Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 11
1.1 Мультигетероциклы, образованные производным нуклеотидного основания или пиримидина с 4-6-членными гетероциклами 11
1.2 Мультигетероциклы, образованные нуклеотидными основаниями и их производными 16
2 Обсуждение результатов 28
2.1 Постановка задачи. N-моно- и 1,3-бис(бромалкил)урацилы - исходные соединения для синтеза мультигетероциклов 28
2.2 Введение гетероциклических фрагментов в состав N-алкилзамещенных урацилов реакциями замещения
2.2.1 Взаимодействие N-(-бромалкил)урацилов с меркаптозамещенными гетероциклами 34
2.2.2 Взаимодействие N-(-бромалкил)урацилов с меркаптозамещенными гетероциклами, несущими пиррольный атом азота 40
2.2.2.1 Окисление и алкилирование
1,3-бис[5-(бензимидазол-2-илсульфонил)пентил]урацилов 50
2.2.3 Взаимодействие N-(-бромалкил)урацилов с гетероциклами, несущими пиридиновый и пиррольный атомы азота 56
2.3 Введение гетероциклических фрагментов в N-алкилзамещенные урацилы конденсационными методами 62
2.3.1 Синтез N-(азидоалкил)- и N-(этоксикарбонилоксоалкил)урацилов 63
2.3.2 Введение пиразольных и пиримидиновых фрагментов в состав N-алкилзамещенных урацилов 65
2.3.3 Синтез N-[-(4-замещенный-1,2,3-триазол-1-ил)алкил]урацилов 69
2.4 Кватернизация пиридиновых атомов азота гетероциклических фрагментов мультигетероциклов 75
2.5 Биологическая активность мультигетероциклов
2.5.1 Антимикробная активность мультигетероциклов 82
2.5.2 Токсичность и холинотропные свойства мультигетероциклов 90
Выводы 94 3 Экспериментальная часть 96 Список использованной литературы 156
Приложение 175
- Мультигетероциклы, образованные производным нуклеотидного основания или пиримидина с 4-6-членными гетероциклами
- Мультигетероциклы, образованные нуклеотидными основаниями и их производными
- Введение гетероциклических фрагментов в состав N-алкилзамещенных урацилов реакциями замещения
- Введение гетероциклических фрагментов в N-алкилзамещенные урацилы конденсационными методами
Введение к работе
Актуальность работы. Соединения пиримидинового и пуринового ряда, являющиеся строительными блоками нуклеиновых кислот, занимают особое место в биохимии живого. Помимо того, что они участвуют в хранении и передаче наследственной информации, они входят в состав важнейших коферментов - КоА, HАД, ФАД, ФМН, тиаминдифосфата, производных фолиевой кислоты, нуклеозидов и нуклеотидов. Как следствие, нуклеотидные основания, и в частности, пиримидиновые нуклеотидные основания – цитозин, урацил, тимин, а также другие 6(5)-замещенные урацилы обладают разноплановой высокой биологической активностью, и препараты на их основе применяются в практической медицине в качестве противоспалительных (метилурацил), антивирусных (зидовудин, дидезоксицитидин), антимикробных (хлоридин, триметоприм), гипотензивных (урапидил, миноксидил), противораковых (фторурацил, фторафур, цитарабин, допан) и других средств.
Объединение урацила или его производного с одним и более ароматическими 5-, 6-членными гетероциклическими фрагментами в мультигетероциклические соединения открытоцепного или макроциклического строения позволит варьировать количество и взаимное пространственное расположение центров связывания с сайтами биомишеней, то есть группировок, способных к образованию водородных связей, как в качестве акцепторов, так и в качестве доноров протонов (гетероатомы с НЭП, имидные-, амино-, гидроксигруппы) и способных к аттрактивным --взаимодействиям (различные ароматические системы). Кроме того, урациловый или 6(5)-замещенный урациловый цикл в составе мультигетероциклических соединений может выступать в роли неспецифического фармакофора, усиливающего эффект связывания с биомишенью специфических фармакофоров – ароматических 5- и 6-членных гетероциклов. Таким образом, синтез мультигетероциклических соединений, содержащих урациловый или замещенный урациловый фрагмент, представляется перспективным путем создания нового класса высокоэффективных биологически активных соединений.
Несмотря на перспективы практической значимости мультигетероциклических соединений в настоящее время отсутствуют общие методы синтеза гетероциклических систем такого рода. Подход к синтезу каждого гетероциклофана или мультигетероцикла открытоцепного строения не распостраняется на соединения, содержащие другие гетероциклические фрагменты. В связи с этим диссертационная работа, посвященная синтезу и изучению химических и биологических свойств мультигетероциклов на основе 1,3-бис(-алкил)урацилов, в терминальное положение алкильных цепочек которых введены различные 5- и 6-членные гетероциклы, является актуальной.
