Синтез и исследование новых функциональных производных 6-[(2,6-дигалогенфенил)(метокси)метил]пиримидин-4(3H)-она Захарова Екатерина Константиновна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 С2-Функционализация производных пиримидин-4(3Н)-она в синтезе его биологически активных производных 8

Глава 2 Обсуждение результатов

2.1 Синтез и исследование новых этиловых эфиров 4-арил-2-метил-4-метокси-3 оксобутановых кислот на основе 2,6-дигалогенминдальных кислот 36

2.2 Циклоконденсация этиловых эфиров 4-арил-2-метил-4-метокси-3 оксобутановых кислот с нитрогуанидином: синтез новых производных N2 нитроизоцитозина 44

2.3 Изучение аминолиза 6-(2,6-дигалогенфенил)(метокси)метил-5-метил-N2 нитроизоцитозинов первичными и вторичными алифатическими аминами 50

2.4 Квантово-химическое исследование механизма реакции аминолиза 6-(2,6 дифторфенил)(метокси)метил-5-метил-N2-нитроизоцитозина циклопентиламином

2.5 Исследование анти-ВИЧ-1 активности и цитотоксичности новых производных 6-(2,6-дигалогенфенил)(метокси)метил-5-метилизоцитозина 79

Глава 3 Экспериментальная часть 87

Заключение 93

Список литературы

• Синтез и исследование новых этиловых эфиров 4-арил-2-метил-4-метокси-3 оксобутановых кислот на основе 2,6-дигалогенминдальных кислот
• Изучение аминолиза 6-(2,6-дигалогенфенил)(метокси)метил-5-метил-N2 нитроизоцитозинов первичными и вторичными алифатическими аминами
• Квантово-химическое исследование механизма реакции аминолиза 6-(2,6 дифторфенил)(метокси)метил-5-метил-N2-нитроизоцитозина циклопентиламином
• Исследование анти-ВИЧ-1 активности и цитотоксичности новых производных 6-(2,6-дигалогенфенил)(метокси)метил-5-метилизоцитозина

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Последнее десятилетие ознаменовалось существенными успехами на ниве направленного создания новых ингибиторов ретровирусной репликации. Получены и исследованы были многочисленные соединения, принадлежащие к самым различным классам функциональных производных соединений гетероциклического ряда. Далеко не последнее место среди этих веществ занимают производные пиримидина, причем, как нуклеозидной, так и ненуклеозидной природы. Ввиду того, что первые являются конкурентами естественных субстратов нуклеозидов, селективность их действия в отношении вирусных частиц, как правило, не слишком велика. В то же время, выражен ряд токсических эффектов в отношении клеточных структур. Производные ненуклеозид-ной природы, напротив, лишены этого недостатка, что обусловливает повышенный и неугасающий интерес к этим веществам.

Степень разработанности темы исследования. На сегодняшний день известно, что одним из наиболее предпочтительных остовов для построения молекул таких веществ, является фрагмент 4(6)-бензилпиримидина. Производные изо-цитозина, содержащие это ядро наряду с одной или двумя алифатическими группами С₁-С₃ при экзоциклическом атоме азота, были охарактеризованы как ненук-леозидные ингибиторы ВИЧ-1. Впервые это свойство соответствующих производных пиримидина было выявлено в ходе совместной работы исследователей ВолгГТУ в сотрудничестве с ведущими итальянскими и испанскими научными центрами в 2007 году. Основываясь на взаимосвязях химической структуры и противовирусной активности в ряду этих функциональных производных, была сформулирована цель настоящей работы, как продолжения исследований, направленных на получение новых высокоактивных анти-ВИЧ-1 агентов ряда ДАБО.

¹ Автор выражает глубокую признательность директору ЦКП «ФХМИ», д.х.н., профессору Орлинсону Б.С. и ведущему инженеру кафедры «Органическая химия», к.х.н. Бабушкину А.С. за участие в обсуждении результатов работы.

Цель работы заключается в разработке научных основ синтеза новых N -алкил- и #²Д²-диалкил-6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозинов потенциальных противоретровирусных агентов ненуклеозидной природы.

Поставленная цель достигалась путем решения следующих задач:

- сравнительное исследование аминолиза производных 6-(2,6-дигалоген-а-
метоксибензил)-#²-нитроизоцитозина первичными и вторичными алифатически-
ми аминами, как способов направленного синтеза потенциальных противоретро-
вирусных агентов ненуклеозидной природы: #²-алкил- и #²Д²-диалкил-6-(2,6-
дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозинов;

разработка синтетических подходов к получению 6-(2,6-дигалоген-ос-метоксибензил)-#²-нитроизоцитозинов на основании соответствующих 2-гидрокси-2-(2,6-дигалогенфенил)уксусных кислот;

выявление закономерностей «химическая структура - биологическая активность» в ряду новых #²-алкил- и #²Д²-диалкил-6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозинов, на основе сравнительной оценки противовирусных и цитотоксических свойств этих соединений с использованием ВИЧ-инфицированных и квази-инфицированных колоний клеток лимфоидной ткани.

