Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Координационные соединения на основе 2-селанилпиридин-1- 9 оксида и 2-меркаптопиридин-1-оксида 8
1.2. Селенилгалогениды и их использование в синтезе гетероциклов 12
1.3. Селенсодержащие соединения с биологической активностью 19
1.4. Механизм биологического действия соединений селена на микроскопические грибы 24
1.5. Защита ЛКМ от биоповреждений, вызываемых микроскопическими грибами с помощью фунгицидных добавок 38
2. Экспериментальная часть 50
2.1. Методы анализа 50
2.2. Синтез и очистка исходных соединений 53
2.3. Методики проведения биологических экспериментов 57
3. Результаты и их обсуждение 67
3.1. Синтез производных 2-селанил- и 2-меркаптопиридин- 1-оксидов. 67
3.2. Исследование биологической активности 2-селанил(меркапто)пиридин-1-оксида и их производных 79
Выводы 126
Список используемой литературы 127
Приложение 159
- Координационные соединения на основе 2-селанилпиридин-1- 9 оксида и 2-меркаптопиридин-1-оксида
- Механизм биологического действия соединений селена на микроскопические грибы
- Методики проведения биологических экспериментов
- Исследование биологической активности 2-селанил(меркапто)пиридин-1-оксида и их производных
Введение к работе
Актуальность работы. Одной из важных эколого-технологических проблем
является биодеградация промышленных материалов под воздействием микроорганизмов,
главным образом мицелиальных (плесневых) грибов. Среди промышленных материалов в
значительной степени биоразрушениям подвергаются лакокрасочные материалы (ЛКМ)
как в таре, так и в виде лакокрасочных покрытий на различных подложках (металлы,
древесина, пластик, бетоны и др.). Микромицеты способны использовать ЛКМ в качестве
источника питания и даже незначительное поражение этих материалов грибами может
привести к прогрессирующим деструкционным процессам. Рост грибов в материалах
способен негативно влиять на экологию человека. Основным способом защиты ЛКМ от
биоповреждений является использование различных добавок, придающих материалу
грибостойкость. В связи с этим поиск новых соединений, подавляющих
жизнедеятельность микроорганизмов, представляет актуальную задачу.
Известно, что широким спектром биологической активности обладают 2-меркапто-пиридин-1-оксид и его производные. Металлокомплексные соединения на основе 2-меркаптопиридин-1-оксида, такие как цинк пиритион и медь пиритион, нашли коммерческое применение в качестве промышленных фунгицидов и биоцидов в смазочно-охлаждающих жидкостях, в производстве лакокрасочных материалов и косметических средств. В тоже время, сведения о биактивности 2-селанилпиридин-1-оксида и его производных весьма ограничены. Впрочем, и химия этого соединения также мало изучена. Учитывая чрезвычайно быстро растущий интерес к химии селеноорганических соединений и высокий потенциал биоактивности таких соединений, исследования в этом направлении представляются также актуальными и перспективными. Выявление взаимосвязи между биологической активностью соединений и особенностями в их строении позволит создать основу для целенаправленного синтеза соединений с заранее прогнозируемым характером их воздействия на живые объекты.
Цели и задачи исследования. Целью работы является разработка методов синтеза новых производных 2-селанилпиридин-1-оксида, изучение их биологической активности по отношению к микроорганизмам - биодеструкторам лакокрасочных материалов.
Для реализации цели были решены следующие задачи:
1. Синтез и установление структуры производных 2-селанилпиридин-1-оксида;
2. Исследование биологической активности 2-селанилпиридин-1-оксида и его
производных, которое включает:
- оценку их биоцидных (фунгицидных и бактерицидных) свойств;
- изучение их действия на рост биомассы и активность ряда ферментов
микроскопических грибов, активных деструкторов промышленных материалов;
- проведение эколого-токсикологической оценки степени токсичности ряда
исследуемых соединений;
3. Изучение возможности применения синтезированных соединений для защиты
ЛКМ от биоповреждений, вызываемых грибами.
Научная новизна.
Впервые установлено, что 2-хлорселанилпиридин-1-оксид – продукт хлорирования 2-селанилпиридин-1-оксида сульфурилхлоридом, в кристаллическом состоянии находится в мономерной форме, стабилизированной за счет внутримолекулярного SeО взаимодействия.
Впервые установлено, что при взаимодействии 2-хлорселанилпиридин-1-оксида с транс-стильбеном в метиленхлориде образуется продукт стереоспецифичного полярного циклоприсоединения по кратной связи с замыканием цикла атомом азота пиридильного фрагмента – производное 2,3-дигидропиридо[1,2-b][1,4,2]-оксаселеназиния-5.
Впервые проведено селененирование цитизина и по реакции с 2-
хлорселанилпиридин-1-оксидом с высоким выходом синтезирован соответствующий селенениламид.