В данной диссертационной работе предлагается использовать моно- и 1,3-бис(-алкил)-6(5)-замещенные 2,4-диоксопиримидины (урацилы) в качестве основы,
«фундамента», исходя из которых предполагается дальнейшее «наращивание скелета» - присоединение через алкильные цепочки при атомах азота урацилового цикла 5,6-членных гетероциклов. Моно- и 1,3-бис(-алкил)-6(5)-замещенные урациловые фрагменты рассматриваются, с одной стороны, как удобная синтетическая платформа для дальнейшего введения в состав полиметиленовых цепочек гетероциклических фрагментов и, с другой стороны, урациловый фрагмент как производное нуклеотидного основания может придать мультигетероциклическому соединению совершенно новые свойства, и, в частности, биологическую активность за счет дополнительных возможностей для связывания с различными субстратами, в том числе с биомишенями.
Цель работы - разработка методов синтеза ранее неизвестных мультигетероциклических соединений открытоцепного и макроциклического строения на основе 1(3)-моно- и 1,3-бис(алкил)-6(5)-замещенных урацилов и изучение химических и биологических свойств полученных соединений.
Научная новизна работы. Впервые на основе единых исходных реагентов – 1-
(-бромалкил)-3,6-диметилурацилов и 1,3-бис(-бромалкил)-6(5)-замещенных
урацилов предложены способы синтеза мультигетероциклических соединений
открытоцепного строения и макроциклического строения – гетероциклофанов,
содержащих один или два 6(5)-замещенных урациловых цикла и различное число 5-,
6-членных гетероциклических фрагментов (2-меркаптобензоксазоловых, 2-
меркаптобензтиазоловых, 2-меркаптобензимидазоловых, 2-меркаптоимидазоловых, 2-
меркапто-1,3,4-тиадиазоловых, 2-меркапто-5-амино-1,3,4-тиадиазоловых, 2,5-
димеркапто-1,3,4-тиадиазоловых, 3-меркапто-1,2,4-триазоловых, 5-метил-3-
пиразолоновых, 1,2,4-триазоловых, 1,2,3-бензтриазоловых, 1,2,3-триазоловых, 6-
метил-2-тиоурациловых);
- Впервые предложены способы химической модификации
мультигетероциклических соединений на основе 1,3-бис(-алкил)-6(5)-замещенных
урацилов;
- Впервые выделены индивидуальные геометрические изомеры
гетероциклофанов с анти- и син-расположением связи С-S 2-тиобензимидазолового
фрагмента и карбонильной группы при 6-метилурациловом цикле;
- Впервые установлено, что мультигетероциклические соединения на основе
1,3-бис(-алкил)урацилов, содержащие 1,2,4- и 1,2,3-триазолиевые фрагменты,
обладают высокой антимикробной активностью, и в механизм их антимикробного
действия специфический вклад вносят количество метиленовых групп в
полиметиленовых цепочках и природа заместителей при триазоловых циклах.
Практическая значимость работы заключается в разработке простых и универсальных методик синтеза мультигетероциклических соединений открытоцепного и макроциклического строения, содержащих в своем составе моно- и 1,3-бис(алкил)-6(5)-замещенный урациловый и различное число 5-, 6-членных
гетероциклических фрагментов. В результате проведенных исследований получено 89 новых мультигетероциклов, в том числе 13 макроциклических соединений;
Среди синтезированных мультигетероциклов открытоцепного строения найдены соединения, обладающие высокой антимикробной и холинотропной активностью. Некоторые мультигетероциклы открытоцепного строения проявляют высокую селективность в ингибировании роста золотистых стафилококков и дрожжевого грибка.
На защиту выносятся следующие положения:
Методы синтеза гетероциклофанов и мультигетероциклов открытоцепного строения, содержащих 1-моно-(ю-алкил)-3,6-диметилурациловый или 1,3-бис(со-алкил)-6(5)-замещенный урациловый и различное число 5-, 6-членных гетероциклических фрагментов, исходя из 1-(-бромалкил)-3,6-диметилурацилов и 1,3-бис(ю-бромалкил)-6(5)-замещенных урацилов;
Способы модификации мультигетероциклических соединений на основе 1,3-бис(-алкил)-6(5)-замещенных урацилов посредством окисления атома серы при гетероциклических фрагментах, алкилированием кольцевых атомов азота в составе азоловых гетероциклов;
Проявление высокой бактериостатической, фунгистатической, бактерицидной, фунгицидной активности мультигетероциклов, несущих триазолиевые фрагменты, зависимость антимикробной активности от структурных характеристик соединений.