Научная новизна. На основании изучения реакции аминолиза 6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)-#²-нитроизоцитозинов первичными и вторичными алифатическими аминами, установлено, что целевые производные Л^-алкил-б-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозина образуются с гораздо лучшим выходом, чем соответствующие производные #²Д²-диалкил-6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозина, ввиду более высокой нуклеофильности и, соответственно, реакционной способности первичных аминов по сравнению со вторичными в реакции аминолиза.

Предложен удобный трехстадийный подход к синтезу функциональных производных 6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)-#²-нитроизоцитозинов с использованием реакции региоселективного <9,С>'-диметилирования 2-гидрокси-2-(2,6-дигалогенфенил)уксусных кислот в суперосновной системе димсиллитий-ДМСО.

Впервые выявлено, что в ряду новых производных N -алкил- и N Д -диалкил-6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозина максимум анти-ВИЧ-1 активности приходится на #²-циклопентил- и #²-метил-#²-пропил-замещенные производные, в то время, как #²-пропил- и #²-изопропил-замещенные соединения менее активны.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выполненная работа вносит существенный вклад в органическую химию: разработан удобный общий подход к получению новых производных #²-алкил-6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозина, основанный на использовании 2-гидрокси-2-(2,6-дигалогенфенил)уксусных кислот в качестве исходных соединений и позволяющий получать целевые вещества со стабильным и воспроизводимым выходом. В ходе биологических исследований новых функциональных производных N²-алкил- и #²Д²-диалкил-6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозина, показана их высокая ингибирующая активность в отношении ВИЧ-1, сочетающаяся с низкой цитотоксичностью. На основании сопоставления противовирусных свойств полученных соединений в параллельном эксперименте с препаратами сравнения -Невирапином и Эфавирензом установлено, что все без исключения полученные вещества существенно превосходят оба препарата сравнения по способности подавлять цитопатические эффекты дикого штамма ВИЧ-1 NL4-3.

Личный вклад автора заключается в выполнении химических экспериментов в части получения, анализа и подтверждения структуры и чистоты синтезированных соединений, в том числе, получено 27 соединений, не описанных ранее, анализе и систематизации данных о взаимосвязи химической структуры и биологической активности в ряду полученных веществ, обобщении и анализе литературных данных по проблеме диссертационного исследования, диссертация и автореферат написаны самостоятельно.

Методология и методы исследования. Методология работы заключается в экспериментальном установлении взаимосвязи между структурой и реакционной способностью функциональных производных 6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)-

Л^-нитроизоцитозинов, этиловых эфиров 4-арил-2-метил-4-метокси-3-оксобутановых кислот, 2,6-дигалогенфенил--метоксиуксусных кислот и выявлении зависимости «структура-противовирусная активность» #²-алкил- и М²Л²-диалкил-6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозинов. Для этого были использованы следующие методы исследования: Ъ-ЯМР-и ¹³С-ЯМР - спектроскопия, ГЖХ-МС и ТСХ анализы, масс-спектрометрия, колоночная хроматография, расчеты по теории функционала плотности (DFT) проводились с использованием ВЗЬУР-обменно-корреляционного функционалаи стандартного базисного набора 6-311++G**.

Положения, выносимые на защиту:

региоселективное аО'-диметилирование 2-гидрокси-2-(2,6-

дигалогенфенил)уксусных кислот эффективно протекает в суперосновной системе димсиллитий-ДМСО;

- аминолиз 6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)-7У²-нитроизоцитозинов первичными алифатическими аминами в среде бутанола позволяет получить N²-алкил-6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)изоцитозины с высоким выходом;

реакция аминолиза может проходить по «концертному» механизму Sat2(8~); целевые #²-алкил- и #²Д²-диалкил-6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)-изоцитозины являются ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ и подавляют репликацию дикого штамма вируса NL4-3 в концентрации 0.00032 мкг/мл;

- максимум анти-ВИЧ-1 активности приходится на Л^-циклопентил- и N²-метил-#²-пропил-замещенные производные.