На основе 2-селанилпиридин-1-оксида и хлоридов переходных металлов синтезированы бис(1-оксипиридил-2-селеноляты)кадмия(II), цинка(II), никеля(II) и меди(II). Методом рентгеноструктурного анализа (РСА) установлена их молекулярная и кристаллическая структура.
Выявлены соединения, обладающие наибольшей биологической активностью в отношении исследуемых тест-организмов. Показано, что биологическая активность селенсодержащих соединений превосходит активность их серосодержащих аналогов.
На основе проведения эколого-токсикологических исследований установлены пороговые концентрации токсичности ряда соединений с использованием тест-культур цериодафний Ceriodaphnia affinis и водорослей Scenedesmus quadricauda, и даны рекомендации по возможному использованию этих соединений в качестве фунгицидных препаратов.
Впервые показана возможность использования 2-селанилпиридин-1-оксида, ди(2-
пиридил-1-оксид)диселенида и бис(N-оксипиридин-2-селенолат)кадмия(II) в качестве
средств защиты лакокрасочных материалов от биодеградации, вызываемой
микроскопическими грибами.
Теоретическая и практическая значимость работы заключается в том, что синтезированы производные 2-селанилпиридин-1-оксида, обладающие биологической активностью, которую удается регулировать путем изменения структуры этих соединений.
Разработанные методы синтеза на основе 2-селанилпиридин-1-оксида и полученные соединения могут найти применение в тонком органическом синтезе. Экспериментально доказанная способность добавок 2-селанилпиридин-1-оксида, ди(2-пиридил-1-оксид)диселенида и бис(N-оксипиридин-2-селенолят)кадмия(II) в ЛКМ обеспечивать этим композициям грибостойкие свойства позволяет рекомендовать указанные соединения в качестве средств защиты промышленных материалов от биоповреждений, вызываемых микроскопическими грибами.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Методы синтеза селенсодержащих соединений на основе 2-селанилпиридин-1-оксида.
-
Широкий спектр ингибирующего действия селенсодержащих соединений на метаболизм грибов обусловлен способностью селена накапливаться как внутри, так и на поверхности клеток грибов.
-
С точки зрения влияния на окружающую среду использование органических селенсодержащих соединений в качестве средств защиты ЛКМ от биоповреждений не может быть основано только на их эколого-токсикологических характеристиках (пороговых концентрациях), а должно учитывать также эколого-токсикологические характеристики защищаемого материала.
Апробация работы. Материалы диссертационного исследования были доложены на: Международной молодежной научно-практической конференции «Научные исследования и разработки молодых ученых IX» (Новосибирск, 2016), Всероссийской научной конференции с международным участием «Факторы устойчивости растений и микроорганизмов в экстремальных природных условиях и техногенной среде» (Иркутск, 2016), 21-ой нижегородской сессия молодых ученых (Княгинино, 2016); XVI Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 2016); VI Всероссийской конференции c международным участием «Актуальные вопросы химической технологии и защиты окружающей среды» (Чебоксары, 2016), XXI Всероссийской конференции молодых ученых – химиков (с международным участием) (Нижний Новгород, 2018). По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них 3
статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ.
Обоснованность научных положений и выводов, сформулированных в диссертации, обеспечена применением поверенного высокоточного современного аналитического оборудования и большим объемом исследований. Выводы, сделанные автором, адекватны полученным результатам.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы, включающего 359 источников, в том числе 281 – на иностранных языках. Работа изложена на 166 страницах, включает 57 рисунков, 17 таблиц.
Координационные соединения на основе 2-селанилпиридин-1- 9 оксида и 2-меркаптопиридин-1-оксида
Проблема микробной биодеградации промышленных материалов является важнейшей эколого-технологической проблемой. В процессе эксплуатации многие промышленные и строительные материалы подвергаются негативному воздействию микроорганизмов (бактерий и грибов), то есть процессу биоповреждений. Среди наиболее активных деструкторов ведущая роль принадлежит микроскопическим грибам. Лабильность, разнообразие, мощность ферментных систем позволяют этим живым организмам использовать в качестве источника питания самые различные субстраты природного и синтетического происхождения [1 – 3]. Одной из задач экологической химии является разработка новых биоцидных присадок предотвращающих разрушение материалов микроорганизмами. В качестве средств защиты промышленных материалов от биоповреждений используются различные методы, но наиболее распространенным является химический, а именно использование различных биоцидных (фунгицидных) препаратов [4, 5]. Известно, что арсенал биоцидов постоянно обновляется, так как грибы обладают высокими адаптационными возможностями и быстро приспосабливаются обезвреживать токсичные соединения. В настоящее время подбор биоцидных препаратов в большинстве случаев осуществляется методом проб и ошибок, без учета таких факторов, как механизм биодеградации, а также без учета физиолого-биохимических особенностей грибов деструкторов. Однако наиболее целесообразным является научно-обоснованный подбор биоцидных добавок, основанный как на исследовании механизмов деградации материалов, так и на изучении их ингибирующего действия на метаболизм грибов деструкторов. С точки зрения экологической химии также весьма важной является оценка возможного негативного влияния химических соединений (средств защиты) на окружающую среду, то есть проведение экотоксикологических исследований. Такие исследования позволяют оценить степень безопасности защищаемых биоцидами материалов как в условиях эксплуатации, так и при выборе путей утилизации промышленных материалов после окончания их использования.
