Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор. «Синтез и биологическая активность гибридных соединений на основе пентациклических тритерпеноидов лупанового ряда» 8
1.1. Гибридные соединения лупановых тритерпеноидов с лекарственными агентами, витаминами и пептидами 9
1.2. Гибридные соединения лупановых тритерпеноидов с сахарами.. 22
1.3. Сложные эфиры пентациклических тритерпеноидов с биогенными кислотами, спиртами и аминокислотами 26
1.4. Амиды и амины на основе пентациклических тритерпеноидов лупанового ряда 33
1.5. Гибридные соединения, содержащие катионные фармакофоры.. 41
1.6. Гибриды пентациклических тритерпеноидов ряда лупана с конденсированными гетероциклами
1.6.1. Гибридные соединения с пятичленным гетероциклом 45
1.6.2. Гибридные соединения с шестичленным гетероциклом 50
1.7. Заключение 53
Глава 2. Обсуждение результатов 55
2.1. Синтез гибридных соединений пентациклических тритепеноидов лупанового ряда с аминоэтансульфокислотами... 55
2.1.1. Синтез производных с амидотауриновым фрагментом, связанным с бетулином сложноэфирным спейсером – остатком янтарной или малеиновой кислоты 58
2.2. Синтез конъюгатов бетулина, бетулиновой и бетулоновой кислот с 2-аминоэтан- и N-метил-2-аминоэтансульфо-кислотами на основе галоидэфиров 60
2.3. Синтез сульфобетаиновых производных бетулина, бетулиновой и бетулоновой кислот 63 2.4. Синтез амидоэтансульфонамидов бетулиновой и бетулоновой кислот 71
2.5. Синтез конъюгатов бетулина и бетулиновой кислоты с урацилом и его метилзамещенными гомологами 73
2.6. Функциональные свойства и биологическая активность некоторых синтезированных соединений
2.6.1. Гелеобразующая способность сульфобетаина (29) 80
2.6.2. Биологическая активность некоторых синтезированных соединений 81
Глава 3. Экспериментальная часть 84
Выводы 128
Список сокращений 129
Список литературы
- Сложные эфиры пентациклических тритерпеноидов с биогенными кислотами, спиртами и аминокислотами
- Гибриды пентациклических тритерпеноидов ряда лупана с конденсированными гетероциклами
- Синтез конъюгатов бетулина, бетулиновой и бетулоновой кислот с 2-аминоэтан- и N-метил-2-аминоэтансульфо-кислотами на основе галоидэфиров
- Функциональные свойства и биологическая активность некоторых синтезированных соединений
Введение к работе
Актуальность темы. Пентациклические тритерпеноиды лупанового ряда представляют интерес для медицины в качестве платформы для разработки новых лекарственных препаратов с различной биологической активностью. Современным подходом к созданию лекарственных агентов на основе вторичных метаболитов является синтез гибридных структур, сочетающих в себе активные компоненты двух или более лекарственных веществ. Актуальность данного подхода обусловлена возможностью создания соединений с новыми видами биологической активности, обладающих синергетным фармакологическим действием или лишенных недостатков исходных компонентов, таких как плохая растворимость соединений в воде, низкая биодоступность и т.д. Эндогенный метаболит -таурин (2-аминоэтансульфокислота), его производные, природные тауринсодержащие соединения обладают широким спектром биологической активности. Урацил является привилегированной структурой в создании препаратов противовирусного и противоопухолевого действия. Выбор указанных фармакофоров для конъюгирования с лупановыми тритерпеноидами обусловлен высоким терапевтическим потенциалом, доступностью, предпосылками создания на их основе амфифильных биологически активных агентов, а также соединений с новыми функциональными свойствами.
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Уфимского Института химии РАН по темам «Алкалоиды, терпеноиды и липиды – источник биологически активных соединений» (№ Госрегистрации 0120.0801441), «Терпеноиды, алкалоиды, липиды: выделение, изучение в природном сырье, синтез, трансформации, зависимость «структура-активность» (№ Госрегистрации 01201458023), при финансовой поддержке Совета по грантам Президента РФ (программа поддержки ведущих научных школ РФ: НШ-7014.2012.3, НШ-5923.2014.4), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Разработка методов получения химических веществ и создание новых материалов», направление: «Развитие методологии органического синтеза и создание соединений с ценными прикладными свойствами (2012-2014 г.г.), гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 13-00-14056), гранта Российского научного фонда (№ 14-13-01307).