Достоверность полученных результатов подтверждается применением комплекса современных физико-химических методов исследования, получением воспроизводимых экспериментальных данных, не противоречащих современным научным представлениям и закономерностям.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на IX всероссийской конференции «Химия и медицина» с Молодёжной научной школой по органической химии (г. Уфа, пос. Абзаково, 2013 г.), XVI молодёжной школе-

конференции по органической химии (г. Пятигорск, 2013 г.), Третьей международной научной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений», (г. Пятигорск, 2013 г.), Первой Российской конференции по медицинской химии (MedChem Russia-2013) с международным участием (г. Москва, 2013 г.), Третьей всероссийской научной конференции (с международным участием) «Успехи синтеза и комплексообразования», посвящённой 55-летию РУДН (г. Москва, 2014 г.), Междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической и биологической химии – 2014. МедОргБиоХим–2014 (пос. Новый Свет (Крым) 2014 г.), Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (г. Екатеринбург, 2014 г.),VI международной конференции РХО им. Д.И. Менделеева, посвященной 180-летию со дня рождения Д.И. Менделеева (г. Москва, 2014 г.), VI всероссийской конференции при участии зарубежных учёных с элементами школы для молодых исследователей (г. Казань, 2015 г.) и Втором междисциплинарном симпозиуме и молодёжном форуме по медицинской, органической и биологической химии – 2015. МедОргБиоХим–2015 (пос. Новый Свет (Крым) 2015 г.).

Публикации. По содержанию диссертации опубликовано 4 статьи в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ и 10 тезисов научных докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, заключения и списка литературы. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц, 1 рисунок, 230 литературных ссылок.

Синтез и исследование новых этиловых эфиров 4-арил-2-метил-4-метокси-3 оксобутановых кислот на основе 2,6-дигалогенминдальных кислот

Многообразие видов физиологической активности производных пиримидина: изоцитозинов, урацилов и 2-тиоурацилов, позволяет рассматривать их как привилегированные структуры при изыскании новых вероятных лекарственных препаратов с заданным типом фармакологического действия. В этой связи, значительную роль играет взаимное превращение этих структурных элементов в составе более сложных молекул при направленном конструировании биологически активных соединений и структурной оптимизации веществ-лидеров, основанных на принципах биоизостерической замены, трехмерного фармакофорного подобия и варьирования гидрофильно-липофильного баланса молекулы вещества-ли дера. При этом, следует отметить, что основа современных подходов, лежащих в основе взаимной трансформации производных изоцитозина, урацила и 2-тиоурацила, была заложена еще в конце 1890-х начале 1900-х годов [1]. Наибольшая часть известных методов выполнения этих превращений, строится на сочетании реакций нуклеофильного присоединения по кратной связи N1=С2 (механизм AN), с последующим анионоидным отрывом заместителя, находящегося первоначально в положении 2 гетероциклического остова и сопутствующим замыканием кратной связи N1=С2 (механизм E1cb), то есть, протекает по механизму «присоединения-отщепления» (пошаговый вариант реализации), в некоторых случаях обозначаемым в литературе как SN2(5+) или SN2(5") (концертный вариант реализации).

Производные изоцитозина в большинстве случаев сами являются целевыми веществами, имеющими широкое практическое применение, в то время как производные урацила имеют более ограниченное практическое значение и/или используются как полупродукты в синтезе более сложных органических молекул. Наличие в структуре молекул этих веществ неизмененной пептидной группировки 0(O)NH придает исходным соединениям умеренную TV/7-кислотность и обусловливает возможность их прототропной таутомерии (устанавливается динамическое равновесие 4(3Н)- и 4(1Я)-форм этих веществ). Первое свойство особенно важно в контексте рассматриваемых реакций, так как открывает возможность к протонированию нуклеофильной частицы. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению реакционной способности исходного производного пиримидина за счет перехода в анионную форму. В то же время, нуклеофильная частица теряет свою нуклеофильность, что является дополнительным барьером к протеканию целевой реакции. В большинстве физиологически активных производных этого ряда (например, в противовирусных средствах) наибольшее значение представляют именно производные пиримидин-4(3Я)-она с неизмененной пептидной группировкой С4(O)М3H в составе гетероциклического остова молекулы [2; 3].

Превращение Д-алкил-2-тиоурацилов в Л2-арилизоцитозины Это превращение может быть описано следующей общей схемой:

Несмотря на низкую нуклеофильность производных анилина, прямая трансформация 5-этил-2-тиоурацила (R1 = C2H5, R2 = R3 = H) в N2-фенилизоцитозин [4] (Ar = C6H5, R2 = R3 = R4 = H) явилась первым примером реакций замещения серы на азот в С -связи. В то же время, именно производные #2-фенилизоцитозина рассматриваются в настоящее время как ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 последнего поколения и полупродукты их синтеза. Классические работы T.B. Johnson и соавторов [5; 6] описывают прямое взаимодействие производного пиримидина и производного анилина в эквимолярных количествах в отсутствии растворителя при температуре около 100 оС. В то же время, в более поздней работе F.H.S. Curd и F.L. Rose [7] для проведения аналогичных реакций в отсутствие растворителя, рекомендуют значительно более жесткие условия (нагревание при 130 оС в течение 24 часов): 6-метил-N2-(4-метоксифенил)изоцитозин (Ar = 4-CH3OC6H4, R2 = CH3, R3 = R4 = H) был получен таким образом с выходом 89%, исходя из S,6-диметил-2-тиоурацила (R1 = R2 = CH3, R3 = H, I). С данными F.H.S. Curd и F.L. Rose согласуются результаты целого ряда других работ Например, А.В. Еркин и соавторы рекомендуют проводить взаимодействие I с анилином [8] и с пара-толуидином [9] в отсутствие растворителя при 160 оС. Продукты получены с выходом 33% и 54% соответственно.

