Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Структура и методы синтеза мембрано-якорных фрагментов, терпеноидов и малеинимидов (литературный обзор) 8
1.1 Подходы к синтезу мембрано-якорных фрагментов 9
1.1.1 Химический синтез гликозилфосфатидилинозитолов 9
1.1.2 Синтез мембранных якорей на основе производных фосфолипидов 15
1.1.3 Синтез мембранных якорей на основе производных холестерола 18
1.1.4 Синтез мембранных якорей: примеры неклассических подходов 23
1.2 Терпеноиды и их взаимодействие с липидными мембранами 27
1.3. Методы синтеза малеинимидов 33
1.3.1 Методы синтеза N-замещенных малеинимидов 33
1.3.2 Методы синтеза незамещенного малеинимида 38
ГЛАВА 2. Синтез и изучение мембранотропных свойств амфи фильных аддуктов монотерпенов (обсуждение результатов) 41
2.1 Реакционная способность аллооцимена в реакциях Дильса-Альдера и их
стереохимический результат 44
2.2 Синтез аддуктов малеинового ангидрида и их модификация нуклеофильными реагентами 47
2.3 Синтез аддуктов N-замещенных малеинимидов, содержащих карбоксильные и четвертичные аммониевые группы, и исследование их взаимодействия с модельными биомембранами
2.4 Синтез амфифильных соединений, содержащих два терпеноидных фрагмента 61
2.5 Синтез амфифильных соединений, содержащих бетаиновые фрагменты 67
2.6 Синтез амфифильных соединений, содержащих третичные аминогруппы 71
2.7 Синтез производных изопрена и циклопентадиена, содержащих карбоксильные и третичные аминогруппы 75
2.8 Синтез мембрано-якорной структуры, объединенной с фармакофорным фрагментом 77
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 82
Заключение 108
Список условных обозначений и сокращений 110
Список использованных библиографических источников 112
- Синтез мембранных якорей на основе производных фосфолипидов
- Терпеноиды и их взаимодействие с липидными мембранами
- Синтез аддуктов N-замещенных малеинимидов, содержащих карбоксильные и четвертичные аммониевые группы, и исследование их взаимодействия с модельными биомембранами
- Синтез производных изопрена и циклопентадиена, содержащих карбоксильные и третичные аминогруппы
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Одной из важнейших областей применения органической химии является получение новых эффективных лекарственных препаратов. Разработка лекарственных препаратов и средств их адресной доставки является весьма сложной и трудоемкой задачей. Эффективный препарат должен иметь очень высокую специфичность действия при минимальных побочных эффектах. Однако каким бы селективным ни было действующее вещество (ингибитор, модулятор, агонист или антагонист) in vitro, оно не освобождено от неспецифических взаимодействий, которые могут привести к его разрушению или выведению из организма прежде, чем оно успеет достигнуть своей терапевтической цели. Для решения этой проблемы должны применяться эффективные стратегии доставки лекарственных препаратов.
Многие препараты нацелены на внутриклеточные объекты. Способность проникать через плазматическую мембрану зачастую является лимитирующим фактором их активности. Одной из эффективных стратегий для преодоления барьера плазматической мембраны является закрепление действующего вещества на ее поверхности с последующим поглощением клеткой путем эндоцитоза. Такое закрепление можно осуществить при помощи мембранного якоря – амфифильной молекулы или фрагмента молекулы, - имеющего высокое сродство к липофильной части бислойных плазматических и внутриклеточных мембран.
Терпены – класс углеводородов природного происхождения – являются прекрасными кандидатами на роль мембранного якоря. Они обладают такими преимуществами как высокое сродство к липофильной части бислойных фосфолипидных мембран, низкая токсичность и хорошая доступность из природных источников. В связи с этим нами было предложено разработать подходы к синтезу амфифильных производных монотерпенов и исследовать их взаимодействие с модельными бислойными мембранами.
Степень разработанности темы исследования. Создание амфифильных
производных мирцена, потенциально способных играть роль мембрано-якорных фрагментов, открывает широкие возможности их использования в системах доставки лекарственных препаратов. Ранее описанные в литературе молекулярные фрагменты, используемые для этой цели, в большинстве случаев являются остатками холестерола, а также линейными или изопреноидными алкильными цепочками. Все эти фрагменты объединяет линейная или планарная геометрия. Амфифильные аддукты мирцена и N-замещенных малеинимидов по реакции Дильса-Альдера имеют неплоскую геометрию, что делает их принципиально новым классом мембрано-якорных фрагментов, синтез и взаимодействие которых с мембранами не описаны в литературных источниках.