Цель работы. Синтез модифицированных пентациклических тритерпеноидов лупанового ряда с фрагментами аминоалкансульфокислот, урацила и его производных с потенциальной биологической активностью.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
разработка подходов к синтезу производных пентациклических тритерпеноидов лупанового ряда, содержащих фрагменты амидо-, амино-этансульфокислот, амидоэтансульфонамидов и сульфобетаинов;
разработка способов получения конъюгатов лупановых тритерпенои-
дов с урацилом, его метил- и галогенпроизводными по положениям N-1-, N-3-урацильного цикла;
скрининг цитотоксической, иммуностимулирующей, противовирусной, гепатопротекторной активности некоторых из полученных соединений.
Научная новизна работы. Проведено систематическое исследование по синтезу гибридных соединений пентациклических тритерпеноидов лупанового ряда, содержащих фармакофоры аминоалкансульфокислот, представляющих интерес в качестве соединений с противовирусной, противовоспалительной, иммуностимулирующей, противоопухолевой, антидегенеративной, гепатопротекторной активностью.
Прямым конъюгированием доступных 2-аминоэтан- или N-метил-2-аминоэтансульфокислот с лупановыми тритерпеноидами через сложно-эфирные спейсеры по положениям C-3/C-28 получена серия производных лупанового ряда нового типа – амидо- и аминоэтансульфокислоты, их аммонийные и натриевые соли.
Впервые синтезирован новый тип цвиттер-ионных производных в ряду лупановых тритерпеноидов – сульфобетаинов, содержащих в положениях С-3/C-28 фрагмент (диметиламмонио)пропан/бутансульфоната или в С-28-по-ложении – фрагмент (имидазолиум)бутансульфоната.
На основе бетулиновой и бетулоновой кислот, используя активацию карбоксильной группы реагентом Мукаямы, разработан способ получения амидоэтансульфонамидов – новых пептидомиметиков в ряду лупановых тритерпеноидов.
Впервые синтезирована серия гибридных соединений бетулина, бетулиновой кислоты, метил- и бензилбетулиноатов с урацилом, метил- и фторпроизводными урацила, компоненты которых связаны по атому N-1 или N-3 пиримидинового цикла через сложноэфирный спейсер, и ряд N-1,N-3-дизамещенных пиримидинов, содержащих тритерпеновый и метильный заместитель.
Практическая значимость работы.
Разработан способ получения 3-галоидэфиров бетулина и бету-линовой кислоты исходя из бетулина с использованием винильной группы для селективной защиты первичного гидроксила на первой стадии получения бетулиновой кислоты, исключающий применение дорогостоящих реагентов, обычно применяемых для этих целей.
Обнаружен первый синтетический гидрогелатор в ряду пента-циклических тритерпеноидов лупанового ряда - 4-((2-(3-гидроксилуп-20(29)-ен-28-илокси)оксоэтил)диметиламмонио)бутан-1-сульфонат, образующий в концентрации 0.2% стабильные гели в системах H2O-ДМСО, H2O-AcOH, H2O-HCO2H.
В экспериментах in vitro выявлено дозозависимое пролиферативное действие 4-((2-(3-гидроксилуп-20(29)-ен-28-илокси)-2-оксоэтил)диметилам-монио)- и 4-((2-(3-гидроксилуп-20(29)-ен-28-илокси)-2-оксоэтил)имидазо-лиум)бутан-1-сульфонатов в отношении клеток линии HEK293 и Т-
лимфоцитов человека, что позволяет рассматривать полученные соединения в качестве потенциальных иммуностимулирующих и репаративных агентов.
Выявлена высокая цитотоксичность N-1-метил-N-3-лупенилпро-изводного урацила в отличие от его N-3-метил-N-1-лупенилрегиоизомера и синтетического предшественника бетулина.