K. Ozeki и соавторам удалось провести реакцию различных производных анилина с 5-(карбэтокси)-S-метил-2-тиоурацилом (R1 = CH3, R2 = H, R3 = C(O)OC2H5) с количественным выходом в относительно мягких условиях [10]. Реакция с этим производным пиримидина идет в более мягких условиях по сравнению с его аналогом, не содержащим карбэтокси-группы при С5 [11]. Существенно сократить время реакции производного 6-фенил-5-циано-2-тиоурацила с анилином позволяет введение (карбэтокси)метильной группы при атоме серы взамен метильной группы [12] (R1 = CH2C(O)OC2H5, R2 = 3-CH3O-4-C6H5CH2OC6H3, R3 = CN), хотя процесс также проводится при 170 оС, а целевой продукт выделяется с 67%-ным выходом.

Взаимодействие производных 6-бензил-S-метил-2-тиоурацила с различными ариламинами (анилином, 2-, 3-, 4-хлоранилинами, пара-толуидином, 2,6-дифторанилином и а-нафтиламином) в отсутствие растворителя описано A. Mai и соавторами [13; 14]. Реакция проводится в течение 8 часов при температуре 130 170 оС в большом избытке амина. Целевые соединения образуются с выходом 47 64% [13]. В то же время, взаимодействие 6-пропил-S-метил-2-тиоурацила (R1 = CH3, R2 = C3H7, R3 = H) с малонуклеофильным 3-трифторметиланилином, удается провести с хорошим выходом (91%) в отсутствие растворителя лишь при 220 оС [15]. Проведение аналогичных превращений с тем же субстратом, но набором других электронодефицитных анилинов при температуре 160 оС [16-18], приводит к значительному увеличению времени реакции, необходимому для обеспечения нужного уровня конверсии исходного производного пиримидина и несколько снижает выход целевых веществ.

Применение дополнительного растворителя при взаимодействии производных анилина с I впервые было описано F.H.S. Curd и F.L. Rose [7]. Первым растворителем, успешно использованным для проведения этого процесса, явился этилцеллозольв. Из числа других спиртов в качестве растворителей для этой реакции использовался этанол [10; 19] и бутанол [16; 18; 20]. Описано также проведение реакции между сульфаниламидом («белый» стрептоцид) и S-метил-2-тиоурацилом (R1 = CH3, R2 = R3 = H, II) в среде фенола при 170 оС, приводящее к образованию N2-(4-сульфамоилфенил)изоцитозина [21] (Ar = H2NS(O)2C6H4, R2 = R3 = R4 = H).

При проведении реакции II с ароматическими аминами, содержащими в ядре как активирующие, так и дезактивирующие заместители, нашел также применение как растворитель бис(2-метоксиэтиловый) эфир (диглим) [22–27], причем реакция проводилась за 18 часов при 160 оС. В отдельных случаях для проведения аналогичных реакций применялись и другие полярные высококипящие растворители: ДМФА [28; 29] и 1-метилпирролидин-2-он [30], однако серьезных преимуществ применение указанных растворителей не дало. Заметно ускорить протекание указанных реакций аминолиза позволяет использование микроволнового облучения [29; 30], что было, в частности, показано на примере взаимодействия II с 1-метил-4-(4-аминофенил)пиперазином в 1-метилпирролидин-2-оне [30].

Изучение аминолиза 6-(2,6-дигалогенфенил)(метокси)метил-5-метил-N2 нитроизоцитозинов первичными и вторичными алифатическими аминами

При этом, стратегия синтеза основывалась на введении двух метильных групп: взамен атома водорода гидрокси-группы и взамен атома водорода карбокси-группы, с последующим омылением полученных сложных эфиров и выделением целевых кислот в свободном виде.