В последние годы чрезвычайно интенсивно развивается химия селеноорганических соединений. В плане изучения и проведения синтеза новых органических соединений селена важным является не только выявление их физико-химических характеристик и установление их структуры, но и исследование их биологической активности. Это связано с тем, что селен является важным элементом для живых организмов, так как селенопротеины участвуют в окислительно-восстановительном регулировании путей передачи внутриклеточных сигналов, поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза и в метаболизме тиреоидных гормонов [6, 7]. Однако в зависимости от формы и концентрации селенсодержащие соединения могут изменять свое действие на организм, превращаясь из незаменимых в высокоопасные [8]. Если действие неорганических селенсодержащих соединений на биологические объекты сегодня достаточно хорошо изучено [9,10], то исследования по влиянию селенорганических соединений на живые системы находятся на стадии бурного развития [11]. При этом еще относительно мало изучено действие селенорганических соединений на микроскопические грибы. Таким образом, выяснение механизма действия селенсодержащих соединений на метаболизм микроскопических грибов представляет интерес как в плане расширения знаний о биологических свойствах данных соединений, так и в плане экологической химии, поскольку новые селенсодержащие соединения могут служить одними из средств защиты от микробных биоповреждений. Исследование механизмов ингибирующего действия на метаболизм грибов данных соединений позволит не только оптимизировать их синтез, но и целенаправленно осуществлять защиту от биоповреждений конкретных групп промышленных материалов.
Различные аспекты химии и практического применения селеноорганических соединений широко освещены в современной научной литературе [12 – 15]. В настоящем обзоре, в соответствии с целью работы, проанализированы публикации, посвященные в основном, химии и биохимии органических соединений селена (II) – селенолов, диселенидов, селененилгалогенидов и селен-, азотсодержащих гетероциклов, а также методам защиты ЛКМ от биоповреждений.
В химии координационных соединений широко используются тиолятные лиганды, в частности, в синтезе прекурсоров для химического осаждения поверхностных слоев металлов или сульфидов из паровой фазы при получении наноматериалов различного назначения [12,16].
Как уже отмечалось во введении, в плане биологической активности весьма известными и широко используемыми на практике являются комплексы на основе 2-меркаптопиридин-1-оксида (1) – так называемые соли пиритиона [17 – 21].
Например, пиритион цинка (2) и пиритион меди (3) широко используются в качестве противообрастающих биоцидных добавок [17, 18]. Пиритион цинка также активно применяется в качестве противосеборейного препарата [19 – 21]. Стабильные дисперсии солей пиритиона в многоатомных спиртах находят применение в качестве добавок к пенополиуретану. Они увеличивают открытость его ячеистой структуры и придают ему антимикробные свойства [22]. Пиритионы широко используются для защиты материалов от биоповреждений в водных растворах, включая адгезивы, водоэмульсионные краски и косметику [23]. Также пиритионы активно применяются в смазочно-охлаждающих жидкостях, ЛКМ, в предметах личной гигиены [24].
На основе реакций натриевой соли 1-гидрокси -2- пиридинтиона с солями металлов (хрома, марганца, железа, кобальта, никеля, меди, цинка, кадмия, циркония и ртути) синтезирован целый ряд соответствующих комплексных соединений [25].
Кристаллическая структура ряда комплексных соединений на основе 2-меркаптопиридин-1-оксида (1) была установлена методом рентгеноструктурного анализа [21, 22, 24, 26 – 28].
Так, пиритион цинка (2) - бис(1-оксипиридин-2-тионато)цинк(II) в кристаллическом состоянии представляет собой димерную структуру с пентакоординированным атомом цинка (рис.1.1).
В комплексе (3) молекула бис[1-гидроксипиридин-2)-тионато-S,O]меди (II) находится в транс плоско-квадратной конфигурации с атомом меди в области кристаллографического центра инверсии (рис.1.2).
Как оказалось, довольно высокой биоактивностью обладают не только пиритионы металлов, но и исходное соединение для этих комплексов - 2-меркаптопиридин-1-оксид (1). Прежде всего, данное соединение интенсивно изучалось в связи с его хорошей антимикробной активностью, в том числе и фунгицидной [86 – 88]. Фунгицидная активность данного соединения обусловлена его способностью ингибировать мембранный транспорт у микроскопических грибов. Кратковременная инкубация мицелия грибов рода Penicillium с пиритионом приводила к значительному снижению активности различных независимо регулируемых транспортных систем, включая системы транспорта неорганического фосфата, метиламина (NH4+ - пермеаз), холин-О-сульфата, глюкозы, L-метионина и нескольких гидрофобных аминокислот (пермеазы аминокислот) [29]. Кстати, молекулярная структура соединения 1 описана в работе [30] и показано, что в кристаллическом состоянии оно находится в форме тиона (рис. 1.3).
