое гидрирование (Ni-Ra) синтезированных оксимов 50 и 51 в МеОН ( 25С, 5 ч) приводит к соответствующим аминам 52 (выход 78%) и 53 (80%) (схема 11). Их структура установлена с помощью ID и 2D методик ЯМР Н и С спектроскопии. Согласно спектральным данным амин 52 представляет собой эквимольную смесь диастереомеров с (R)- и ( -конфигурацией нового С -хирального центра, о чем свидетельствует одинаковая интенсивность сигналов протона 25-метиновых групп (SH 3.67 и 3.73 м.д.) в спектре ЯМР !Н. Гидрирование оксима 51 протекает диастереоселективно с образованием смеси (20R)- и (205)-диастереомеров 53, что можно объяснить влиянием близкорасположенного С -хирального центра. Из соотношения интегральных интенсивностей синглетных сигналов протонов 18-метильных групп (дн 0.72 и 1.02 м.д.) следует, что диастереомеры присутствуют в соотношении -1:2. Схема Таким образом, оксимирование ю-оксоэкдистероидов протекает регио- и стереоселективно с образованием (Е)-оксимов по кетогруппе в боковой цепи. Каталитическим гидрированием (Ni-Ra) оксимов впервые синтезированы ю-аминоэкдистероиды. ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Спектры ЯМР !Н и 13С, гомо- и гетероядерные методики COSY, NOESY, ROESY, HSQC, НМВС регистрировали на приборах «Bruker Avance-400» (рабочая частота для 1Я - 400.13 МГц; для 13С - 100.62 МГц), «Bruker Avance III 500 HD Ascend» (рабочая частота для !Н - 500.17 МГц; для 13С - 125.78 МГц) и «Bruker Avance II 600» (рабочая частота для !Н - 600.13 МГц; для 13С - 150.76 МГц), растворители - CDC13, CD3OD, C5D5N. Химические сдвиги приведены в шкале 5 относительно Me4Si (внутренний стандарт). Элементный анализ проводили на CHNS-O-анализаторе «Carlo Erba ЕА-1108». Масс-спектры MALDI TOF/TOF с регистрацией положительных ионов и использованием в качестве матриц 2,5-дигидроксибензойной, 3,5-диметокси-4-гидроксициннамовой и а-циано-4-гидроксициннамовой кислот записывали на спектрометре «Bruker-Autoflex III». Удельное вращение определяли на поляриметре «Perkin-Elmer-141», удельное вращение выражали в (град мл) (г дм)-1, концентрацию раствора - в г-(100 мл)-1. Температуры плавления определены на малогабаритном нагревательном столе типа «БОЭТИУС». Для контроля методом ТСХ использовали пластинки с SiC 2 (Sorbfil), проявитель - раствор ванилина в этиловом спирте, подкисленный серной кислотой. Для колоночной хроматографии применяли силикагель L (100-200 мкм) марки КСКГ.
Рентгеновские дифракционные данные соединения (51) получены при комнатной температуре на дифрактометре "Xcalibur Е", оборудованном EOS CCD пространственным детектором и монохроматизированным источником МоКа-излучения (графитовый монохроматор, Mo Ка излучение, X = 0.71073 А, w-сканирование, 20max = 62). Сбор и обработка результатов выполнены с помощью программы CrysAlisPro Oxford Diffraction Ltd.,Version 1.171.36.20 [235]. Кристалл соединения (51) (C25H35NO7, М= 461.548) имеет триклинный тип кристаллической решетки. Параметры элементарной ячейки: а= 7.7710(9) К,Ъ = 10.1369(17) А, с = 10.2784(15) А, а = 116.094(16), р = 97.560(12), у = 95.034(11), V= 711.12(18) А3; пространственная группа Р1 (по. 1); Z= 1; Dcaic= 1.271 mg/mm3.
Получено 5100 Fhki, том числе 3691 независимых наблюдаемых отражений (Rmt = 0.0847) в области индексов -11 h 11, -13 к 13, -14 1 7. Окончательные значения факторов расходимости равны Rl = 0.0379 для 3017 независимых наблюдаемых отражений с 1 2а(1) и wR2 = 0.0957 для всех независимых отражений. Структура расшифрована прямым методом и уточнена полноматричным методом наименьших квадратов в анизотропном приближении для неводородных атомов. Атомы водорода локализованы в разностном синтезе Фурье и уточнены изотропно. Расчеты выполнены по программе SHELX97 [236]. Cif-файл депонирован в Кембриджском банке структурных данных - номер депонента CCDC-1055176. Копию этих данных можно получить бесплатно по запросу в CCDC, 12, Union Road, Cambridge, СВ2 1EZ, UK (fax: +44 1223 336033, e-mail: deposit@ccdc.cam.ac.uk) или через http: //www, cede. cam, ac. uk/data_request/cif.
Синтез конъюгатов ю-формил-нор-аналогов экдистероидов с (Х)-аскорбиновой кислотой
Дигидроксилирование А2(3)-связи синтезированного из холестерин-ацетата 151 холестанового производного 152 под действием Os04/NMO протекало не стереоселективно и приводило к образованию 2а,3а-153 (62%) и 2р,3р-дигидроксилированным продуктам 154 (28%), содержащим 5а-гидрокси-6-оксо фрагмент (схема 38) [125]. Синтезированные соединения являются структурными аналогами брассиностероидов, широко используемых в сельском хозяйстве для стимулирования роста и развития растений [97]. 2а,За,5а-Триол 153 проявил высокую ростостимулирующую активность по сравнению с гомобрассинолидом [125], что свидетельствует о высоком потенциале биоактивности такого рода соединений. Помимо фитогормональной активности недавно установлено, что брассиностероиды и их аналоги оказывают нейропротекторный эффект, препятствуя, таким образом, развитию нейродегенеративных заболеваний и накоплению в организме нейротоксинов, вызывающих окислительный стресс организма [126].