Личный вклад автора. Экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, получены автором лично и при его непосредственном участии. Автор выражает благодарность и признательность своему научному руководителю д.х.н., доценту В.Э. Семенову за чуткое руководство и всестороннюю поддержку; д.х.н., профессору, г.н.с. лаборатории Химии Нуклеотидных Оснований (ХНО) ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН. В.С. Резнику, принимавшему активное участие при выполнении и обсуждении данной диссертационной работы; д.х.н., зав. лаборатории Радиоспектроскопии ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН Ш.К. Латыпову; д.б.н., профессору, зав. лаборатории Химико-Биологических Исследований В.В. Зобову, сотрудникам лаборатории Химико-Биологических Исследований к.б.н., м.н.с. А.Д. Волошиной, м.н.с. Н.В. Кулик, к.б.н., с.н.с. К.А. Петрову, к.б.н., м.н.с. А.Д. Харламовой, м.н.с. О.А. Миннехановой, м.н.с. И.В. Зуевой за исследование биологической активности мультигетероциклов. Автор благодарит всех сотрудников лаборатории ХНО ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН за помощь и активное участие при обсуждении работы.
Степень достоверности результатов. Достоверность результатов
проведённых исследований подтверждается использованием ряда современных физических и физико-химических методов: масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР 1Н, 13С, оптической спектроскопии, ИК-спектроскопии и элементного анализа.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всероссийской научной конференции (Новосибирск, 2010), Всероссийских научных конференциях с международным участием «Успехи синтеза и комплексообразования» (Москва, 2012, 2014), XV конференции «Heterocycles in BioorganicChemistry» (Рига, 2013), Международной междисциплинарной научной конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, 2013), итоговой научной конференции ИОФХ им. А.Е. Арбузова (Казань, 2015).
Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 11 научных публикациях, в том числе 6 статьях в изданиях, рекомендованных для размещения материалов диссертаций, и 5 тезисах докладов.
Работа выполнена в лаборатории Химии нуклеотидных оснований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук, является частью исследований в соответствии с научным направлением Института по государственным бюджетным темам «Функционализация клешневидных и макроциклических соединений, содержащих N-гетероароматические и карбоциклические фрагменты, с целью придания им практически полезных свойств: растворимости, избирательного связывания, электропроводности, способности реагировать на внешние физико-химические воздействия» (№ госрегистрации 0120.0503489); «Синтез и изучение гетероциклических, гетеромакроциклических и клешневидных соединений, содержащих в своей структуре (арил)гетероарил-(гетероарил)арильные и дитерпеноидные фрагменты, способные взаимодействовать с периферическими участками биомишеней вне их активного центра. Молекулярно-фармакологический анализ связи «химическая структура – биологическая активность» с целью отбора перспективных препаратов, действующих на патогенез заболеваний» (№ госрегистрации 01201455262). Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 13-03-00709-а, программой ОХНМ РАН «Биомолекулярная и медицинская химия», программой Президиума РАН «Разработка методов получения химических веществ и создание новых материалов».
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 187 страницах машинописного текста, включает 45 рисунков, 45 схем, 3 таблицы и состоит из введения, двух основных глав, выводов, экспериментальной части, списка литературы, включающего 178 ссылок на отечественные и зарубежные работы, и приложения. В первой главе приведён литературный обзор, в котором рассмотрены взаимодействия производных нуклеотидных оснований с 5- и 6-членными гетероциклами. Во второй главе представлены результаты собственных исследований реакций и биологической активности. Третья глава содержит экспериментальные данные проведённых исследований. В приложении приведен список новых
Мультигетероциклы, образованные производным нуклеотидного основания или пиримидина с 4-6-членными гетероциклами
Мультигетероциклические соединения макроциклического и открытоцепного строения представляют интерес, как отмечалось выше, в связи с замечательными комплексообразующими свойствами, разноплановой биологической активностью, способностью к самоассоциации, структурными особенностями. Наличие в таких соединениях множественных центров связывания – группировок, способных к образованию водородных связей как в качестве акцепторов, так и в качестве доноров (гетероатомы с НЭП, имидные группы, амино-, гидрокси-группы), ароматической системы (--контакты), возможность варьирования их числа и взаимного пространственного расположения позволяет решать различные задачи, в частности, создание наноконтейнеров для проведения химических реакций, создание селективных комплексообразователей ионов металла и нейтральных молекул, лигандов, афинных к определенной биомишени. На рисунке 2.1 представлены некоторые примеры мультигетероциклических структур открытоцепной и макроциклической топологии, взятые из научной литературы, и обладающие такими свойствами.
В частности, соединения 2.1, содержащие карбазольный и пиперидиновый фрагменты, способны эффективно и селективно переносить нуклеотиды через липофильную мембрану [51], структура 2.2 - мультигетероциклофан, содержащий два порфириновых фрагмента, соединенные пиперазиновым мостиком, обладает высокой противораковой активностью [52], пиридинофан 2.3 может использоваться в лечении нейродегенеративных заболеваний [53]. Структура 2.4 демонстрирует возможности мультигетероциклофанов, в частности модифицированных порфиринов, в нековалентном связывании [54], открытоцепные и макроциклические мультипиридины 2.5 и 2.6 позволяют установить особенности взаимного расположения пиридиновых колец [55].