Цели и задачи работы заключаются в разработке подходов к синтезу амфифильных
аддуктов мирцена и аллооцимена с N-замещенными малеинимидами, содержащими
карбоксильные, третичные амино-, четвертичные аммониевые, бетаиновые и
сульфобетаиновые группы в полярной части, и исследовании взаимодействия полученных соединений с модельными биомембранами – везикулами дипальмитоилфосфатидилхолина. Задачами данной работы также являются получение и изучение свойств аддуктов
1 Автореферат диссертации оформлен в соответствии с ГОСТ 7.0.11 – 2011 ДИССЕРТАЦИЯ И АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРАЦИИ Структура и правила оформления
вышеперечисленных имидов с монотерпенами аллооцименом и мирценом, а также с компактными диенами (изопреном и циклопентадиеном), имеющими альтернативное строение липофильной части.
Научная новизна работы состоит в следующем:
впервые синтезированы амфифильные аддукты мирцена и N-замещенных малеинимидов, содержащие карбоксильные, третичные амино-, четвертичные аммониевые, бетаиновые и сульфобетаиновые группы в полярной части;
впервые синтезированы амфифильные аддукты аллооцимена, изопрена и циклопентадиена, содержащие карбоксильные, третичные амино-, четвертичные аммониевые группы в полярной части;
впервые синтезированы липидоподобные соединения, содержащие в качестве липофильного фрагмента остаток мирцена;
разработан синтетический подход к введению мембрано-якорного фрагмента мирцена в структуру фармакофорных молекул;
- впервые на модельной системе – суспензии везикул
дипальмитоилфосфатидилхолина – методом турбидиметрии показана способность
встраивания в липидный бислой аддуктов мирцена и аллооцимена с N-замещенными
малеинимидами, содержащими карбоксильные и третичные аминогруппы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Синтезированы амфифильные
аддукты мирцена и N-замещенных малеинимидов, содержащие карбоксильные, третичные
амино-, четвертичные аммониевые, бетаиновые и сульфобетаиновые группы в полярной
части, а также аналогичные аддукты аллооцимена, изопрена и циклопентадиена, содержащие
карбоксильные, третичные аминогруппы в полярной части. Методом турбидиметрии на
модельных везикулах дипальмитоилфосфатидилхолина показано, что способность к
взаимодействию с мембраной без её разрушения показывают производные мирцена и
аллооцимена, содержащие карбоксильные и третичные аминогруппы. Синтезированы
липидоподобные соединения, содержащие остаток мирцена в липофильной части, для
которых также показана возможность встраивания в фосфолипидную мембрану, ведущая,
однако, к ее разрушению (солюбилизации) с ростом концентрации липидомиметика.
Предложен и реализован синтетический подход введения мембрано-якорного фрагмента
мирцена в структуру биологически-активных молекул, заключающийся в ацилировании
спиртовых групп хлорангидридом малеинимидоуксусной кислоты с последующим
присоединением по Дильсу-Альдеру остатка мирцена. Данный подход может быть расширен
на биологически-активные молекулы, содержащие отличные от гидроксильной
нуклеофильные группы, такие как первичные или вторичные амино- и меркаптогруппы.
Методология и методы исследования. В рамках проведенных исследований был
использован широкий набор современных методов органической химии для получения
амфифильных производных мирцена, а также установления их структуры и состава (ИК,
ЯМР спектроскопия, масс-спектрометрия, элементный анализ). Взаимодействие
синтезированных соединений с модельными фосфолипидными мембранами (везикулами
дипальмитоилфосфатидилхолина) исследовалось методом турбидиметрического
определения температуры фазового перехода мембран.
Положения, выносимые на защиту:
1. Разработка подхода к синтезу амфифильных производных мирцена, содержащих в
полярной части незаряженные, положительно и отрицательно заряженные, а также цвиттер-
ионные фрагменты, основанного на циклоприсоединении по Дильсу-Альдеру различно
замещенных малеинимидов.
2. Разработка подхода к введению липофильного остатка мирцена в структуру
биологически активных соединений на примере синтеза производного бис(2-
хлорэтил)амина.
3. Синтез амфифильных производных мирцена, содержащих карбоксильные,
третичные амино-, четвертичные аммониевые, бетаиновые и сульфобетаиновые группы в
полярной части; синтез амфифильных производных аллооцимена, изопрена и
циклопентадиена, содержащих карбоксильные и третичные аминогруппы в полярной части.
4. Закономерности, связывающие структуру липофильных частей и типы полярных
групп синтезированных амфифильных соединений с их способностью взаимодействовать с
модельной фосфолипидной биомембраной, состоящей из дипальмитоилфосфатидилхолина.
Личный вклад автора. Автор принимал участие в постановке цели и задач
исследования, анализе литературных данных, выполнении экспериментальных
исследований, обсуждении результатов и формулировке выводов, подготовке публикаций по теме исследования. Все соединения, представленные в диссертационной работе, синтезированы соискателем лично.
Степень достоверности результатов. Достоверность результатов проведённых исследований подтверждается использованием целого ряда современных физических и физико-химических методов анализа.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международном конгрессе «International congress of Organic Chemistry» (Казань, 2011), XI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2012), Итоговой научно-образовательной конференции студентов Казанского (Приволжского) федерального университета (Казань, 2013), Кластере конференций по органической химии «ОргХим-2013» (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезиса докладов.
Объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста, включает 47 схем, 18 рисунков и 3 таблицы. Состоит из введения, трёх глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 144 ссылки.
В первой главе представлен обзор литературных данных по методам химического синтеза мембрано-якорных фрагментов и их применению; по взаимодействию терпеноидов с липидными мембранами, а также методам получения различно замещенных малеинимидов.
Основные результаты экспериментальных исследований, их обсуждение приведены во второй главе. Рассмотрены различные подходы к синтезу амфифильных производных мирцена, содержащих карбоксильные, третичные амино-, четвертичные аммониевые, бетаиновые и сульфобетаиновые группы в полярной части, а также аналогичных производных аллооцимена, изопрена и циклопентадиена. Проведено исследование
взаимодействия полученных соединений с модельными биомембранами. Разработан подход к введению липофильного остатка мирцена в структуру биологически активных молекул.
Экспериментальная часть работы, включающая описание проведённых
синтетических, физико-химических, физических, биофизических экспериментов, а также квантово-механических расчетов, приведена в третьей главе диссертации.
Работа выполнена на кафедре органической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета, является частью исследований по основному научному направлению «Синтез, строение, реакционная способность и практически полезные свойства органических, элементоорганических и координационных соединений».
Рентгеноструктурный анализ выполнялся под руководством д.х.н. О.Н. Катаевой. Регистрация масс-спектров выполнена в лаборатории физико-химического анализа Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова к.х.н. И.Х. Ризвановым.
Синтез мембранных якорей на основе производных фосфолипидов
Закрепление на поверхности мембран, как плазматических, так и внутриклеточных, различных фрагментов (рецепторов, ферментов, антигенов) – достаточно распространенное явление в биологических системах. Когда речь идет о белковых молекулах, закрепление происходит при помощи так называемых мембрано-якорных доменов – участков белка, обогащенных гидрофобными аминокислотами и имеющих вторичную структуру -спиралей. Искусственное применение таких высокомолекулярных структур для закрепления на поверхности мембраны каких-либо фрагментов сопряжено со сложностями, которые, прежде всего, вызваны отсутствием надежных методов выделения или синтеза подобных фрагментов. Хорошей альтернативой являются низкомолекулярные мембранные якоря, представляющие собой достаточно разнообразный набор соединений: от простых алкильных цепочек до производных холестерола и таких сложных структур как гликофосфатидилинозитолы. В этой главе мы постараемся дать как можно более полное представление о том, какие виды низкомолекулярных мембрано-якорных фрагментов используются в современной науке. При этом области применения описываемых мембранных якорей не имеют принципиального значения, так как для внутриклеточной доставки необходимым является лишь выполнение главной функции любого мембранного якоря – закрепления «полезного груза» на поверхности фосфолипидной мембраны. Решающими параметрами для якорных фрагментов являются их синтетическая доступность, прочность закрепления и возможная селективность по отношению к плазматическим мембранам разных типов тканей. Особое внимание будет уделено методам их химического синтеза.
В роли альтернативного мембрано-якорного фрагмента нами предлагается использование монотерпена мирцена и его изомера аллооцимена, в связи с этим вторая часть литературного обзора посвящена известным примерам взаимодействий терпенов и терпеноидов с фосфолипидными мембранами.
В ходе выполнения работы было обнаружено, что синтез функционализированных N-замещенных малеинимидов, необходимых для присоединения гидрофильных фрагментов к монотерпенам, является непростой задачей. Методы синтеза малеинимидов сильно разнятся в зависимости от типа заместителя при атоме азота. В связи с этим третья часть литературного обзора посвящена рассмотрению методов получения различно замещенных малеинимидов. 1.1 Подходы к синтезу мембрано-якорных фрагментов
Концепция закрепления на плазматической мембране клетки мембрано-якорных фрагментов очень часто встречается в природе. Так, многие ферменты [2] и рецепторы [3] закрепляются на поверхности мембран - как плазматических, так и внутриклеточных. Зачастую закрепление осуществляется при помощи мембрано-якорных доменов этих молекул, представляющих собой белковые -спирали, содержащие большое количество остатков гидрофобных аминокислот. На данный момент существует ряд синтетических низкомолекулярных соединений, которые выполняют функцию мембранных якорей. Они находят самое разнообразное применение: закрепление на мембране антигенов, белковых молекул, олигонуклеотидов и прочих биологически важных молекул; прикрепление липидных бислоев к твердой подложке, скрепление везикул, как между собой, так и их прикрепление к липидному бислою на подложке.
В 1988 году была установлена структура нового типа природных мембрано-якорных групп: гликозилфосфатидилинозитолов (ГФИ) [4]. Общая структура и возможные модификации ГФИ представлены на схеме 1.1. В природе такой якорный фрагмент отвечает за закрепление на поверхности мембраны белковых молекул, а также антигенов.