В результате скрининга противовирусной активноcти in vitro выявлена противовирусная активноcть амидосульфонамида бетулоновой кислоты с пиперидиновым циклом в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm09.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на IX Всероссийской конференции «Химия и Медицина» с Молодежной научной школой по органической химии (Уфа, 2013г.), VIII Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Калининград, 2013г.), Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии». «XVII Молодежная школа-конференция по органической химии» (Екатеринбург, 2014г.), X Всероссийской конференции «Химия и Медицина» с Молодежной научной школой по органической химии (Уфа-Абзаково, 2015г.), Всероссийской молодежной конференции «Достижения молодых ученых: химические науки» (Уфа, 2015г.), III Всероссийской научной молодежной конференции «Актуальные проблемы нано- и микроэлектроники» (Уфа, 2015г.), Кластере конференций по органической химии «Оргхим-2016г.» (г. С.-Петербург, пос. Репино).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, получено 2 патента РФ, опубликованы тезисы 10 докладов Всероссийских конференций.
Личный вклад автора состоит в проведении экспериментальных исследований, анализе и интерпретации полученных результатов, в обработке литературных данных, в подготовке научных статей, патентов и тезисов докладов к публикации, в проведении апробации полученных результатов на конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора на тему «Синтез и биологическая активность гибридных соединений на основе пентациклических тритерпеноидов лупанового ряда», обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 261 наименования и 5 приложений. В приложение входят данные спектров ЯМР 13С синтезированных соединений, результаты морфологических и реологических исследований полученного в работе геля, результаты скрининга биологической активности некоторых из синтезированных соединений. Работа изложена на 188 страницах текста компьютерного набора (в том числе 25 страниц приложений), содержит 55 схем, 26 рисунков и 15 таблиц.
Автор выражает искреннюю благодарность академику РАН Марату Сабировичу Юнусову за внимание и консультации при выполнении данной работы.
Сложные эфиры пентациклических тритерпеноидов с биогенными кислотами, спиртами и аминокислотами
Гликозиды тритерпеноидов (сапонины) являются амфифилами, поскольку содержат в своей структуре липофильный и гидрофильный сахарный фрагменты и, в отличие от агликона, могут обладать лучшей растворимостью в воде и улучшенными фармакокинетическими характеристиками. Природные сапонины лупановых тритерпеноидов обладают широким спектром биологической активности (противоопухолевая, иммуностимулирующая, противовоспалительная), однако, в отличие от сапонинов других пентациклических тритерпеноидов, содержание их в природных источниках ограничено, а выделение представляет собой трудоемкий и малоэффективный процесс. На сегодняшний день существует только несколько производных лупановых тритерпеноидов, перспективных для дальнейшей биологической или клинической оценки в качестве противоопухолевых агентов c высокой цитотоксичностью, селективностью и растворимостью, соответствующей медицинским целям. Среди них – глюкопиранозид ацетоксибетулина (77) (препарат B10) и еще несколько гликозилированных производных бетулиновой кислоты. Введение сахарного фрагмента в ряде случаев позволяет существенно улучшить фармакокинетический профиль тритерпеноидов лупановой серии без снижения их цитотоксической активности [4, 37-39].
Классическими методами гликозилирования бетулиновой кислоты (1), бетулина (46) и их ацетоксипроизводных трихлорацетимидатами пербензоилированной -D-глюкопиранозы (78), -L-арабинопиранозы (79) или -L-рамнопиранозы (80) (TMSOTf, Мол. сита 4, СH2Cl2) c последующим деблокированием гидроксильных групп сахарного фрагмента получена большая серия сапонинов, содержащих один или два сахарных фрагмента, называемых моно- и бидесмозидами, соответственно [40]. Наибольшей цитотоксической активностью, превосходящей или сравнимой с активностью бетулиновой кислоты (1), обладали бисдесмозиды, причем активность соединений зависела как от природы сахарного фрагмента, так и агликона. Так, например, бисдесмозиды бетулина (81а) и бетулиновой кислоты (81б) были значительно активнее в отношении раковой клеточной линии MCF7 (IC50 14.5-20 M), чем кислота (1) (IC50 14.5-20 M). Бисдесмозиды (82а), (83) и (84a,б) ингибировали (IC50 1.7-23 M) рост клеток клеточных линий A549, DLD-1, MCF7, PC-3, тогда как (82б) был неактивен в отношении клеток А549 (IC50 100 M).