Биологические свойства мультигетероциклических соединений, с одной стороны, обусловлены разноплановой физиологической активностью составляющих их «мономерных» гетероциклических фрагментов, которые нашли применение в качестве лекарственных препаратов. Так, производные имидазола и бензимидазола нашли применение при лечении болезней, вызываемых бактериальными (метронидазол, тинидазол), грибковыми (клотримазол) инфекциями, аллергических состояний (циметидин, астенизол), язвенной болезни желудка и кишечника (омепразол, пантокразол), онкологических заболеваний (дакорбазин), гипертензии (клофелин, лозартан) [56]. Пиразолоны нашли применение в качестве анальгетиков (антипирин, аминопирин), триазолы - в качестве антибактериальных средств (цефалоспорины), противогрибковых препаратов (флуконазол), снотворных средств (бротизолам, триазолам), оксазины, и в частности оксазолидиноны – в качестве антибактериальных средств (линезолид), мышечных релаксантов (миолгин) [56]. Кроме того, имеется обширная научная литература по медицинской химии, посвященная изучению различных видов биологической активности гетероциклов. Так, сообщалось об антимикробной [57-60], антибактериальной [61, 62] активностях производных 1Н-1,2,4-триазола, их противовоспалительных [63], противогрибковых свойствах [64, 65]. Производные 3-меркапто-1Н-1,2,4-триазола проявляют антимикробную [58, 60, ,66, 67], антибактериальную активность [68, 69], обладают противовоспалительными [70] и противоопухолевыми свойствами [71]. Производные 1Н-1,2,3-триазола являются ингибиторами ферментов [72-74], активаторами калиевых каналов [75, 76], обладают антивирусной [77, 78], антимикробной [79], антиопухолевой [80, 81], антитуберкулезной [82], антигрибковой [83, 84], антиВИЧ активностями [85], противопаразитными свойствами [86]. Производные имидазола (2.30) обладают антибактериальной [87], антимикробной [88-90], антидиабетической [91], противоопухолевой [92-96], антигельминтной [97, 98], антигипертензивной [99], противоспалительной активностями [100]. Обнаружено, что эти соединения могут выступать в роли ингибиторов ферментов, в частности протеинкиназ [101], Na+/H+ обмена [102]. Производные 1,3,4-тиадиазола (2.23, 2.25, 2.26) обладают психотропной [103], антибактериальной активностями [104], проявляют активность по отношению к Helicobacter pylori [105]. Производные оксазола (2.24а) обладают антитуберкулезной [106], антибактериальной [107], антигипергликемической [108], противоопухолевой активностями [109], а также являются агонистами серотониновых рецепторов [110, 111]. Таким образом, приведенные некоторые примеры разноплановой биологической активности гетероциклов и их производных позволяют, на наш взгляд, предположить, что объединение гетероциклических фрагментов в мультигетероциклическое соединение циклического или макроциклического строения с другой стороны сохранит имеющиеся биологические свойства «мономерных» гетероциклов, и может усилить их или придать им новое направление.
Несмотря на практическую значимость мультигетероциклов в настоящее время отсутствуют общие методы синтеза мультигетероциклических соединений. Подход к синтезу каждого гетероциклофана или открытоцепного мультигетероцикла, в том числе соединений, приведенных на рисунке 2.1, индивидуален и не распостраняется на соединения, содержащие другие гетероциклические фрагменты.
Как общий метод синтеза мультигетероциклических соединений мы предлагаем введение различных 5- и 6-членных гетероциклических фрагментов в состав полиметиленовых цепочек при атомах N1 и N3 6(5)-замещенных урацилов. Таким образом, цель диссертационной работы - разработка методов синтеза мультигетероциклических соединений открытоцепного и макроциклического строения на основе 1(3)-моно(алкил)- и 1,3-бис(алкил)-6(5)-замещенных урацилов, и изучение химических и биологических свойств полученных соединений.