Из-за возможности различного сочетания заместителей R1–8, природные ГФИ крайне трудно выделить в индивидуальном виде. Поэтому проблема получения индивидуальных мембрано-якорных фрагментов этого типа решается в рамках современной органической химии. Первый полный синтез ГФИ был проведен в 1991 году [5]. С тех пор методы химического синтеза ГФИ значительно усовершенствовались. Можно выделить две основные стратегии. Первая заключатся в предварительной сборке углеводного скелета и последующем региоселективном введении в структуру фосфатных и липидных фрагментов с применением различных защитных групп. Вторая стратегия заключается в предварительной сборке объемного фосфоглицеролипидного остатка путем присоединения фосфолипидного остатка, например, к глюкозазиду через инозитол, что приводит к получению промежуточного соединения 1.1 (схема 1.2). Далее по этой стратегии применяется конвергентный синтез, что позволяет быстро получать разнообразные ГФИ и их производные, присоединяя различные олигосахариды к соединению 1.1 [6]. Для того, чтобы воспроизвести природное многообразие ГФИ, группа Зибергера (Seeberger) [7] предложила подход с использованием «ортогональной» защиты. Ортогональность заключается в подборе таких защитных групп, которые реагировали бы в разных условиях. Таким способом удается вести строго селективное замещение подобных групп, используя соответствующие реагенты и условия реакций. Ключевым фрагментом в этой схеме является центральный остаток маннозы 1.2 или 1.3, который содержит в себе подобные группы. Такой подход позволяет вести сборку конечной структуры с высокой региоселективностью и получать структуры с любой встречающейся в природе степенью разветвленности углеводного фрагмента. Применимость стратегии была показана на синтезе ГФИ Toxoplasma gondii, содержащего дисахарид в 4-О-положении остатка Man-I [8].
Получение ГФИ, содержащих остатки ненасыщенных карбоновых кислот в липидном фрагменте, интересно как со структурной, так и с биологической точки зрения. Данные соединения обладают очень высокой провоспалительной активностью, которая приписывается именно наличию в их структуре ненасыщенных ацильных остатков. Однако при их синтезе оказываются неприменимы традиционные методы бензильной защиты гидроксильных групп из-за восстановления двойных связей при снятии защиты. Для решения этой задачи группой Николаева было предложено использование бензоильных и силильных защитных групп [9].
Терпеноиды и их взаимодействие с липидными мембранами
Адресная доставка лекарственных веществ является обширным разделом современной науки на пересечении таких дисциплин как химия, биология, медицина и биофизика. Под адресной доставкой понимают направленный транспорт лекарственного вещества в заданную область организма, органа или клетки. Особую важность имеет внутриклеточная доставка лекарственных препаратов: она позволяет резко увеличить их эффективность, так как большинство препаратов нацелены на внутриклеточные объекты. До недавнего времени большинство стратегий внутриклеточной доставки были так или иначе связаны с системами на основе липосом (для водорастворимых препаратов), либо мицелл (для жирорастворимых препаратов) [95]. Такие стратегии не лишены своих недостатков. Амфифильные агенты, образующие мицеллы зачастую обладают токсичностью, либо могут серьезно нарушить целостность клеточной мембраны [96–98]. Липосомы сами по себе обладают лишь слабой способностью к внутриклеточному транспорту, что связывают с их быстрым удалением из кровотока клетками печени, поэтому для повышения эффективности их поверхность модифицируют различными способами: защитными полимерными оболочками, антигенами, либо прочими лигандами, комплементарными к клеточным рецепторам [99]. Это существенно усложняет разработку и увеличивает стоимость таких систем внутриклеточной доставки.