Исходя из 3-ацетоксибетулинового альдегида (85) через интермедиаты (86а-в) и (87), (88) осуществлен синтез производных лупановых тритерпеноидов с С-17-алкильной боковой цепью (89a-в) и С-28а-гомолупановых тритерпеноидов (90), (91), представленный на схеме 14 [41, 42]. Сапонины (92а-в)-(96а-в),и (97ж), содержащие в положении С-3 или С-28 остатки D-маннозы, L-арабинозы, L-рамнозы и D-идозы (98a-в) и (98ж), получены аномерно селективным гликозилированием соединений (89a-в) и (90), (91) соответствующими пербензоилированными гликозильными донорами в присутствии TMSOTf. Последующим деблокированием OH-групп сахарного фрагмента получены сапонины (92г-е)-(96г-е) и (97з).
Выраженная цитотоксичность в отношении раковых клеток линий СЕМ, MCF-7, HeLa наблюдалась только у монодисмозидов (92б) и (92г) (IC50 = 33.3-44.4 M), причем наибольшая – в отношении клеток нормального происхождения BJ-H (IC50 = 14.9 M). Среди сапонинов гомолупанов цитотоксической активностью обладал только L-рамнопиранозид (96е) (IC50 23.6-34.0 M).
На основе 2,3,4,6-тетра-О-бензоил-D-идопиранозилтрихлорацетими-дата предложен эффективный способ получения серии лупановых сапонинов, содержащих D-иодопиранозидный фрагмент (99), (101), (103), (105), (107), (109), (111) [43]. Деблокированием гидроксильных групп в указанных гликозидах получены соответствующие гидроксипроизводные (100), (102), (104), (106), (108), (110) и (112). Соединения (104), (106) и (112) проявили цитотоксическую активность в отношении раковых клеточных линий (СЕМ, MCF-7, HeLa) (IC50 9.3–37.6 M) и оказались особенно активны в отношении клеток нормального происхождения (BJ-H, IC50 7.3–20.1 M).
Описан эффективный метод гликозилирования ОН-группы тритерпеновых лупановых спиртов и С-17-карбоксильной группы производных бетулиновой кислоты, аналогичных (113) гликозил орто-гексинилпербензоатами (114) в присутствии катализатора PPh3AuNTf2. Метод позволяет получать гликозиды, подобные (115) в нейтральной среде, избежав тем самым перегруппировки Вагнера-Мейервейна бетулина (46) или производных бетулиновой кислоты, характерной для реакций в кислых условиях. [44, 45].
Предложен способ гликозилирования платановой кислоты -ацетобромглюкозой, катализируемого Ag2O, приводящего в зависимости от соотношения реагентов и применяемого растворителя к моно- или диглюкозидным производным [46].
В работе [47] проведено гликозилирование лупановых тритерпеноидов легкодоступными ацетилированными гликозильными донорами в среде ацетонитрила, с образованием гликозидов с перацетатным гликозильным фрагментом (выход 44-86%). Биологическая активность гликозидов, полученных в работах [40-42, 44-47], не изучалась.