Речь идет о конструировании мультигетероциклов открытоцепного и макроциклического строения, содержащих различное число гетероциклов, связанных угледоводородными мостиками с урациловым фрагментом. Целевые соединения в схематичном виде представлены на рисунке 2.2. Структуры 2.8 и 2.9 представляют собой собственно гетероциклофаны, структуры 2.10, 2.11 - их открытоцепные аналоги с топологией клешни, в основе структуры 2.7 – 1-моно(алкил)-6(5)-замещенный урацил. В качестве 5- и 6-членных гетероциклов, соединенных
Мультигетероциклы, образованные нуклеотидными основаниями и их производными
Цикл работ посвящен синтезу и изучению мультигетероциклов, в которых нуклеотидное пуриновое или пиримидиновое основание связано триметиленовой цепочкой с производным хинолина или акридина [5-9]. На рисунке 1.1 представлены примеры таких соединений. Интерес представляло взаимодействие мультигетероциклов 1.14 – 1.17 с ДНК в качестве интеркаляторов. Цель этих работ – определение возможности использования мультигетероциклов при химиотерапии, как средств, ингибирующих репликацию ДНК в раковых и бактериальных клетках. Синтез таких мультигетероциклов осуществляли, исходя из 6-хлоро-2-метокси-9-[3-(бромопропил)амино]акридина (1.20), вводя его в реакцию с аденином и тимином в присутствии основания [6], или взаимодействием 1-(3-аминопропил)тимина (1.19) или 9-(3-аминопропил)аденина (1.18) с 4,7-дихлорхинолином [6, 8]. Выходы мультигетероциклов 1.14 -1.17 составляли 42-89%. NH2
Реакции 2-меркапто-4-хлор-6-метилпиримидина (1.21) с 2-хлорметилбензокса-, тиа-, имидазолами (1.22) в присутствии основания – ТЭА приводят к бигетероциклам 1.23, которые далее, реагируя с 2-меркаптобензокса-, тиа-, имидазолами, 2-аминобензтиа-, имидазолами (1.24) или бензокса-, тиа-2-метилтиолами (1.26) в присутствии метилсерной кислоты дают тригетероциклы 1.27 [10]. Мультигетероциклы 1.23, 1.25, 1.27 исследовались на биологическую активность, и было обнаружено, что они обладают цитотоксичностью по отношению к раковым клеткам линии А549, и эффективно ингибируют рост золотистых стафилококков и грибов P. Chrysogenum. Отмечалось, что тригетероциклы значительно активнее бигетероциклов. Эта работа, на наш взгляд, демонстрирует потенциал мультигетероциклов как билогически активных веществ. ci
Высокую активность по отношению к раковым клеткам проявляют мультигетероциклы 1.30, 1.31, содержащие в своем составе один или два азетидиновых цикла, соединенных алкильной цепочкой с тиминовым фрагментом. Эти мультигетероциклы получали взаимодействием натриевых производных тимина с одним или двумя эквивалентами цис-1-(3-бромопропил)-4-(замещенный фенил)-3-алкоксиазетидин-2-она (1.29) (схема 1.6) [11].В данном случае также отмечается большая активность тригетероциклов 1.31 по сравнению с бигетероциклами 1.30.
Синтез мультигетероциклов, содержащих тиминовый и азетидиновый фрагменты [11] В работе [12] предложен метод синтеза ряда мультигетероциклов 1.33, вводя 1,3-бис(алленил)урацил (1.32) в пятикомпонентные каскадные реакции, катализируемые соединением палладия и трис-2-(фурил)фосфином. Этот метод позволяет варьировать гетероциклические фрагменты в составе мультигетероциклов в достаточно широких пределах. На схеме 1.7 приведены некоторые гетероциклические фрагменты, используемые в этой работе. Производное урацила 1.32 получают реакцией 1,3-бис(пропаргил)урацила с параформом в присутствии дициклогексиламина и йодида меди(I). На наш взгляд этот метод не совсем удобен, поскольку требует достаточно дорогих и труднодоступных реагентов.
Таким образом, в научной литературе описан синтез достаточно большого количества мультигетероциклов, представляющих собой производные пиримидина, связанное алкильными цепочками с 4-6-членными гетероциклами. Тем не менее, сообщения, посвященные получению таких мультигетероциклов, носят разрозненный, несистематический характер, и в настоящее время практически отсутствуют универсальные методы синтеза мультигетероциклов, несущих в своем составе различные гетероциклические фрагменты на основе исходных соединений одного типа.
В отличие от мультигетероциклов, описанных в предыдущем параграфе, мультигетероциклы, образованные нуклеотидными основаниями и их производными, описаны более обстоятельно, и для них существуют общие методы получения. Такие соединения, содержащие нуклеотидные основания, представляют интерес как модельные объекты для изучения внутри– и межмолекулярных взаимодействий между производными пиримидинов или пуринов, являющихся составляющими элементами нуклеиновых кислот. Для изучения различными физико-химическими методами (УФ-, ЯМР-спектроскопией) было получено большое количество соединений, состоящих из двух нуклеотидных оснований, соединенных между собой каким-либо мостиком, в большинстве случаев полиметиленовым. В качестве нуклеотидных оснований и их производных выступают соответствующие замещенные пиримидины и пурины.
Применительно к производным 1,2,3,4–тетрагидро–2,4–диоксопиримидина, (урацила), подавляющее большинство синтезированных к настоящему времени мультигетероциклических соединений представляют собой два урациловых фрагмента, связанных углеводородной (полиметиленовой, ксилиленовой) цепочкой. Связь между урациловыми фрагментами может осуществляться либо через атомы азота, либо через атомы С5 пиримидиновых колец – соединения 1.34, 1.35, соответственно (рисунок 1.3).
Выбор стратегии синтеза структуры 1.34 зависит от природы радикала R1. Для соединений формулы 1.34 с R1=H основной способ синтеза - взаимодействие соответствующего “сшивающего” реагента (,-дибромалкана, дибромксилилена) с 2,4-бистриметилсилильными производными урацилов, полученных реакцией свободных оснований либо с триметилхлорсиланом в присутствии акцептора протонов, например, триэтиламина, либо с гексаметилдисилазаном. Целевые продукты 1.34 синтезируются в три стадии: первая - получение 2,4-бистриметилсилильных производных урацилов 1.37а,б взаимодействием урацила или тимина (1.36а,б) с триметилхлорсиланом в присутствии триэтиламина, вторая - получение 1 -(-бромалкил-N-)урацилов (1.38а,б) реакцией соединений 1.37а,б с ,-дибромалканами и, наконец, взаимодействие бромида 1.38а,б с урацилами 1.36а,б в присутствии К2СО3 в ДМФА, либо с 1.37а,б (схема 1.8).