Механизм биологического действия соединений селена на микроскопические грибы
В связи с быстрым метаболизмом, клетки грибов характеризуются высоким уровнем взаимодействия с окружающей средой. Вследствие этого, многие микроэлементы, включая те, которые являются жизненно важными, такие как селен, естественным образом аккумулируются грибами [6, 141 – 143]. Однако механизм аккумуляции селена и его метаболизации до конца не изучен. Предполагают, что внеклеточное связывание селена основано на физико-химических процессах, особенно на хемосорбции. Биосорбция селена происходит вследствие наличия функциональных групп, которые несут отрицательный заряд на поверхности клеточной стенки, например, фосфодиэфирные [144] и сульфидные мостики [145], маннозно-фосфатные остатки [146, 147], и отрицательно заряженные фосфатные, карбоксильные и гидроксильные группы [148]. Степень биосорбции сильно зависит от гидрофобности поверхности клеточной стенки дрожжей, которая зависит от наличия полисахаридов, белков и липидов [147]. На основе имеющихся исследований [149], можно сказать, что клеточная стенки, в частности полисахариды в ее составе, устанавливает барьер, препятствующий проникновению селена в цитоплазму клетки. В этом процессе происходит образование ионных связей или комплексообразование между ионами селена и биополимерами дрожжевой клеточной стенки (активными группами белков, фосфолипидами или полисахаридами). Особую роль играет слой маннопротеинов, который образует внешний защитный барьер и определяет проницаемость клеточной стенки дрожжей [146]. Имеющиеся данные [150] говорят о том, что за связывание селена маннанами и глюканами отвечает процесс хемосорбции. Также было показано, что наличие селена в питательной среде изменяет жирнокислотный состав цитоплазматической мембраны дрожжей, например, под влиянием селена происходит увеличение содержания жирных кислот C18 [151]. С другой стороны, в дрожжах, обогащенных каротиноидами, наблюдалось разрушение ненасыщенных жирных кислот (линолевой и линоленовой кислот). Информации о роли белков в процессе связывания селена нет.
Поскольку клеточная мембрана непроницаема для ионов селена, то требуются специальные механизмы транспорта данных ионов внутрь клетки. В связи с этим, процесс внутриклеточного накопления происходит с помощью активного транспорта атомов селена внутрь клеток дрожжей. Однако к настоящему времени было опубликовано лишь несколько работ, посвященных изучению данного процесса на примере клеток дрожжей [152 – 154]. На основе этих данных можно сделать вывод о том, что из-за химического сходства таких элементов как сера и селен, микроорганизмы транспортируют атомы селена внутрь клетки, скорее всего, используя ферменты-переносчики, такие как Sul1и Sul2 сульфатпермеазы. Это предполагает, что транспорт селената (VI) сильно зависит от наличия сульфатов в культуральной среде. При отсутствии в среде атомов серы, способность к поглощению атомов селена микроорганизмами резко возрастает. Также было показано, что присутствие фосфатов в культуральной среде снижало сродство к атомам селена у дрожжей S. cerevisiae [154, 155]. В среде с низким содержанием фосфатов главными факторами связывания селенита (IV) клетками дрожжей были транспортеры Pho84p и Pho89p. При высоких концентрациях фосфатов в среде, транспорт селена был постепенно заменен транспортерами с низким сродством (Pho87p, Pho90p и Pho91p), и, как следствие, абсорбция атомов селена была снижена, а устойчивость клеток к селену возрастала.
Кинетика внутриклеточного связывания селена у S. cerevisiae говорит о том, что существует две транспортные системы – одна с высоким, а другая с низким сродством к атомам селена. Оба типа транспорта зависят от наличия глюкозы в питательной среде, которая значительно увеличивает скорость сорбции атомов селена клетками дрожжей [154, 156]. Похожая зависимость между накоплением селена и поступлением глюкозы наблюдалась у Candida albicans 806 [157]. Наличие различных механизмов транспорта также подтверждается тем, что содержание селена в ядерной фракции и в целом в клетке зависит от типа сахаров в культуральной среде. На основании этого было сделано предположение о том, что сложные ионы селена транспортируются в цитозоль клетки вместе с адсорбированным углеводным субстратом. В 2010 году было показано, что симтранспортер Jen1p, монокарбоновый транспортер, переносит атомы селена (IV) внутрь клеток дрожжей [158]. Он также участвует в транспорте пировиноградной, молочной, уксусной и пропионовой кислот [159]. Транспорт селенита основан на структурном сходстве аниона селена и анионов карбоновых кислот. Кроме того, эти молекулы имеют близкие константы диссоциации при физиологических значениях рН, они несут единичный отрицательный заряд. Было показано, что Candida utilis VSB-651 с высокой активностью восстановительных ферментов и глутатион пероксидаз была способна связывать в два раза больше селена, по сравнению с Candida ethanolica VSB-814, обладающей этими ферментами с низкой активностью [160]. Стоит отметить, что селен в его органических формах лучше сорбируется клетками дрожжей и менее токсичен, чем его неорганические формы.