Гибриды пентациклических тритерпеноидов ряда лупана с конденсированными гетероциклами
Аналогичным образом сформирован пиразиновый цикл, конденсированный с кольцом А 23-гидроксикислоты (304), с образованием (316) и последующим получением на его основе большой серии С-28-функционализированных производных, в том числе амидов (317), (318) и эфиров (319), (320) [20]. В работе [141] предложен альтернативный путь к пиразиновым производным метилдигидробетулоноата и дигидролупенона, заключающийся в получении соответствующего 2,3-дикетона (O2, t-BuOK, t-BuOH) и последующей катализируемой t-BuOK конденсации его с 1,2-диамином в водном метаноле. Соединение (315a) обладало выраженной активностью в отношении Leishmania donovani (IC50 13.2 M) [130]. Пиразиновое производное лупенона (318) обладало умеренной противовоспалительной активностью являясь ингибитором образования окиси азота в клеточных линиях RAW 264.7 (IC50 32.4 M) и J774A.1 (IC50 32.4 M) [136]. Все пиразиновые производные 23-гидроксибетулиновой кислоты (304) проявили противоопухолевую активность в отношении раковых клеток линий HL-60, BEL-7402, SF-763, HeLa, B16, превосходящей активность самой кислоты. Наиболее активный из полученных соединений, амид (318) (IC50 7.11-3.53 M) дозозависимо задерживал развитие клетки в G1 фазе и индуцировал апоптоз клеток меланомы линии B16 [142]. Схема 315a:R=C02H 34-R = C02H 314 Ac 316: R H 3156:R = CH3 272: R = CH3 317 =-мЗ) 318: R NHCHzCOzMe 319: R1 = OCH2CH2OH 320: R1 = OCgb CN Реагенты и условия: а. пропаргиламин, CuCl, EtOH, кип., 17ч; б. этилендиамин, S, морфолин, кип., 21 ч; Конденсацией диосфенола (321) с семикарбазидом, синтезирован гибрид (322), c конденсированным 1,2,4-триазиновым циклом. S-Алкилированием 3-тионовой группы в (322) получены замещенные триазины (323) и (324). Внутримолекулярной гетеро-реакцией Дильса-Альдера S-бутинилтриазина (324) при кипячении в толуоле осуществлен переход к тиенопиридину (325) [143].
Схема Реагенты и условия: а. О2, t-BuOK, t-BuOH, 40оC; б. тиосемикарбазид, K2CO3, EtOH, кип.; в. MeI, Et3N, ТГФ (323); 4-бромбут-1-ин, Et3N, ТГФ (324); г. ксилол, кип.;
Соединения (323)-(325) обладали выраженной цитотоксической активностью против раковых клеток линий L1210, HeLa и особенно - в отношении СЕМ-клеток (IC50 1.2-3.8 M), а также проявили высокую активность против цитомегаловируса из клеток легкого эмбриона человека (HEL-клетки). В данном случае минимальная эффективная концентрация (EC50) была значительно ниже порога токсичности, что позволяет рассматривать соединения (323)-(325) в качестве потенциальных лидеров для синтеза новых производных с анти-CVC-активностью.
Взаимодействием метилбетулоноата (297) с хлористым ацетилом в присутствии ZnCl2 c последующей обработкой реакционной массы водным аммиаком реализован подход к гибридным соединениям, содержащим 4-оксопирановый цикл, аннелированный с кольцом А тритерпенового остова (326), (327), а также пиридиновый заместитель в положении С-19 (328) [144]. ОМе а,б о
езюмируя сведения, представленные в литературном обзоре, можно сделать следующий вывод: cинтетическая модификация пентациклических тритерпеноидов лупанового ряда относится к одному из перспективных направлений в создании лекарственных агентов для лечения различных социально значимых заболеваний человека, прежде всего онкологических, паразитарных, инфекционных заболеваний различной этиологии (вирусной и бактериальной), иммунных и различных воспалений. За последние пять лет получены новые типы конъюгатов лупановых тритерпеноидов с лекарственными агентами, биогенными кислотами, аминами, компонентами, повышающими гидрофильность соединений - полиэтиленгликолями, циклодекстринами, соли, содержащие кватернизованный атом азота или фосфониевый катион, с широким спектром биологической активности и различными механизмами фармакологического действия. Так, разработан перспективный агент для лечения ВИЧ-инфекции, относящийся ко второму поколению ингибиторов HIV-1-репликации, по фармакокинетическим свойствам превосходящий ранее известный препарат Бевиримат. Синтезирован конъюгат бетулиновой кислоты с аскарбиновой кислотой, обладающий выраженной активностью в отношении вируса гриппа А/WSN/33, продемонстрировавший перспективность разработки противогриппозных агентов на платформе пентациклических тритерпеноидов лупанового ряда. Примечательно, что результаты биологических исследований новых гибридов лупановых тритерпеноидов вносят коррективы в существующие представления о зависимости структура-биологическая активность. Например, сложные эфиры бетулиновой кислоты, сама кислота, ее 3- и 3-эпимеры, содержащие трифенилфосфониевый катион в положении С-2, обладают высокой противоопухолевой активностью, вопреки полученным ранее представлениям о снижении активности при переходе от производных кислоты к ее эфирам или 3-эпимерам.