Попытка метилирования исходных замещенных миндальных кислот 1-3 с использованием диметилсульфата в ацетоне в присутствии безводного карбоната калия [206] не позволила получить целевые эфиры с удовлетворительным выходом и чистотой: в продуктах оставалась примесь метилового эфира соответствующей миндальной кислоты или метилирование происходило по бензильному атому углерода, а не по спиртовой группе. Замена растворителя на безводный ДМФА также не позволила радикально изменить ситуацию. В связи с этим, нами была использована суперосновная система [207] - раствор димсиллития в абсолютном ДМСО (полученный in situ путем взаимодействия абсолютного ДМСО с раствором бутиллития в гексане), а в качестве метилирующего агента – иодистый метил. Такой подход позволил получить целевые вещества с высоким выходом в мягких условиях:

Уже после экстрактивной обработки полученные соединения имели степень чистоты, достаточную для последующих превращений ( 90%). Тем не менее, для дополнительной очистки они были перегнаны при пониженном давлении. Структура полученных веществ была подтверждена данными ГЖХ-МС-анализа. Соответствующие сведения суммированы в таблице ниже.

Следует отметить, что при регистрации масс-спектров полученных соединений в режиме ионизации электронным ударом молекулярный ион практически не регистрировался, в то время как характерным являлся относительно стабильный 2,6-дигалоген-а-метоксибензил-катион. В то же время, достоверно зафиксировать молекулярный ион удалось в условиях химической ионизации.

Запись ИК-спектров для полученных веществ позволила установить, что полоса поглощения, соответствующая карбонильной группе проявляется в области 1769 см"1, не характерной для сложных эфиров карбоновых кислот, но свойственной ангидридам и имидазолидам. Очевидно, такое смещение полосы поглощения в ИК-спектре связано с влиянием метокси-группы в ос-положении по отношению к карбметокси-фрагменту. Таблица 2 - Выход и результаты ГЖХ-МС-спектрометрического исследования новых метиловых эфиров 2,6-дигалоген-О-метилминдальных кислот

Вещество R1 R2 Выход, % Чистота, % (время удержания) Масс-спектр (ионизация электронным ударом, 70 эВ) Масс-спектр (химическая ионизация) 4 F F 86 96.0 (tR = 9.197 мин) 157.1 [М-C(0)OCH3]+ (100) 217.0 [М+1]+ (100), 157.1 [М-C(0)OCH3]+ 5 Cl F 86 98.8 (tR = 11.268 мин) 173.2 [М-C(0)OCH3]+ (100) 233.0 [М+1]+ (100), 173.0 [М-C(0)OCH3]+ 6 Cl Cl 92 99.4 (tR = 13.159 мин) 248.8 [М]+ (7), 191.0 [М-C(O)OCH3]+ (100) 250.0 [М+1]+ (100), 189.1 [М-C(0)OCH3]+ Эффект метокси-группы, в случае полученных веществ, проявляется также и в их реакционной способности: эфиры 4-6 очень легко гидролизовались водной щелочью с образованием солей соответствующих кислот. Выделить свободные кислоты удалось путем нейтрализации и экстрактивной обработки реакционной массы:

Целевые соединения были получены с выходом 98% (7, 9) и 93% (8). Структура полученных веществ была доказана на основании данных Н-ЯМР-спектроскопии, которые суммированы в таблице 3.

Из данных таблицы видно, что характер замещения ароматического ядра оказывает существенное влияние на относительное расположение и характер сигналов отдельных атомов водорода в спектрах Н-ЯМР кислот 7-9. В первую очередь, это проявляется в относительном расположении и мультиплетности сигналов атомов водорода пара-положения ароматического ядра и двух его мета-положений. В случае хлорированных производных 8 и 9, сигналы атомов водорода мета-положений смещены в область более слабых полей, по сравнению с сигналом атома водорода пара-положения. Обратная картина наблюдается в случае 2,6-дифтор-замещенного производного 7. В сторону слабых полей изменяется также и химический сдвиг атома водорода ос-положения при последовательном переходе от соединения 7 к соединению 9. В то же время, химический сдвиг атомов водорода метокси-группы остается практически неизменным, а атома водорода карбоксильной группы - меняется неоднозначно. Таблица 3 - Данные 1Н-ЯМР-спектрального исследования новых 2,6-дигалоген-О-метилминдальных

Полученные кислоты представляют собой твердые вещества, которые могут быть дополнительно очищены перекристаллизацией из петролейного эфира 40-70 или циклогексана, однако, уже после простой экстрактивной обработки они имеют достаточную чистоту для использования в последующих превращениях (это подтверждается данными Н-ЯМР-спектроскопии).