Таким образом, связывание селена микробными клетками в большой степени зависит от используемых организмов, условий культивирования и концентрации селена в экспериментальной среде. Все указанные факторы влияют на накопление биомассы и содержание селена в биомассе клеток. Таким образом, механизм транспорта и биоаккумуляции селена клетками микроорганизмов связан с присутствием различных переносчиков-транспортеров или наличием не специфических транспортеров ионов, связанных с углеводами.
Первой стадией метаболизма селена в клетках дрожжей является восстановление под действием ферментов (рис. 1.9). Изначально селенат в ферментативном процессе превращается в APSe в реакции катализируемой АТФ-сульфурилазой. Продукт этой реакции превращается в селенит под действием РАРSe-редуктазы. В этой реакции восстановителем является НАДФН [161]. В следующей реакции восстановление селенита катализируется сульфат редуктазой с участием НАДФН как восстановителя.
Также существует процесс трансформации SeCb2" с участием глутатиона, в котором селенит (IV) спонтанно реагирует с восстановленной формой глутатиона (GSH). В результате образуются селенодиглутатион (GS-Se-SG) и окисленная форма глутатиона (GSSG) (реакция 1). Окисленная форма глутатиона (GSSG) как токсичное соединение (так как образует дисульфиды с тиолсодержащими белками и окисляет их) транспортируется в вакуоли или превращается в восстановленную форму (GSН) с помощью глутатион редуктазы. На следующем этапе, внутриклеточный селенодиглутатион превращается в глутатионилселенол (GS-Se-H), а затем в селеноводород, (H2Se/HSe ), с одновременным образованием окисленной формы глутатиона (GSSG) (реакции 2,3)
Методики проведения биологических экспериментов
В экспериментах по определению фунгицидной активности использовались следующие тест-культуры грибов: Alternaria alternata Keissler, Penicillium cyclopium Westling, Penicillium chrysogenum Thorn, Aspergillus oryzae Cohn, Aspergillus terreus Thorn, Aspergillus niger van Tieghem, полученные из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ).
Исследование наличия ингибирования роста грибов селенсодержащими соединениями проводилось диско-диффузионным методом [275]. Бумажные диски пропитывали 0.5% раствором веществ в ДМСО и помещали на среду Чапека-Докса, инокулированную спорами грибов. Параллельно ставили контрольные чашки Петри с агаризованной средой Чапека-Докса с бумажными дисками, не содержащими фунгицидный препарат, и инокулированной суспензией спор грибов. Инкубация длилась в течение 14 суток в термостате при (27±2)С. Исследуемые соединения обладали фунгицидными свойствами, если вокруг диска на питательной среде наблюдалась зона отсутствия роста грибов (ингибиторная зона).
Фунгицидная активность селенсодержащих соединений изучалась по общепринятой методике [276]. Для опытов использовалась агаризованная среда Чапека-Докса следующего состава (г/л): NaNO3 - 2.00, КС1 - 0.50, КН2Р04 - 1.00, Fe2(S04)3 7H20 - 0.01, MgS04 7 Н20 - 0.50, агар-агар - 20.00, сахароза - 30.00. Простерилизованную питательную среду остужали до 50 - 40 С и в каждую из колб вводили по одному веществу, растворенному в ДМСО в соответствующих концентрациях. После взбалтывания среду с введенными в нее препаратами разливают по 20 - 25 мл в чашки Петри. Чашки оставляли при комнатной температуре до полного застывания агаризованной среды. Контролем являлись агаризованная среда в чашках Петри без биоцидов. На поверхность застывшей питательной среды уколом иглы в трех точках производили посев тест-грибов. Чашки Петри с посеянными в них тест-грибами выдерживали в термостате 3 - 5 сут при 27С. Учитывался линейный рост (величина диаметра) колоний грибов. Фунгицидная активность рассчитывали по формуле Эббота:
Т = 100%, где
Пк
Т - процент подавления роста мицелия грибов,
Пк - диаметр колонии гриба в контроле,
По - диаметр колонии гриба под действием препарата. Фунгицидной активностью обладали соединения, ингибирующие рост грибов на 100%. Меньший процент ингибирующего действия нами рассматривался как фунгистатическое действие. На основе этого нами определялась минимальная ингибирующая (фунгицидная) концентрация для каждого соединения по отношению к отдельным тест-культурам грибов.
В экспериментах по определению бактерицидной активности использовались следующие тест-культуры бактерий: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, полученные из ВКМ.