Этот синтетический подход был применён для получения серии а,со-бис(5- или 6-алкил- или 5,6-диалкилурацилил-N-)пропанов и пентанов [13-16]. Кроме того, в соединяющую урациловые фрагменты цепочку вводились функциональные группы -карбонильная [17], гидроксильная [18] путём замены ,-дибромалканов на дихлорацетон и эпихлоргидрингликоль, соответственно. В последнем случае, в качестве исходного пиримидина использовался 4-этоксипиримидин-2-он, этокси-группу затем гидролизовали в кислой среде. Полученные бис(урацилил-N-)алканы далее исследовались в качестве соединений, моделирующих взаимодействия фрагментов нуклеиновых кислот, в терминах гипер- и гипохромного эффектов, и превращений, инициируемых УФ - светом [13, 16, 19-22].
Реакциями 2,4-бистриметилсилильных производных урацилов 1.37а,б с мета-дибромксилиленами и хлоруксусным эфиром этиленгликоля c выходами 60-90% получены мультигетероциклы с функциональными группами и гетероатомами (рисунок 1.4) в соединительных мостиках 139, 1.40 [23, 24]. Мультигетероциклы 1.39 далее в присутствии K2CO3 и каталитического количества гидросульфата тетрабутиламмония
Введение гетероциклических фрагментов в состав N-алкилзамещенных урацилов реакциями замещения
Данный раздел посвящен конденсационным методам введения гетероциклических фрагментов в состав алкильных цепочек 1,3-(алкил)-6(5)-замещенных урацилов. Прямой синтез гетероциклов из составляющих их компонентов находит активное применение в построении гетероциклических структур – он позволяет варьировать в широких пределах строение цикла и природу заместителей при цикле, и с его помощью получены соединения, которые невозможно синтезировать другими методами [148, 149]. В частности, хорошо известны методы построения пиразольного кольца конденсацией -кетоэфиров с гидразином [140, 141], 2,4-диоксопиримидинового цикла – конденсацией -кетоэфиров с мочевинами [150-152], 1,2,3-триазолов – 1,3-циклоприсоединением азидов к терминальным ацетиленам [153-155]. Эти конденсационные методики представляются нам привлекательными для введения в состав алкильных цепочек 1,3-(алкил)-6(5)-замещенных урацилов вышеупомянутых гетероциклических фрагментов. Соответственно, нами поставлена задача замены терминальных атомов Br в 1,3-(,-бромалкил)-6(5)-замещенных урацилах на -кетоэфирные, в частности, 1-оксо-1-этокси-3-оксобутановые фрагменты и азидные группы. Следующая стадия – взаимодействие полученных -кетоэфиров и азидов с циклизующими реагентами - мочевинами, гидразином и ацетиленами на основе известных методик.
Необходимые для проведения реакций 1,3-циклоприсоединения 1,3-(,-азидоалкил)-6(5)-замещенные урацилы синтезированы с практически количественными выходами взаимодействием дибромидов 2.13а-г, е с азидом натрия в ДМФА (схема 2.15) [156]. Полученные соединения легко идентифицируются на основании спектров ЯМР 1Н по сильнопольному сдвигу сигналов протонов терминальных метиленовых групп на 0.1-0.2 м.д. в сравнении с их положением в спектрах ЯМР 1Н в 1,3-бис(,-бромоалкил)-6(5)-замещенных урацилов, и ИК-спектров - появлении интенсивной полосы в области 2100 см-1, соответствующей валентным колебаниям N3-группы.
В отличие от азидо-групп -кетоэфирные фрагменты вводятся в алкильные цепочки 1-(алкил)-3,6-диметилурацилов и 1,3-(алкил)-6(5)-замещенных урацилов не так однозначно [157]. В результате реакции АУЭ (2.68) с бромидами 2.12а,б и дибромидами 2.13в,г в кипящем диоксане в присутствии NaOEt образуются 3-кетоэфиры 2.69а,б, 2.70а,б с выходами 63%, 41%, 61% и 51%, соответственно. Остальными продуктами реакции являются, по-видимому, продукты кетонного разложения и продукты замены атомов брома на енольную форму АУЭ. Так, в результате реакции АУЭ с дибромидом 2.13в нами выделены соединения, которым на основании данных физико-химических методов приписаны формулы соединений 2.71, 2.72 (схемы 2.16, 2.17).