В последнее время внимание ученых стал привлекать альтернативный путь – кавеолярно-опосредованный эндоцитоз [100]. Кавеолы (от лат. caveola – «малая пещера») – небольшие (размером 50—100 нм) колбообразные впячивания плазматической мембраны в клетках позвоночных. Для использования этой стратегии достаточно закрепить биологически активную молекулу на поверхности мембраны [1]. Для такого закрепления применяются мембрано-якорные фрагменты. Их типы, строение, методы химического синтеза, преимущества и недостатки подробно рассмотрены в литературном обзоре (см. с. 8–27). Несмотря на структурное разнообразие описанных мембранных якорей, примеры использования терпеноидных структурных фрагментов являются единичными и сводятся к использованию линейных изопреноидных цепочек. При этом, как следует из литературных данных, рассмотренных выше (см. с. 27–33), терпеноидные фрагменты, в первую очередь циклического или полициклического строения, обладают высоким сродством к липофильной части фосфолипидных мембран, что делает крайне привлекательным их применение в качестве мембрано-якорных фрагментов. Кроме того, терпеноидным фрагментам должны быть свойственны высокая биосовместимость и малая токсичность, как естественным продуктам метаболизма живых организмов. Для исследования возможности применения остатков монотерпенов в качестве мембрано-якорных фрагментов, нами предлагается синтез и сравнительное изучение свойств амфифильных производных мирцена и аллооцимена, содержащих различные гидрофильные группы. Оба вышеупомянутых монотерпена обладают сопряженной системой двойных связей, что делает пригодным использование реакции Дильса-Альдера для введения полярных остатков в их молекулы. В качестве диенофилов удобно использовать малеиновый ангидрид или N-замещенные малеинимиды. Образующиеся в первом случае производные, содержащие сукцинимидный фрагмент, могут быть с легкостью модифицированы реакциями с нуклеофильными реагентами. Во втором случае есть возможность варьирования типа заместителя при атоме азота. Таким образом, можно получить ряд соединений, обладающих одинаковыми липофильными частями, но различными гидрофильными заместителями, такими как карбоксильные, третичные амино-, четвертичные аммониевые, бетаиновые и сульфобетаиновые группы. Исследование взаимодействия с модельными фосфолипидными мембранами производных мирцена и аллооцимена, содержащих различные полярные заместители, позволит сделать выводы о влиянии как строения липофильной части, так и природы гидрофильной группы на способность к закреплению на мембране. Сравнительное изучение амфифильных соединений, обладающих бльшими (два остатка монотерпена) и меньшими (остаток изопрена или циклопентадиена) гидрофобными фрагментами позволит установить влияние размера гидрофобной части на способность к встраиванию в мембрану. Знание вышеупомянутых свойств делает возможным дизайн новых модификаций уже известных лекарственных препаратов, способных закрепляться на поверхности плазматической мембраны, с последующим проникновением внутрь клетки.
Таким образом, целью данной работы является синтез амфифильных аддуктов монотерпенов мирцена и аллооцимена с N-замещенными малеинимидами, содержащими карбоксильные, третичные амино-, четвертичные аммониевые, бетаиновые и сульфобетаиновые группы в полярной части, а также исследование взаимодействия полученных соединений с модельными биомембранами – везикулами дипальмитоилфосфатидилхолина. Также в цели данной работы входит разработка подходов к синтезу и сравнительные исследования аддуктов вышеперечисленных имидов с компактными диенами (изопреном и циклопентадиеном).
Для достижения поставленных целей необходимо решить следующие задачи: 1) разработать подход к синтезу амфифильных производных мирцена и аллооцимена по реакции циклоприсоединения с малеиновым ангидридом и N-замещенными малеинимидами; 2) синтезировать амфифильные производные мирцена, содержащие карбоксильные, третичные амино-, четвертичные аммониевые, бетаиновые и сульфобетаиновые группы в полярной части; 3) провести исследования взаимодействия полученных соединений с модельными биомембранами; 4) синтезировать амфифильные соединения, отличающиеся от производных мирцена строением (аддукты аллооцимена) и размером (аддукты изопрена и циклопентадиена) гидрофобной части; 5) провести сравнительные исследования их взаимодействия с модельными биомембранами; 6) на основе полученных на предыдущих этапах работы данных разработать и продемонстрировать подход к введению мембрано-якорного фрагмента на основе мирцена в структуру молекул с уже известной биологической активностью на примере получения производного бис(2-хлорэтил)амина.
Реакция Дильса-Альдера между активированными диенами и диенофилами является удобным «клик»-процессом, позволяющим осуществлять ковалентную сшивку между гидрофильными и гидрофобными фрагментами молекул. В данной работе в качестве гидрофобных структур нами были выбраны монотерпены: аллооцимен 2.1 и мирцен 2.2. Если реакционная способность мирцена в циклоприсоединении по Дильсу-Альдеру описана достаточно подробно в литературных источниках [101], то в случае аллооцимена она требует дополнительных исследований. Исходя из чисто теоретических соображений, можно предположить, что аллооцимен, обладающий триеновой системой сопряженных двойных связей, может давать два продукта циклоприсоединения: с участием как 2,4, так и 4,6 диеновых систем.
Синтез аддуктов N-замещенных малеинимидов, содержащих карбоксильные и четвертичные аммониевые группы, и исследование их взаимодействия с модельными биомембранами
Из ряда изученных соединений способность встраиваться в мембрану проявили только производные мирцена, содержащие карбоксильные либо карбоксилатные группы. Соединения, содержащие четвертичную аминогруппу как с простыми алкильными заместителями (2.17, 2.18 и 2.23), так и в виде гидробромида бетаина либо сульфобетаина (2.45, 2.48, 2.51 и 2.52), такой способности не показали. В связи с этим нами было высказано предположение, что присутствие четвертичной аммониевой группы в молекуле в том или ином виде блокирует возможность монотерпенового остатка достигать липофильной части бислоя. Поэтому большой интерес представляло исследование возможности встраивания в мембрану структурных предшественников вышеупомянутых соединений – структур, включающих третичные аминогруппы. Данные соединения предполагалось получать в виде гидрохлоридов, что, с одной стороны, повышает водорастворимость, а с другой, – предотвращает окисление аминогрупп при хранении.