Квантово-химическое исследование механизма реакции аминолиза 6-(2,6 дифторфенил)(метокси)метил-5-метил-N2-нитроизоцитозина циклопентиламином

Из данных таблицы видно, что ЯМР-спектры соответствующих производных имеют набор характерных сигналов. Во-первых, это сигналы атомов водорода трех различных типов метильных группы: двух метилов, входящих в состав изопропиламино-группы (проявляются в виде двойного дуплета в области 0.89–0.96 м.д.), метильной группы в положении 5 пиримидинового гетероцикла (синглетные сигналы высокой интенсивности в области 1.92–1.96 м.д.) и метокси-группы (также синглетные сигналы в области 3.28–3.32 м.д.). Следующая характерная группа сигналов – метиновые атомы водорода. В области сильных полей находятся сигнал атома водорода метиновой группы изопропильного радикала, проявляющийся в форме секстета или более сложного мультиплетного сигнала в области 3.40–3.58 м.д. (причем, сдвиг в область более слабых полей переходит последовательно от 2,6-дихлор- к 2-фтор-6-хлор- и, наконец - 2,6-дифторфенил-змещенному аналогу). В области 5.59–5.91 м.д. проявляется синглетный сигнал бензильного атома водорода, причем, в данном случае, в область сильных полей смещен сигнал у 2,6-дифторфенил-замещенного производного. Наконец, характерным является ансамбль сигналов атомов водорода ароматического ядра. Примечательно, что атом водорода в положении 4 ароматического кольца дает триплетный сигнал в области 7.32 м.д. только у 2,6-дихлор-замещенного производного; в остальных случаях, это – мультиплет в области 7.35–7.42 м.д. Для 2,6-дифторзамещенного соединения атомы водорода мета-положений ароматического ядра дают характерный триплетный сигнал в области 7.03 м.д. В то же время, при переходе к 2-фтор-6-хлор-замещенному аналогу атом водорода расположенный в орто-положении к атому фтора дает триплетный сигнал в области 7.16 м.д. (спин-спиновое взаимодействие с соседним неэквивалентным атомом водорода и атомом фтора), а в орто-положении к атому хлора – дублет в области 7.28 м.д. В случае 2,6-дихлор-замещенного производного оба атома водорода мета-положений бензольного ядра дают характерный дублетный сигнал в области 7.42 м.д. Еще две характерных группы сигналов, которые регистрируются для указанных веществ – это сигналы атомов водородаимино-групп, в состав которых входят эндо- и экзо-циклический атомы азота. Так сигнал атома водорода при экзоциклическом атоме азота проявляется в области 5.82–5.91 м.д. в виде дублета, причем смещается в область слабых полей при увеличении содержания атомов фтора в молекуле. В области 10.42–10.48 характерным синглетом выходит сигнал атома водорода при амидном эндоциклическом атоме азота. Таблица 8 - Основные характеристические сигналы новых производных 6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)-5-метил-#2-пропилизоцитозина в 1Н- и 13С-ЯМР-спектрах

Из представленной таблицы по данным ЯМР-спектрального анализа изомерных 2-(пропиламино)пиримидин-4(3Н)-онов видно, что ряд характерных сигналов претерпевают изменения, по сравнению с 2-(изопропиламино)-замещенными аналогами. В то время, как сигналы атомов водорода метильных групп в положении 5 пиримидинового гетероцикла и метокси-групп - очень похожи как в соединениях 19-21, так и в соединениях 22-24, сигналы соответствующие атомам водорода в алифатическом радикале при атоме N2 имеют серьезные отличия. Так, в веществах 22-24 атомы водорода терминальной метильной группы пропила выходят в области 0.62–0.71 м.д. в виде характерных триплетов. При этом явно ощущается влияние замещения ароматического кольца молекулы: в случае 2,6-дихлор-производного эти сигналы наиболее смещены в сторону сильных полей. Мультиплетами в области 1.16–1.31 м.д. проявляются сигналы атомов водорода центральной метиленовой группы пропильного радикала, в то время как метилен, связанный с экзоциклическим атомом азота регистрируется по мультиплетным (в случае вещества 24 – квадруплетному) сигналам соответствующих атомов водорода в области 2.80–2.97 м.д. Характерные сигналы метиновых атомов водорода в бензильных положениях соединений 19-21 и 22-24 практически идентичны, как по мультиплетности, так и по величине химического сдвига, что не всегда можно сказать о соответствующих сигналах атомов водорода в ароматических ядрах. Сигнал атома водорода положения 4 бензольного ядра выходит четким квинтетом в области 7.40 м.д. в соединении 22 (против мультиплета в той же области для соединения 19). Как в соединении 19, так и в соединении 22 сигналы атомов водорода мета-положениях похожи как по величине химического сдвига, так и по мультиплетности. В остальном, также наблюдаются параллели между соответствующими 2-фтор-6-хлор- и 2,6-дихлор-производными.

Сигналы атомов водорода при экзоциклических атомах азота в случае соединений 22 и 23 проявляются в виде уширенных синглетов в области 6.11–6.12 м.д., которые, при внимательном рассмотрении, оказываются неразрешенными мультиплетными сигналами. В то же время, сигнал соответствующего атома водорода в соединении 24 представляет собой характерный триплет в области 6.07 м.д.