Использование в качестве растворителя диоксана и в качестве основания NaOEt представляется оптимальным, поскольку (1) введение в реакцию с дибромидом 2.13в натриевой соли АУЭ в диоксане привело к гамме трудно разделимых продуктов, и (2) в других растворителях наблюдается снижение выходов 3-кетоэфиров 2.70а,б. Так, проведение реакций дибромида 2.13в с АУЭ в этиловом спирте и трет-бутиловом спирте -соединение 2.70а c выходами 23% и 37%, соответственно.
Бискетоэфиры 2.70а,б четко идентифицируются на основании ИК- и ЯМР 1Н-спектров. В их ИК-спектрах наблюдаются интенсивные полосы поглощения в районе 1740 см-1 и 1240 см-1, характеристичные для валентных колебаний связей С=О и С-О алифатических сложных эфиров, соответственно.
Кетоэфиры 2.69а,б и бискетоэфиры 2.70а,б по данным ИК- и спектроскопии ЯМР 1Н в растворах неполярных растворителей находятся в кетонной форме, по-видимому практически нацело [157]. В ИК- и спектрах ЯМР 1Н соединений 2.70а,б отсутствуют признаки енольных форм (размытое основание линий v(СН) в интервале 2400-3100 см-1, что характерно для v(ОН) енольных структур [158] и проявление при 16.0-17.0 м.д. слабоинтенсивного резонансного сигнала протона, относящегося к группе ОН енольной формы, связанной сильной внутримолекулярной водородной связью[157]).
Полученные соединения, несущие -кетоэфирные и азидные группы, мы вводили в реакции конденсации с циклообразующими реагентами – тиомочевиной [159] и гидразином, используя хорошо известные в химии гетероциклических соединений методики [140, 150-152].
-Кетоэфиры 2.69б, 2.70а реагируют с тиомочевиной (2.73) в абсолютном спирте в присутствии NaOEt с образованием мультиурацилов – диурацила 2.74 и триурацила 2.75 с выходами 42 и 9%, соответственно (схемы 2.18 и 2.19). Выходы мультигетероциклов 2.74, 2.75 невелики, что по-видимому связано с протеканием побочных реакций. Использование в качестве растворителя абсолютного этилового спирта является принципиальным моментом. При проведении реакций -кетоэфиров 2.69б, 2.70а с тиомочевиной в неабсолютном спирте практически количественно образуются продукты кетонного расщепления терминальных -кетоэфирных группировок. Масс-спектры и спектры ЯМР 1Н мультиурацилов 2.74, 2.75 однозначно подтверждают их строение – образование 2-тио-6-метилурациловых циклов в результате конденсации -кетоэфирных фрагментов с тиомочевиной. На рисунках 2.22 А,Б представлены масс-спектр MALDIOF и спектр ЯМР 1Н триурацила 2.75. В масс-спектре присутствуют сигналы с m/z 547.1, 569.2 и 585.1, соответствующие предложенной структуре (рассчитано для C25H34N6O4S2: 547.2 [M+H]+, 569.2 [M+Na]+, 585.2 [M+K]), а в спектре ЯМР 1Н – сигналы соответствующих протонов, а именно при кольцевых атомах N 2-тио-6-метилурациловых фрагментов и в составе метильных групп при С6 урациловых циклов.
Введение гетероциклических фрагментов в N-алкилзамещенные урацилы конденсационными методами
Спектры ЯМР 1Н записаны на спектрометре MSL-400 с рабочей частотой для ядер 1Н 400.13 МГц, для ядер 13C - 100.6 МГц и Avance-600 с рабочей частотой для ядер 1Н 600.00 МГц, для ядер 13C - 150.86 МГц. Внутренний стандарт - Me4Si или остаточный сигнал CDCl3 (H 7.26 м.д.). ИК-спектры полученных соединений записаны на Фурье-спектрометре "Vector 22" (Bruker) при стандартных условиях в диапазоне 4000-400 cm-1 при разрешении 1 см-1. Твердые образцы готовили в виде таблеток KBr. УФ-спектры регистрировались на спектрофотометре "Specord UV-Vis" (Karl Zeiss Jena). Экспериментальные значения дипольных моментов определяли из разбавленных растворов в бензоле при 20C по второму методу Дебая [64, 65]. Масс-спектры электронного удара получены на масс-спектрометре MAT-212 фирмы "Finnigan" при разрешении 1000, с использованием системы обработки информации MSS MASPEC II32. Условия съемки: прямой ввод образца, температура испарителя изменялась от 20 oC до 300 oC, энергия ионизирующих электронов 70 эВ, ток эмиссии электронов 1.0 мА. Масс-спектры матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАLDIOF) получены на масс-спектрометре UltraFlex III фирмы Bruker. Лазер Nd: YAG, = 355 нм. Использовалась металлическая мишень. В качестве матриц применяли 2,5-дигидроксибензойную кислоту (DHB) и пара-нитроанилин (p-NA). Температуры плавления измерены в стеклянных капиллярах на приборе Stuart SMP 10 и не корректировались. Хроматографирование в тонком слое проводили на пластинах "Silufol-254". Пластины проявляли в УФ-свете. Колоночную хроматографию проводили, используя в качестве адсорбента SiO2 (0.06-0.2мм). Элементный анализ соединений был выполнен на высокотемпературном 2х-реакторном C, H, N-анализаторе фирмы Euro Vector марки EA 3000. Рентгеноструктурный анализ кристаллов выполнен на автоматическом 4-кружном дифрактометре Enraf-Nonius CAD-4.