Таким образом, исследования по разработке подходов к синтезу производных пентациклических тритерпеноидов лупанового ряда, содержащих фрагменты привелигированных противовирусных, противоопухолевых агентов или эндогенных метаболитов, являются актуальными и могут привести к созданию новых перспективных биологически активных соединений с улучшенным фармакокинетическим профилем или новыми функциональными свойствами.
Синтез конъюгатов бетулина, бетулиновой и бетулоновой кислот с 2-аминоэтан- и N-метил-2-аминоэтансульфо-кислотами на основе галоидэфиров
Сульфонамидная группа является структурным элементом пептидомиметиков [218-222], многих биологически активных соединений и лекарственных препаратов, обладающих антибиотической, антибактериальной, противовирусной (анти-ВИЧ, гепатит С, герпес, SARS-короновирус, вирусы гриппа А и В), антиоксидантной, противоопухолевой, противовоспалительной, антидегенеративной [223-225] и антидиабетической [226] активностью. В связи с этим актуальным является синтез новых сульфонамидных производных, особенно на платформе доступных вторичных метаболитов. Достаточно привлекательным представляется использование таурина для получения сульфонамидов пентациклических тритерпеновых кислот лупанового ряда. В данном случае возможна реализация двух подходов. Первый из которых заключается в конъюгации бетулиновой (2) или бетулоновой кислоты (3) с таурином методами пептидного синтеза и в последующем взаимодействии образующегося амидоэтансульфоната с аминами. Второй – в сочетании кислот (2), (3) с сульфонамидными блоками (45а-г).
Предпринятые нами попытки прямой конъюгации кислот (2) или (3) с таурином под действием DMT-MM/Et3N в ДМФА [227] или EEDQ/Et3N в EtOH [228] приводили к трудноидентифицируемой смеси продуктов. При взаимодействии кислоты (2) с таурином в присутствии DEPC/Et3N [229] нами выделен с выходом 90% неизвестный ранее диэтилфосфорный ангидрид бетулиновой кислоты (46), который не вступал в последующую реакцию с таурином.
Синтез амидоэтансульфонамидов (47а-г), (48а-г) удалось реализовать конъюгацией 2-аминоэтансульфонамидных блоков (45а-г) с кислотами (2), (3), карбоксильная группа которых активирована реагентом Мукаямы [230]. Сульфонамидные блоки (45а-г) (в виде гидрохлорида) синтезировали взаимодействием фталевого ангидрида с 2-аминоэтансульфокислотой, последующей обработкой полученной Na-соли N-фталилзащищенной этансульфокислоты PCl5, сочетанием образующегося хлорангидрида с аминами (NHMe2, бензиламин, пиперидин, морфолин) и удалением фталильной защиты действием NH2NH2 в EtOH по известному методу [231]. Реакцию сульфонамидов (45а-г) с кислотами (2) и (3) проводили в CH2Cl2 в присутствии Bu3N, i-Pr2EtN или Et3N в качестве основания, при соотношении кислота:аминоэтансульфонамид:реагент Мукаямы:основание = 1:1:1.2:3). Целевые продукты выделяли методом КХ с выходом 20-60%. Выбор основания, как например, в случае амидосульфонамида (48б) оказывал существенное влияние на выход продукта, повышая его с 8% (Et3N) до 32% (DIPEA). Попытки получения соединений (47а-г) и (48а-г) хлорангидридным методом или с использованием таких активирующих агентов, как DMT-MM или EDC не привели к желаемому результату. При взаимодействии кислоты (2) с сульфонамидом (45а) в присутствии DEPC (ДМФА, Et3N, 20 ч), так же как и в реакции с таурином в качестве основного продукта был получен диэтилфосфорный ангидрид (46) (выход 90%) наряду с амидосульфонамидом (47а), выход которого составил 5%. Структуры всех полученных соединений установлены методами ЯМР 1Н и 13С спектроскопии с применением 2D экспериментов и масс-спектрометрии.
Урацил является привилегированной структурой в создании препаратов противовирусного и противоопухолевого действия [232, 233]. Урацильный цикл может быть связан по положению N-1 с сахарным (противовирусные препараты идоксуридин, азидотимидин) или ациклическим фрагментом (противораковый препарат кармофур) [234-236], а также конъюгирован по положениям N-3 например, с противораковыми агентами (паклитаксел, винбластин) [237].