Сигналы атомов водорода при N3 пиримидинового гетероцикла, как в соединениях 19-21, так и в соединениях 22-24 регистрируются в форме синглетов, однако, в последнем случае они смещены на 0.3 м.д. в область более слабых полей. Таблица 9 - Основные характеристические сигналы новых производных 6-(2,6-дигалоген-а-метоксибензил)-5-метил-#2-циклопентилизоцитозина в 1Н- и 13С-ЯМР-спектрах

С точки зрения особенностей ЯМР-спектров, производные N2 циклопентилизоцитозина 25-27 в большей степени напоминают соответствующие производные N2-изопропилизоцитозина 19-21, нежели N2-пропилизоцитозина 22 24. Опуская черты сходства, хотелось бы сразу сказать об основных чертах различия. Во-первых, это частокол мультиплетных сигналов, соответствующих аксиальным и экваториальным атомам водорода двух пар эквивалентных метиленовых групп циклопентанового фрагмента (C2H2 и C5H2, C3H2 и C4H2), укладывающихся в область 1.11–1.77 м.д. Во-вторых, это мультиплетные сигналы атомов водорода метиновых групп первого положения циклопентильных радикалов, находящиеся в области 3.51–3.72 м.д. (в случае соединений 19-21 соответствующие метиновые атомы водорода, как правило, давали секстетные сигналы в области несколько более сильных полей). Также, в более слабую область смещены дублеты, соответствующие атомам водорода при экзоциклических атомах азота.

Исследование анти-ВИЧ-1 активности и цитотоксичности новых производных 6-(2,6-дигалогенфенил)(метокси)метил-5-метилизоцитозина

Точки плавления определялись на приборе Buchi М-565, приведены скорректированные значения от 3 экспериментов. 1H-ЯМР и 13C-ЯМР спектры были записаны на трех различных приборах: Varian Mercury 300 BB (при рабочей частоте 300 МГц, внутренний стандарт - гексаметилдисилоксан), Bruker AC 400 (при рабочей частоте 400 МГц, внутренний стандарт - тетраметилсилан), Bruker AV 600 (при рабочей частоте 600 МГц, внутренний стандарт - тетраметилсилан); значения химических сдвигов (м.д.) приведены относительно внутреннего стандарта. Все вещества подвергались рутинному контролю методом ТСХ и 1H ЯМР (300 МГц). ГЖХ-МС анализ полупродуктов синтеза был выполнен на приборе Varian Saturn 2100. ТСХ-анализ проводился на пластинах с силикагелем и алюминиевой подложкой: Alufolien Kieselgel 60 F254 (Merck DC), Polygram SIL G/UV254 или Alugram Nano-SIL G/UV254 (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG), с проявлением УФ-облучением. В синтезе использовались растворители квалификации х.ч., которые, при необходимости, очищались и абсолютировались согласно стандартным процедурам. Концентрирование реакционных смесей и экстрактов проводилось с использованием ротационного испарителя Heidolph при остаточном давлении около 20 мм.рт. ст. Органические вытяжки осушались сульфатом магния. Результаты элементного анализа, соответствовали расчетным значениям с максимальной погрешностью 0.40%. Все исходные реагенты приобретались в компаниях Lancaster Synthesis, Sigma-Aldrich или TCI Europe. Образцы, приготовленные для изучения физико-химических и биологических свойств, были предварительно высушены в высоком вакууме над P2O5 в течение 20 часов при температуре от 25 до 110 C, в зависимости от точки плавления образца.

Расчеты по теории функционала плотности (DFT) проводились с использованием B3LYP-обменно-корреляционного функционала [210; 211] и стандартного базисного набора 6-311++G [212–215]. Оптимизация геометрии проводилась методом аналитического расчета градиентов по схеме Берни [216]. Природа стационарных точек устанавливалась на основании данных расчета частот нормальных колебаний (матрицы силовых постоянных Гессе). Минимально – энергетические пути реакций (МЭПР) получали при помощи градиентного спуска из переходных состояний в прямом и обратном направлении переходного вектора [217]. Для всех стационарных точек был также проведен NBO-анализ [218; 219]. Учет эффекта растворителя (бутанол) проводился в рамках модели поляризованного континуума [220; 221] (формализм IEFPCM [222]) с полной оптимизацией структурных характеристик, полученных в расчетах для газовой фазы. Все расчеты выполнялись с использованием программного комплекса Gaussian 09 [223]. Визуализация всех рассчитанных структур выполнялась с использованием программы Chemcraft [224].