Для культивирования бактерий использовали мясопептонный агар. Исследование бактерицидности проводилось диско-дифузионным методом. Для получения суспензии бактерий 5 – 7 мл стерильного физиологического раствора делали смыв с поверхности твердой питательной среды с суточной культурой бактерий. Полученную суспензию стандартизировали физиологическим раствором по оптическому стандарту мутности на 10 единиц. Затем с помощью пипетки отбирали 0.2 мл полученной суспензии культуры и переносили ее в центр чашки Петри. С помощью шпателя растирали культуру по всей поверхности питательной среды. Затем в чашки Петри помещали по 5 бумажных дисков каждый диаметром 5 мм, пропитанных растворами исследуемых веществ в диметилсульфоксиде (ДМСО). Контролем служили образцы с фильтрами, пропитанными чистым растворителем. Инкубация длилась в течение суток в термостате при (37±2)С [277]. Исследуемые соединения обладали бактерицидными свойствами, если вокруг дисков на питательной среде наблюдалась зона отсутствия роста грибов (ингибиторная зона).
Прирост биомассы определялся следующим образом. Суспензия спор тест-культур грибов помещалась в колбы с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): NaNO3 – 2.00, KH2PO4 – 0.70, K2HPO4 – 0.30, KCl – 0.50, MgSO4 7H2O – 0.50, FeSO4 7H2O – 0.01, сахароза – 30.00. Культивирование проводилось при температуре (27±2) С на перемешивающих устройствах марки ПЭ – 0034 «Экоприбор» (Россия), которые обеспечивали встряхивание колб со скоростью 180 об/мин. После культивирования в течение 7 суток, мицелий отфильтровывался, и равные по массе образцы мицелия вносились в колбы со свежей питательной средой, содержащей исследуемые соединения в концентрациях по селену 10, 50 и 100 мг/л растворенные в ДМСО или аналогичное количество ДМСО (5 мл) в контрольном эксперименте. Культивирование проводилось аналогичным описанному выше способом в течение 7 суток. По истечении срока культивирования, мицелий был отфильтрован и высушен до постоянной массы и взвешен. 2.3.4 Определение содержания селена и металлов в мицелии
Анализ проб для определения содержания селена и металлов в мицелии осуществлялся методом атомно-эмиссионной спектроскопии с использованием спектрометра с индуктивно-связанной плазмой Prodigy High Dispersion ISP «Teledyne Instruments Leeman Labs» (США). Для этих целей использовался мицелий А. oryzae, выращенный аналогичным описанному выше способу для определения прироста биомассы. Пробоподготовка проводилась путём «мокрого» озоления, образцы высушенного мицелия массой примерно 0.1 г взвешивались на аналитических весах и растворялись в 14% HNO3 в течение 10 мин при 180 C в микроволновой печи, после чего готовый раствор вводился в прибор [278]. При проведении исследований измерялись интенсивности спектральных линий элементов Se (196.09 нм, 203.98 нм), Cd (226.50 нм), Zn (213.86 нм), Cu (324.75 нм), Ni (231.60 нм), Na (589 нм). Предел чувствительности метода составлял для Se не хуже 0.0002 масс.%, для Cd, Zn, Cu, Ni, Na не хуже 0.00002 масс.%, соответственно.
Методом рентгеновского микроанализа с построением карт распределения элементов определялось содержание селена и металлов в мицелии гриба. Исследования методом сканирующей электронной микроскопией проводились на мицелии А. oryzae, выращенным аналогичным описанному выше способу для определения прироста биомассы. После культивирования отбиралась навеска мицелия (0.1 г), трижды промывалась дистиллированной водой, и выполнялись микроскопические исследования. Электронная микроскопия мицелия выполнялась с помощью микроскопа JSM-IT300LV «JEOL» (Япония) с разрешением не менее 10 нм. Сканирующий электронный микроскоп был оснащен энергодисперсионным детектором X-MaxN 20 «Oxford Instruments» (Великобритания), что позволяет проводить определение содержание селена в мицелии гриба методом рентгеновской флуоресценции.