В ряду лупановых тритерпеноидов описан пример 5-триазолилурацильного производного кислоты (2) и получена серия гибридных соединений с AZT, проявившх в ряде случаев анти-ВИЧ-активность, превышающую активность исходных соединений [13, 14, 17]. Сведения о конъюгатах лупановых тритерпеноидов с урацилом, не входящим в состав нуклеозида, метилзамещенными гомологами урацила, 5-F-урацилом, а также N-3-конъюгатах в литературе отсутствуют.
В данной работе получена серия С-28-конъюгатов бетулина и С-3-конъюгатов бетулиновой кислоты, метил- и бензилбетулиноатов с урацилом и его производными, компоненты которых связаны сложноэфирным спейсером по положению N-1 или N-3-пиримидинового цикла. Синтез конъюгатов бетулин-пиримидиновое основание проводили N-алкилированием урацила (49) и его производных (50)-(53) галоидацетатами бетулина (15а) или (15б).
Региоселективным N-1-алкилированием пиримидинов (49)-(51) в ДМФА в присутствии K2CO3 (3-7 ч) получены конъюгаты (54)-(56) с выходами 69-86%. В случае 3,6-диметилурацила (52) N-1-лупенилпроизводное (57) получали с выходом 91% взаимодействием (15б) с (52) в присутствии NaH в течении 30 мин. N-Алкилирование (53) в тех же условиях приводило к смеси региоизомерных N-1-/N-3-лупенилпроизводных (58) и (59) в соотношении 2:1 (ЯМР 1Н) с общим выходом 82%. Алкилирование (53) в присутствии K2CO3 снижало общий выход соединений (58), (59) до 38%, однако приводило к увеличению доли продукта N-1-алкилирования (58:59 9:1, ЯМР 1Н). Образование смеси региоизомеров (58) и (59) при взаимодействии (53) c бромацетатом (15б) согласуется с литературными данными о стерическом влиянии заместителя в С-6-положении на селективность N-алкилирования 6-замещенных урацилов [238].
Функциональные свойства и биологическая активность некоторых синтезированных соединений
ИК-спектры зарегистрированы на спектрофотометре «IR Prestige-21 Shimadzu» в вазелиновом масле. Спектры ЯМР 1Н и 13С зарегистрированы на импульсном спектрометре Bruker Avance III c рабочей частотой 500.13 МГц (1Н) и 125.47 МГц (13С) с использованием датчика с Z-градиентом PABBO при постоянной температуре образца 298оК или на спектрометре Bruker AM-300 с рабочей частотой 300.13 МГц (1H) и 75.47 МГц (13C). Корреляционные спектры 1H-15N HSQC и 1H-15N HMBC записаны на спектрометре Bruker Avance III с частотой 50.68 MГц на ядрах 15N при температуре 293оК. Химические сдвиги в спектрах ЯМР 13С, 1Н приведены в м. д. относительно сигнала растворителя: 8H 7.27 м.д., 8C 77.1 м.д. (CDCI3) или внутреннего стандарта тетраметилсилана (ТМС). В качестве внешнего стандарта в ЯМР 15N использован NH3. Химические сдвиги атомов азота определены относительно внешнего стандарта NH3. Значения констант спин-спинового взаимодействия 1H-1H приведены в Гц. Двумерные спектры зарегистрированы в стандартных режимах многоимпульсных последовательностей программного обеспечения прибора. Масс-спектры ионизации электрораспылением (ИЭР) и химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД) были получены на квадрупольном жидкостном хромато-масс-спектрометре LCMS-2010 EV (Shimadzu) (шприцевой ввод образца, 0.1 мл/мин, элюент - ацетонитрил/ вода в соотношении 95/5) в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов при потенциале капилляра 4.5 и -3.5 кВ. Температура интерфейса ХИАД 250оС. Температура нагревателя 200оС, температра испарителя 230оС. Скорость газа-распылителя (азот) 1.5 и 2.5 л/мин для ИЭР и ХИАД, соответственно. Углы вращения измерены на приборе «Perkin-Elmer-341С». Для колоночной хроматографии использовали SiO2 (марка «L», 40/60 мкм. Россия). Для ТСХ применяли пластинки «Sorbfil» (ПТСХ-АФ-А, Россия, г. Краснодар, ЗАО «Сорбполимер»). Температуру плавления определяли на столике Кофлера.