Синтезы амфифильных соединений, содержащих третичные аминогруппы, были проведены непосредственным взаимодействием мирцена с полученными ранее аминами 2.15 и 2.21. Кроме того, было решено расширить набор соединений аналогичными аддуктами аллооцимена 2.54 и 2.56, которые были получены в сходных условиях. Продукты 2.53 – 2.56 были выделены в виде гидрохлоридов осаждением хлороводородом из диэтилового эфира на холоду – в данных условиях сводятся к минимуму побочные реакции присоединения по двойным связям (схема 2.16). Выделение аминов в виде их солянокислых солей в данном случае преследовало несколько практических целей. Во-первых, соответствующие солям амины являются жидкостями, что усложняет процесс их очистки от примесей исходных терпенов. Очистка же гидрохлоридов в данном случае производилась перекристаллизацией из этилацетата. Во-вторых, в форме соли повышается стабильность получаемых соединений при хранении – блокируются реакции окисления по аминогруппе. В-третьих, солянокислые соли обладают хорошей растворимостью в воде, в отличие от свободных аминов, что заметно упрощает проведение исследований взаимодействия данных соединений с модельными фосфолипидными мембранами.
Исследование взаимодействия с модельными биомембранами – везикулами DPPC, показало положительный результат. Все четыре соединения, содержащие третичные аминогруппы продемонстрировали значительное снижение Тm везикул. Результаты представлены на рис. 2.15. Хорошо видно, что зависимости температуры фазового перехода от концентрации (мольного соотношения) веществ имеют линейный характер, как и для соединений 2.11 и 2.12. Но в данном случае максимальное понижение Тm существенно больше: в случае соединения 2.53 его величина превышает 3 С.
В целом амины 2.53 и 2.54, содержащие N,N-диэтильный фрагмент, показали большее понижение Тm, чем соединения 2.55 и 2.56 с N,N-диметильным остатком. То есть в данном случае более липофильные заместители в полярной части внесли больший вклад в способность к связыванию с везикулами, чем более длинный пропильный спейсер между атомами азота. Данный эксперимент позволил провести сравнительный анализ эффективности встраивания липофильных фрагментов, обладающих одинаковым объемом (С10), но различающихся строением. Структура липофильной части оказала менее значительное влияние по сравнению со строением гидрофильной, однако из приведенных графиков (рис 2.15) отчетливо видно, что эффект производных мирцена оказался существенно больше по сравнению с производными аллооцимена. Возможно, производное аллооцимена, обладая более разветвленной и соответственно обладающей меньшими линейными размерами структурой, по большей части локализуется в интерфейсной части бислоя (пространство между липофильной и гидрофильной частями, в котором локализованы остатки глицерина и сложноэфирные группы), не проникая вглубь мембраны и, тем самым, меньше нарушая упаковку ацильных цепочек. Это приводит к менее значительному понижению Tm.
Таким образом, нами были получены производные мирцена (2.53, 2.55) и аллооцимена (2.54, 2.56), содержащие третичные аминогруппы (в форме гидрохлоридов). Была показана способность полученных соединений 2.53–2.56 встраиваться в модельную фосфолипидную мембрану. Встраивание перечисленных соединений не приводило к нарушению целостности бислоя в широком диапазоне концентраций. Сравнительный анализ влияния производных мирцена (2.53, 2.55) и аллооцимена (2.54, 2.56) на свойства мембраны показал, что липофильный остаток мирцена осуществляет более прочное закрепление полярной группы на поверхности мембраны за счет лучшего взаимодействия с ее липофильной частью. Кроме того, показано, что характер третичной аминогруппы во многом определяет способность исследованных соединений к встраиванию в липидный бислой. 2.7 Синтез производных изопрена и циклопентадиена, содержащих карбоксильные и третичные аминогруппы
В свете полученных данных можно выделить два типа полярных групп - третичная амино- и карбоксильная, которые не препятствовали встраиванию производных монотерпенов мирцена и аллооцимена в модельную мембрану. При этом эффект от полярных групп оказался настолько значителен, что возникает вопрос о значимости липофильной части как таковой. Чтобы ответить на этот вопрос, важно было установить значение размера липофильного остатка и выяснить, будет ли сохраняться возможность встраивания в везикулы соединений, обладающих укороченной липофильной частью.
Изопрен, как гемитерпен, обладает высоким структурным сходством с мирценом. Его аддукты по Дильсу-Альдеру являются, по сути, гомологами по отношению к аддуктам мирцена. Помимо изопрена, в качестве диеновой структуры нами было решено использовать циклопентадиен, который также является С5 липофильным фрагментом.