Определение общей активности ряда нативных эндо- и экзооксидоредуктаз (каталазы, пероксидазы, фенолоксидазы) проводилось спектрофотометрически приборе UV-mini 1240 «Shimadzy» (Япония). Для определения активности экзооксидоредуктаз отбирались пробы культуральной среды гриба (15 мл). Для оценки активности эндооксидоредуктаз навеска мицелия гриба (500 мг) после определенного времени культивирования отделялась от культуральной среды, дезинтегрировалась, центрифугировалась при 10 000 g в течение 15 минут, после чего отбирался супернатант для анализа. Активность ферментов определялась: каталазная – по убыли Н2О2 (при =240 нм) [279], фенолоксидазная – по окислению п–фенилендиамина (=535 нм) [280], пероксидазная – по окислению п–фенилендиамина (=535 нм) в присутствии Н2О2 [281]. За единицу активности (ед.) каждого из перечисленных ферментов принималось изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 минуту в пересчете на 1 мг белка. Активность ферментов рассчитывалась по формуле
Исследование биологической активности 2-селанил(меркапто)пиридин-1-оксида и их производных
Одним из важных свойств новых органических соединений является их биологическая активность. Целенаправленный и научно обоснованный синтез новых биоцидных соединений не может быть осуществлен без изучения взаимосвязи между их химической структурой и биологическим действием по отношению к определенным группам живых организмов. Эксперименты, проводимые нами по определению биологической активности синтезированных соединений 1 – 18 представлены в разделах 3.2.1 – 3.2.9. Для того чтобы среди синтезированных соединений, определить те, которые обладают наибольшей биологической активностью, на первом этапе работы нами было исследовано их биоцидное действие по отношению к ряду микромицетов – активных деструкторов промышленных материалов, а также бактериям, участвующих в деструкционных процессах. Поскольку исследуемые селенсодержащие соединения являются структурными аналогами серосодержащих соединений, широко используемых в промышленности в качестве биоцидных препаратов [23], то представляло интерес сравнить их биологическое действие. Для оценки вклада в биоцидное действие органической части указанных соединений, была исследована биоцидная активность пиридин-1-оксида (соединение 19). Данное соединение аналогично по строению исследуемым соединениям, но не содержит в своем составе атомов селена и серы. В ходе экспериментов диско-диффузионным методом было показано отсутствие как фунгицидной, так и бактерицидной активности пиридин-1-оксида в концентрациях 0.50 – 2.50% ко всем тест-организмам, тогда как у остальных соединений биоцидная активность была обнаружена. Это свидетельствует о том, что биоцидная активность данных соединений обусловлена наличием в их составе атомов селена и серы, а не органической частью молекулы. Величина биоцидной активности исследуемых соединений нами оценивалась на основании значений МИК в процентах, которая рассчитывалась по формуле Эббота. В таблицах 3.6 и 3.7 представлены средние значения МИК исследуемых соединений по отношению к микроскопическим грибам и бактериям.
Среди исследуемых соединений наибольшим фунгицидным эффектом обладало соединение 3, а наименьшим соединение 17. Практически все селенсодержащие соединения обладали большим фунгицидным эффектом, по сравнению с их серосодержащими аналогами (исключения составили соединения 8 и 10). Как среди серосодержащих, так и среди селенсодержащих соединений, комплексные соединения 7 – 13 проявляли меньшее биоцидное действие по сравнению с исходными соединениями 1 и 2, а также с продуктами их окисления 3 и 4. Среди комплексных Se-содержащих соединений наибольшей фунгицидной активностью обладал комплекс 2-селанил-1-пиридин-1-оксида с кадмием 7, а наименьшей – с никелем 10. Продукты реакций 2-селанил-1-пиридин-1-оксида с природными соединениями инденом и цитизином обладали низкой фунгицидной активностью, особенно соединение 18, которое даже в концентрации 10.0% не проявляло фунгицидного действия к некоторым видам микромицетов. Среди тест культур мицелиальных грибов достаточно высокой чувствительностью ко всем исследуемым соединениям обладал Alt. alternantа, а к селенсодержащим соединениям также A. oryzae.
Исследование бактерицидной активности проводилось нами только для соединений, обладающих значительной фунгицидной активностью. Анализ таблицы 3.7 показывает, что бактерицидный эффект исследуемых соединений также был обусловлен атомами селена и серы, входящими в их состав, а не органической частью молекул. Стоит отметить, что практически все исследуемые селенсодержащие соединения обладали несколько большим бактерицидным эффектом, чем их серосодержащие аналоги. Наибольшим бактерицидным эффектом, среди всех изучаемых соединений обладал комплекс 2-селанил-1-пиридин-1-оксида с кадмием, а наименьшим – 2-меркапто-1-пиридин-1-оксид. В целом, как селен-, так и серосодержащие комплексные соединения обладали более выраженным бактерицидным эффектом, по сравнению с исходными соединениями 1 и 2.
Полученные данные отражают влияние заместителей на биоцидную активность изучаемых соединений. Соединение 19, не содержащее в своем составе атомов серы и селена, не обладало биоцидным эффектом в исследуемых концентрациях. Таким образом, наши эксперименты показали, что биактивность зависит от химической структуры соединения и от вида халькогена (S, Se). Фунгицидная активность исследуемых соединений проявлялась в концентрациях 0.05 – 2.50%, за исключением соединения 18. На сегодня имеется несколько работ посвященных изучению антимикробного действия селенорганических соединений [131 – 135, 137 – 140, 330, 331]. Сообщалось о фунгицидной активности ряда селендиазолов и ионных жидкостей имидазола, содержащих селен, по отношению к мицелиальным грибам. МИК данных соединений по отношению к Aspergillus fumigatus, A. niger и Penicillium notatum находилась в пределах 0.05–0.50 % [134, 331], что находится в соответствии с полученными нами результатами.