Все используемые растворители и реагенты абсолютировались: 1 -(4-Бромбутил)-3,6-диметилурацил (2.12а), 1 -(6-бромгексил)-3,6-диметилурацил (2.12б), 1-(7-бромбутил)-3,6-диметилурацил (2.12в), 1,3-бис(3-бромпропил)-6-метилурацил (2.13а), 1,3-бис(4-бромбутил)-6-метилурацил (2.13б), 1,3-бис(5-бромпентил)-6-метилурацил (2.13в), 1,3-бис(6-бромгексил)-6-метилурацил (2.13г), 1,3-бис(10-бромдецил)-6-метилурацил (2.13д) и 1,3-бис(5-бромпентил)-5-бромурацил (2.13е) синтезировали по известным методикам [124-127, 128, 129]. Также по известной методике получали натриевую соль ацетоуксусного эфира [157] и 1,3-биспропаргил резорцин (2.85) [171].
Коммерчески доступные (фирма Lancaster, ACROS) соединения 2-метил-5-меркапто-1,3,4 тиодиазол (2.18), 2-меркаптобензоксазол (2.19), 2-меркаптобензтиазол (2.20), 2-амино-5 меркапто-1,3,4-тиадиазол (2.21), 2,5-димеркапто-1,3,4-тиадиазол (2.22), 2 меркаптоимидазол (2.30), 2-меркаптобензимидазол (2.31а), 2-меркапто-5 нитробензимидазол (2.31б), 3-меркапто-1,2,4-триазол (2.32), 1Н-1,2,4-триазол (2.56), бензотриазол (2.57) использовали без предварительной очистки. ДМФА выдерживали сначала над щелочью, затем над Р2О5 и перегоняли 2 раза над Р2О5; CHCl3, этилацетат, диэтиловый, петролейный эфиры перегоняли над Р2О5; метанол перегоняли над натрием.
Исследование биологической активности мультигетероциклов Противомикробную активность определяли методом двухкратных серийных разведений [174] в жидкой питательной среде по отношению к штаммам Pseudomonas aeruginosa 9027, Escherichia coli F-50, Staphylococcus aureus 209p, Bacillus cereus 8035, Enterococcus faecalis ATCC 8043. Бактериальная нагрузка составляла 3.0x105 микробных тел/мл. Учет результатов проводили через каждые 24 ч в течение 5 суток при температуре 37С. Эксперимент повторяли 2 раза. Фунгистатическую активность по отношению к грибам Trichophyton mentagrophytes var. gypseum 1773, Aspergillus niger BKMF-1119 и Candida Albicans 885-653 определяли методом серийных разведений [175] на жидкой среде Сабуро. Время экспозиции в термостате при 26 С с соответствующим соединением составляла 14 суток. За действующую дозу принимали минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) веществ, задерживающую рост соответствующего тест-микроба. Регистрировали наличие роста бактерий или гриба, или отсутствие его за счет бактериостатического или фунгистатического действия соединения.
Для исследования холинотропных свойств мультигетероциклов использовались АХЭ эритроцитов человека (Sigma) и БуХЭ сыворотки крови человека (Sigma). Регистрация ферментативной реакции осуществлялась по методу Элмана [176] с использованием ацетилтиохолина в качестве субстрата. Зависимость активности АХЭ от концентрации ингибитора оценивалась с помощью уравнения Хилла, с расчетом среднеэффективной концентрации - IC50 Изучение общетоксического действия синтезированных соединений проводили согласно известной процедуры [177, 178] на беспородных белых мышах обоего пола массой 19.0±2.0 г, содержавшихся на стандартном рационе питания в условиях природного режима освещения помещения при комнатной температуре. Летальные дозы ЛД50 определялись по методу Вейсса.
Введение в состав алкильных цепочек 1,3-бис(-бромалкил)-6-метилурацилов (2.13а-д) и 1,3-бис(5-бромпентил)-5-бромурацила (2.13е) гетероциклов 2.18-2.22, 2.30-2.32, 2.56. Общая методика. К суспензии 2 экв гетероциклического соединения 2.18-2.22, 2.30-2.32, 2.56 в ДМФА при комнатной температуре и перемешивании добавляли 2 экв NaH, через 1 ч - раствор 1 экв дибромида 2.13а-е в ДМФА. Реакционную массу перемешивали сначала при комнатной температуре, а затем при 50 oC. Ход реакции контролировали методом ТСХ. Растворитель отгоняли, к остатку добавляли 150-250 мл хлороформа, фильтровали, фильтрат концентрировали до 10-20 мл и хроматографировали на колонке с силикаге л ем.