Было решено синтезировать ряд соединений, содержащих третичную амино- и карбоксильную группы, так как продукты именно с такими полярными частями показали наилучшие результаты по связыванию с везикулами. Синтезы были проведены на основе полученных ранее имидов 2.10, 2.15 и 2.21. В результате с хорошими выходами были выделены соединения 2.57-2.62 (схема 2.17). Амины так же, как и в предыдущих случаях, были выделены в виде гидрохлоридов. В случае аддуктов циклопентадиена реакции проходили особенно быстро, а получаемые продукты не требовали дополнительной очистки.
Далее были осуществлены исследования взаимодействия полученных соединений с везикулами DPPC. В данном случае титрование исследуемыми веществами не проводилось, они добавлялись в заданном высоком мольном соотношении к липиду, а именно 1:1. Как показал опыт предыдущих исследований, при таком мольном соотношении в случае встраивания вещества в мембрану температура фазового перехода заметно понижается: депрессия составляет от 0.6 до 3.3С. Т. е. по результатам такого исследования можно на качественном уровне отследить взаимодействие и при его наличии провести дополнительные эксперименты с титрованием.
Синтез производных изопрена и циклопентадиена, содержащих карбоксильные и третичные аминогруппы
Рентгеноструктурный анализ выполнялся на приборе Bruker AXS Kappa APEX, Mo K излучение ( = 0.71073 ).
Температуру плавления веществ определяли на нагревательном столике «Boetius». Контроль чистоты соединений проводили по температурам кипения, плавления, показателю преломления, а также по спектрам ЯМР 1Н. Дополнительно чистоту веществ контролировали методом ТСХ на пластинках Silica 200 m, UV 254. ТСХ-пластинки проявляли облучением при = 254 нм.
Показатель преломления жидкостей определяли на рефрактометре ИРФ-454 Б2М при температуре 20 С на длине волны 589 нм.
В работе использовали следующие реагенты и растворители: 1,3-пропансультон (х.ч.), 4-диметиламинопиридин (х.ч.), N,N-диметилпропан-1,3-диамин (х.ч.), N,N-диэтилэтан-1,2-диамин (х.ч.), Tris-HCl (Sigma), аллооцимен (техн.), ацетат натрия (х.ч.), ацетон (х.ч.), ацетонитрил (х.ч.), бутанол-1 (х.ч.), вода дистиллированная, гексаметилендиамин (х.ч.), гексан (х.ч.), гидроксид натрия (х.ч.), глицерин (х.ч.), глицин (х.ч.), диметиламина гидрохлорид (х.ч.), диметилформамид (х.ч.), дипальмитоилфосфатидилхолин (Avanti Polar Lipids), дихлорметан (х.ч.), дициклогексилкарбодиимид (х.ч.), дициклопентадиен (х.ч.), изопрен (х.ч.), изопропанол (х.ч.), йодметан (х.ч.), ионообменная смола Amberlite IRA-400 (хлоридная форма), малеиновый ангидрид (х.ч.), метанол (х.ч.), мирцен (х.ч.), молекулярные сита 4 , морфолин (х.ч.), натрий металлический (х.ч.), петролейный эфир (фракция 45–70С), пиридин (х.ч.), пирролидин (х.ч.), п-толуолсульфохлорид (х.ч.), серная кислота (х.ч.), соляная кислота (х.ч.), сульфат магния (х.ч.), сульфат натрия (х.ч.), трет-бутилбромацетат (х.ч.), тетрагидрофуран (х.ч.), тионилхлорид (х.ч.), толуол (х.ч.), трифторуксусная кислота (х.ч.), триэтаноламин (х.ч.), уксусная кислота (х.ч.), уксусный ангидрид (х.ч.), хлорид натрия (х.ч.), хлороформ (х.ч.), цитраконовый ангидрид (х.ч.), этанол (х.ч.), этилацетат (х.ч.), этилендиамин (х.ч.), эфир диэтиловый (х.ч.).
Приготовление везикул дипальмитоилфосфатидилхолина. Навеску DPPC 26 мг (0.035 ммоль) растворяли в хлороформе. Полученный раствор выпаривали при пониженном давлении в токе азота. К образовавшейся пленке липида добавляли 0.5 мл буферного раствора (50 мМ Тris-HCl, 150 мМ NaCl, рН = 7.4). Смесь помещали на водяную баню (50С) и перемешивали при помощи магнитной мешалки в течение часа. Полученную таким образом грубую дисперсию липида (70 мМ) подвергали 15-кратной экструзии на приборе Avanti Mini-Extruder через поликарбонатную мембрану с порами 100 нм. Полученную дисперсию однослойных везикул использовали в течение суток либо подвергали замораживанию для более длительного хранения.