Установленные значения МИК показали, что фунгицидное действие изучаемых соединений по своей эффективности сравнимо с фунгицидной активностью производных бензотиазолов и четвертичных аммониевых соединений, которые в настоящее время находят широкое применение в качестве технических фунгицидов (средств защиты промышленных материалов от биоповреждений, вызываемых грибами) [207]. Вышеизложенное позволяет в перспективе рассматривать исследуемые нами соединения в качестве возможных средств защиты промышленных материалов от микробных биоповреждений. Таким образом, исследования в данном направлении помогут внести вклад в решение важной экологической проблемы – предотвращения биодеградации промышленных и строительных материалов, что будет способствовать ресурсосбережению и рациональному природопользованию.
В связи с тем, что биоповреждения, вызываемые мицелиальными грибами, наносят значительно больший ущерб (по приблизительным оценкам в 4 раза), чем бактериальные биоповреждения [332, 333], дальнейшие эксперименты были направлены на исследования действия изучаемых соединений на мицелиальные грибы. Учитывая несколько большую биоцидную активность селенсодержащих соединений, по сравнению с серосодержащими, а также тот факт, что биоактивность серосодержащих соединений достаточно хорошо изучена, тогда как информация о биологической активности органических соединений селена в отношении микроскопических грибов практически отсутствует [46, 131, 334], дальнейшие эксперименты проводились нами с использованием селенсодержащих соединений.
В предыдущих экспериментах нами был показан биоцидный эффект селенсодержащих соединений в отношении споровых форм микроскопических грибов. Поэтому на следующем этапе работы представляло интерес изучить способность указанных соединений оказывать влияние на рост биомассы вегетативного мицелия. Одним из показателей оценки роста грибов является прирост сухой биомассы мицелия в процессе культивирования [335]. В данном эксперименте в качестве тест-организма нами использовался A. oryzae. Выбор данного микромицета обусловлен тем, что он, обладая значительными гидролазной и оксидоредуктазной активностями, является активным биодеградантом широкой группы полимерных материалов [250, 336]. Кроме того, согласно данным раздела 3.2.1, данный микроорганизм высокочувствителен к селенсодержащим соединениям. Прирост биомассы контрольного образца был принят за 100%. Результаты данного эксперимента представлены на рисунке 3.8.
Анализ данной диаграммы показывает, что все исследуемые соединения подавляли рост биомассы данного микромицета во всех концентрациях (за исключением никелевого комплекса в концентрации 10 мг/л). Наименьшее подавление прироста биомассы наблюдалось при культивировании A. oryzae на среде, содержащей соединения 10 и 5 что согласуется с данными по МИК (табл. 3.6). Полученные данные позволяют говорить о действии селеноорганических соединений на рост вегетативного мицелия. Для оценки влияния органической части молекул на рост биомассы нами были проведены аналогичные эксперименты с пиридин-1-оксидом. Данное соединение, не содержащее атомов селена, вызывало торможение роста биомассы A. oryzae. Однако степень ингибирования прироста биомассы пиридин-1-оксидом была значительно меньше, чем для селенсодержащих соединений, что соответствует данным, полученным в предыдущих экспериментах по определению МИК. Наиболее эффективно подавляли рост вегетативного мицелия соединения 8 и 9. Тогда как на споровую форму грибов сильнее действовало соединение 3. Соединение 7 достаточно эффективно действовало как на споровую форму, так и на вегетативный мицелий.
Стоит отметить, что в ходе экспериментов по определению степени влияния соединений на рост вегетативного мицелия интересные данные были получены для соединения 18. Так как его биоцидное действие проявлялось только в очень больших концентрациях, МИК = 10.00% (табл. 3.6), а для некоторых грибов, в том числе и A. oryzae, биоцидные эффект не был обнаружен, то мы использовали более широкий ряд концентраций в данном эксперименте. При культивировании A. oryzae на среде, содержащей соединение 18 в концентрации 1.00 мг/л, была отмечена активация роста биомассы на 64 % по сравнению с контролем. Данное соединение является продуктом реакции 2-селанилпиридин-1-оксида и природного соединения, цитизина. Полученные данные позволяют предположить, что добавление селена в низких концентрациях в составе природных соединений в среду культивирования микромицетов положительно влияет на развитие вегетативного мицелия. Данный эффект активации роста биомассы A. oryzae не наблюдался нами при исследовании низких концентраций (1.00 мг/л) других соединений, в частности 1 и 3, при их добавлении в среду культивирования. Прирост биомассы на средах, содержащих данные соединения в концентрации 1.00 мг/л, не отличался от контрольного образца. При дальнейшем увеличении концентрации соединения 18 в среде, начинает проявляться эффект ингибирования селеном роста вегетативного мицелия, хотя значительно меньший, чем для других исследуемых соединений. Сопоставимое подавление роста биомассы наблюдалось только при очень высоких концентрациях 100 – 250 мг/л.
Данное наблюдение представляет определенный интерес для биотехнологических производств, связанных с культивированием микроскопических грибов. Однако в связи с тем, что мы планируем использовать 2-селанилпиридин-1-оксид и его производные в качестве технических биоцидов (средств защиты промышленных материалов от биоповреждений), то мы акцентировали свое внимание на процессах подавления жизнедеятельности грибов исследуемыми соединениями.