Окисление в аналогичных условиях А1 -связи синтезируемого из прегненолона 1 стероида 155 привело к образованию смеси 2а,3а- и 2р,Зр-диолов 156 в соотношении 82:18 (согласно ЯМР 1Н). 2а,За-Спирт 156 является ключевым интермедиатом в синтезе гибридной молекулы 157, сочетающей в своем составе стероидный остов, характерный для фитогормонов (брассиностероидов), и боковую стериновую цепь, свойственную экдистероидам (схема 39) [127].
Для синтеза биосинтетических прекурсоров брассиностероидов - 22-гидроксистероидов 160 [128], исходный стигмастерин 158 был последовательно трансформирован в эфир 159, выделенный в виде диастереомерной смеси 25 :2551 = 5.4:1. Последующее дигидроксилирование по Шарплессу смеси стероидов 159 под действием K20s04-2H20 в присутствии (DHQD)2AQN и K3Fe(CN)6 привело к промежуточному 22і?,23і?-диолу, 25і?-изомер которого в условиях реакции с участием 26-этоксикарбонильной группы вступает в перегруппировку Кляйзена и образует лактон 160 (49%) (схема 40) [129].
Схема Для оптимизации процесса гидрокси-функционализации по С -С -положениям терминального олефина 163, синтезированного на основе гекогенин-ацетата 128, было изучено г/иогидроксилирование по Шарплессу с участием системы К20804-лиганд (схема 42). Максимальный диастереомерный избыток (de) 25R.25S = 9.5:1 с выходом 82% был достигнут при использовании лиганда (DHQ)2PHAL, тогда как селективность с использованием других лигандов была низка (таблица 2). 25,26-Диольный стероид 164 является важным интермедиатом в синтезе потенциального противоопухолевого цефалостатин/риттеразинового гибрида - 25-эии-риттеростатина 165 [131]. Схема Таблица 2 - оптимизация условий г/иогидроксилирования стероида
16а,17а-Гидроксилированные стероиды являются важными прекурсорами в синтезе потенциальных противоопухолевых агентов [6, 132]. В синтезе аналогов сильнодействующих цитотоксических препаратов типа OSW-1 - 168 и 172 гидроксилирование А16(17)-стероидов 166 и 170 с получением 16а,17а-диолов 167 и 171 осуществлялось действием стехиометрических количеств Os04 в присутствии пиридина (схема 43). Следует отметить, что в результате многостадийного синтеза стероидов 168 и 172 наблюдается инверсия конфигурации С16-гидроксильной группы [133, 134]. Схема Окислительный реагент - R11O4 имеет ряд практически важных преимуществ по сравнению с Os04 (меньшая летучесть и токсичность, экономичность и доступность). Диогидроксилирование А2(3)-связи 25(і?)-6-оксо-5а-спиростена 173 (синтезирован из доступного диосгенина 37) с помощью Ru04, генерируемого in situ при взаимодействии RuCl3 3H20 с NaI04, привело к 2а,За-диолу 174 с выходом 83% (схема 44). Последующим надкислотным окислением CF3CO3H диола 174 получен лактон 175 (43%) [135] - структурный аналог брассиностероидов [115]. Недавно было установлено, что аналоги брассиностероидов проявляют противовирусное действие, в частности, против вируса герпеса и кори [136].
Периодатное дигидроксилирование холестерин-ацетата 151 в растворе ацетон/ацетонитрил/вода (3:3:1) приводит к образованию 5а,6а-диола 176 (68%) и продукта его дальнейшего окисления - 5а-гидрокси-6-кетопроизводного 177 (10%) (схема 45). Было показано, что гидрофильная система растворителей способствует протеканию конкурирующей реакции окисления ОН-группы под действием NaIC 4 и, следовательно, снижению выхода целевого диола 176. MeCN имеет важное значение в системе растворителей, поскольку предотвращает инактивацию катализатора RuCl3-3H20 [137]. 5а,6а-Диольный фрагмент присутствует в некоторых природных стероидах. Так, топсентистерол Сг (178, рисунок 1) впервые выделен из морских губок Topsentia sp. [138], гомаксистерол D! (179, рисунок 1), выделен из морских организмов Homaxinella sp. и обладает цитотоксической активностью [85]. Холеста 8(14),24-диен-Зр,5а,6а-триол (180, рисунок 1), выделенный из Lamellodysidea herbacea, проявляет противогрибковую активность в отношении Candida tropicalis [4], датуролактон 5 (181, рисунок 1), выделен из листьев Datura feroxL. (Solanaceae) [139].
Высокоэффективный (выход 99%), экологичный и хемоселективный метод Tw/аднодигидроксилирования А5(6)-связи стероида 182 до триола 183 был разработан с использованием 30% Н202 при катализе 98% H2S04 и йодида калия (схема 46) [140].
Схема Согласно механизму, предложенному авторами [140], в кислых условиях ион Г окисляется Н202 до иона 1+, который, присоединяясь к А5(6)-стероиду 184, приводит к иону йодиния 185, имеющего а-конфигурацию из-за стерического эффекта, вызванного наличием Ci0-Me группы. Далее под действием воды ион йодиния 185 превращается в 5а,бр-йодогидрин 186, в котором Сб-ОН и С5-1 имеют аксиальное расположение. 5а,бр-Иодогидрин 186 с отщеплением йодистого водорода трансформируется в эпоксид 187, который под действием воды раскрывается с образованием Tw/аднодигидроксилированного продукта 188 (схема 47).