Визуализацию микроструктуры геля проводили с помощью растрового электронного микроскопа «Tescan Mira 3» (ускоряющее напряжение 5 кВ, расстояние между детектором и образцом (WD) 8мм и сканирующего зондового микроскопа Solver Pro-M («НТ-МДТ», Россия, г. Москва/Зеленоград). Реологические исследования проводили на реометре MARS-11 («Haake», Германия). Бетулин (1) выделяли из коры березы по методу [247] или использовали коммерческий продукт (ООО "Деревит", г. Пермь). О Виниловый эфир бетулина (5) получали по методу [180], моноацетаты бетулина (4б) получали по методу [248], метиловый эфир бетулиновой кислоты (18а) и 30-бромметиллуп-20(29)-ен-3,28-ил диацетат (24) – по методу [249], 18(Н)-олеанан-3,19,28-триол (41) – по методу [250]. Тетрабутиламмонийную соль таурина получали по методу [163], N метилтаурин - по методу [251], Na-соль N-метилтаурина – по методу [252], 2 бромэтансульфонат – по методу [253]. 2-Аминоэтансульфонамиды (45а-г) синтезировали по методу [224, 254]. Реагент Мукаямы получали из 2 бромпиридина по методу [255]. Соединения (62) и (63) получали по методу [244]. В эксперименте использованы коммерческие реагенты: 2 аминоэтансульфокислота, урацил («РЕАХИМ»), 5-метилурацил, 6 метилурацил («РЕАХИМ»), 5-фторурацил («ABCR») N,N-диметиламин (40% водн.) («Fluka»), 2-бромуксусная кислота (99%, «Acros»), 1,3-пропансультон (99%, «ABCR»), 1,4-бутансультон (99%, «Aldrich»), DEPC (90%, «Aldrich»). Безводные 1,2-дихлорэтан и ТГФ готовили по методу [256]. Ацетонитрил перегоняли над P2O5, затем над CaH2, ДМФА выдерживали над MgSO4 и перегоняли над мол. ситами 4 в вакууме в атмосфере аргона. СH2Cl2 перегоняли над СаН2, К2CO3 прокаливали перед использованием в реакции. ИПСМ РАН; ИБГ УНЦ РАН, лаб. физико-химических методов анализа биополимеров; ООО «РН-УфаНИПИнефть», лаб. физико-химических исследований. 28-Гидроксилуп-20(29)-ен-3-ил ацетат (4а). Через смесь 1.00 г (2.26 ммоль) бетулина (1) и 0.76 г (2.78 ммоль) КОН в 50 мл ДМСО пропускали ток ацетилена при 80оС в течении 2.5 ч. Реакционную массу охлаждали, разбавляли лед. H2O (50 мл), экстрагировали МТБЭ (5x30 мл), объединенные органические экстракты промывали водой, сушили Na2SO4, растворитель упаривали. Остаток экстрагировали пентаном (5x30 мл), экстракт упаривали, получили 1.00 г О-винилового эфира бетулина. К раствору полученного эфира в 15.00 мл Py добавили по каплям 2.40 мл Ac2O, перемешивали 12 ч, добавили 10% HCl, экстрагировали СHCl3 (5x30.00 мл), промывали водой, высушивали Na2SO4, растворитель упаривали, остаток хроматографировали на SiO2 (бензол:МТБЭ, 4:1). Получили 0.32 г (30%) (4а). Т.пл. 254-255оС (лит. 256-258оС) [257]. Спектр ЯМР 1Н соответ. лит. [257]. Спектр ЯМР 13C (75.47 МГц, CDCl3): 14.67, 15.93, 16.09, 16.42, 18.13, 19.01, 20.79, 21.22, 23.62, 25.12, 26.99, 27.87, 29.13, 29.71, 34.91, 34.12, 37.02, 37.25, 37.72, 38.33, 40.87, 42.65, 47.76, 48.70, 50.25, 55.32, 60.39, 80.69, 109.63, 150.39, 170.93.