Определение температуры фазового перехода везикул DPPC. Температуру фазового перехода везикул определяли методом турбидиметрии [118] на спектрофотометре УФ 84 видимого диапазона Shimadzu UV-3600 с термостатирующей приставкой, толщина пропускающего слоя 1 см, ширина щели 1 нм. Стоковый раствор DPPC (70 гаМ) разбавляли водным буфером (50 мМ Тris-HCl, 150 мМ NaCl, рН = 7.4) до концентрации липида 0.7 мМ. 3 мл разбавленного раствора помещали в кварцевую кювету. В качестве раствора сравнения использовали водный буфер, не содержащий липида. Перед началом эксперимента кюветы термостатировали при 50.0 С, после чего 20 мин при температуре начала эксперимента (39.0 С для чистого DPPC). Оптическая плотность дисперсии везикул считывалась каждые 3 минуты на длине волны 400 нм, температура кювет увеличивалась на 0.3 С после каждого считывания. Таким образом, средняя скорость нагрева составляла 0.1 С/мин. Экспериментальные данные о зависимости оптической плотности эмульсии везикул подвергали математической обработке в программном пакете Origin 8.1 (OriginLab Corporation, Нортгемптон, США): производилась аппроксимация параметрическим уравнением (1) у(х) = а(х + 273) + Ъ л , в котором: y(x) - значения нормированной оптической плотности; х - значения температуры; a, b, c, d - аппроксимационные параметры, соответствующие уравнениям прямых до и после точки фазового перехода; Н - эффективная энтальпия фазового перехода, Т - температура фазового перехода Тт. Влияние исследуемых соединений на Тт определяли титрованием их концентрированными растворами (100 мг/мл в воде или метаноле для соединения 2.11) суспензии везикул. Необходимые количества растворов исследуемых соединений вносили при помощи микрошприца объемом 10 мкл, с ценой деления 0.1 мкл. Для оценки влияния внесения метанола вместе с соединением 2.11 было проведено холостое титрование метанолом, показавшее отсутствие влияния последнего на Тт в соответствующем эксперименту диапазоне концентраций.
Квантово-механическое моделирование. Квантово-механические расчеты проводили в программном пакете MOPAC2012 (James J. P. Stewart, Stewart Computational Chemistry, Колорадо Спрингз, США, http://openmopac.net) полуэмпирическим методом РМ7 [102]. За основу для построения конформационных диаграмм аллооцимена бралась Z-матрица с оптимизированной геометрией молекулы, в которой задавалось фиксированное значение необходимого двугранного угла, после чего производилась оптимизация остальных геометрических параметров молекулы. Угол изменялся с шагом 1 в диапазоне 0-360. Для построения диаграмм использовалась полная энергия получаемых после оптимизации конформеров.
Моделирование спиновых систем производили в программном пакете MestRe-C 2.3 (Mestrelab Research, Сантьяго де Компостела, Испания). В ходе моделирования производили подбор значений химических сдвигов и значений констант спин-спинового взаимодействия, которые бы наилучшим образом описывали реальные спиновые системы. В моделировании использовали рабочую частоту 400 МГц, соответствующую реальным спектрам. 4,5-Диметил-7-(2-метилпроп-1-ен-1-ил)-3a,4,7,7a-тетрагидроизобензофуран-1,3-дион (2.5). 4.9 г (50 ммоль) малеинового ангидрида было растворено в 50 мл безводного ТГФ и к раствору было добавлено 10.2 г (60 ммоль) технического аллооцимена (80%). Реакционная смесь при этом самопроизвольно разогревалась и приобретала желто-оранжевый цвет. Окраска постепенно обесцвечивалась и через несколько часов становилась светло-желтой. Реакционная смесь была оставлена на ночь при комнатной температуре, после чего растворитель был упарен в вакууме. Остаток был разбавлен петролейным эфиром (100 мл), и образовавшийся осадок был отфильтрован, промыт петролейным эфиром и перекристаллизован из этанола. Выход чистого продукта составил 10.4 г (88%) с т.пл. 83-84С. Спектр ЯМР Н (CDC13, , м.д., J/Гц): 1.48 (д, ЗН, 3JНН = 7.4, СН-СНз), 1.68 (д, 3Н, 4JHH = 1.0, =С-СН3), 1.76 (д, 3Н, 4JHH = 1.2, =С-СН3), 1.80 (с, 3Н, =С-СН3), 2.56 (м, Ш, СН-СНз), 3.15 (м, Ш, =С-СН-), 3.29 (дд, 2Н, 3JНН = 2.2, 4.0, С(О)-СН), 5.50-5.56 (м, 2Н, =СН). ИК-спектр (V/cм"1): 1772.8, 1850.8 (С=0, С=С). Элементный анализ: вычислено: C 71.79%; H 7.69%. Cі4Ні803. Найдено: С 71.81%; Н 7.89%. Рентгеноструктурный анализ: моноклинные кристаллы; параметры элементарной ячейки (20С): а = 13.8339(17), Ъ = 5.9102(7), с = 15.839(2) ; = 95.131(1); V = 1289.8(3) 3; Z = 4; dрасч = 1.206 г/см3; пространственная группа Р2\1щ Мо = 0.84 см– ; были измерены интенсивности 3062 независимых отражений, из которых 2352 удовлетворяли условию / 2(7); итоговые результаты факторов достоверности: R = 0.0434, Rw = 0.1221.