Метиловые эфиры 2,6-дигалоген-О-метилминдальных кислот. Пример: Рацемический метил О-метил-2-фтор-6-хлорманделат. К 120 мл абсолютного ДМСО в атмосфере сухого аргона, капля за каплей, при охлаждении проточной водой прибавили 55 мл 2.5 М раствора бутиллития (137.5 ммоль) в гексане. После непродолжительного перемешивания к полученной двухфазной системе, по каплям, прибавили раствор 13.46 г (65.8 ммоль) рацемической 2-фтор-6-хлорминдальной кислоты в 30 мл абсолютного ДМСО. Реакционную смесь перемешивали 2 часа при комнатной температуре, охладили ледяной водой и обработали 9.4 мл (21.41 г, 150.8 ммоль) иодистого метила при непрерывном перемешивании. После окончания прибавления иодистого метила реакционную смесь перемешивали еще 1 час и оставили на ночь при комнатной температуре. На следующий день реакционную массу разбавили 350 мл воды, обесцветили мета-бисульфитом натрия и извлекли продукт реакции метил-трет-бутиловым эфиром (3150 мл). Объединенные органические вытяжки промыли водой, насыщенным рассолом и осушили безводным сульфатом магния. После фильтрования от осушителя, раствор выпарили при атмосферном давлении на водяной бане, остатки растворителя удалили при пониженном давлении на кипящей водяной бане и перегнали технический продукт синтеза при пониженном давлении. Т. кип. 109-111 оС (2 мм. рт. ст.). n19D=1.512. Выход -14.65 г (86%). Содержание основного вещества - 98.84%.

Соединения 3 и 6 были получены аналогично. 2,6-Дигалоген-О-метилминдальные кислоты. Пример: Рацемическая 2,6-дихлор-О-метилминдальная кислота. Смесь 10 г (40.1 ммоль) сложного эфира 6 и 100 мл 10%-ного водного раствора гидроокиси натрия (277.3 ммоль NaOH) кипятили при перемешивании с обратным холодильником, с защитой от влаги и углекислоты воздуха, 8 часов. Реакционную массу оставили на ночь при комнатной температуре, а на следующий день – извлекли метил-трет-бутиловым эфиром (325 мл), довели водный раствор до сильнокислой среды прибавлением концентрированной соляной кислоты и экстрагировали продукт реакции метил-трет-бутиловым эфиром (3150 мл). Объединенные органические вытяжки осушили безводным сульфатом магния. После фильтрования от осушителя, раствор выпарили при атмосферном давлении на водяной бане, остатки растворителя удалили при пониженном давлении на кипящей водяной бане. Выход кислоты 9 - 9.25 г (98%). Т. пл. 119-122 оС (из диизопропилового эфира), что соответствует литературным данным [225].

Соединения 7 и 8 были получены аналогично. Для дальнейших превращений использовали технические продукты, чистота которых ( 95%) была подтверждена методом 1Н-ЯМР-спектроскопии.

Хлорангидриды 2,6-дигалоген-О-метилминдальных кислот. Пример: Рацемический 2-фтор-6-хлор-О-метилманделоилхлорид. Смесь 100 мл (165.5 г, 1.39 моль) хлористого тионила (очищенного последовательным кипячением и перегонкой сначала – с хинолином [226], а затем – с льняным маслом [227]), 11.1 г (50.8 ммоль) кислоты 8 и каталитического количества абсолютного ДМФА, выдержали при комнатной температуре 48 часов с защитой от влаги, отогнали хлористый тионил при нормальном, а затем пониженном давлении, и использовали оставшийся в кубе технический хлорангидрид без дополнительной очистки. Выход хлорангидрида 11 - практически количественный.

Р-Кетоэфиры (этиловые эфиры 4-(2,6-дигалогенфенил)-2-метил-4-метокси-3-оксобутановых кислот). Пример: у-(2-Фтор-6-хлорфенил)-а-метил-у-метоксиацетоуксусный эфир. К раствору 14.85 г (101.7 ммоль) 2-метил-З-оксо-3-этоксипропановой кислоты в 75 мл абсолютного ТГФ, при охлаждении проточной водой и перемешивании, с защитой от влаги и углекислоты воздуха, прибавили по каплям раствор реактива Гриньяра, полученный из 6.79 г (-283 мг-атом) магния и 24 мл (31.44 г, 255.6 ммоль) бромистого изопропила в 125 мл абсолютного ТГФ. По окончании прибавления раствора реактива Гриньяра полученную смесь перемешивали еще 15-20 минут, охладили до -8оС в бане изо льда с солью, и обработали раствором хлорангидрида 11 (полученного, как описано выше) в 50 мл абсолютного ТГФ при перемешивании. После окончания прибавления раствора хлорангидрида реакционную массу перемешивали еще 1 час в охлаждающей бане, после чего баню удалили. Далее реакционную массу перемешивали до тех пор, пока ее температура не достигнет комнатной и еще 1 час при комнатной температуре. Полученный раствор охладили ледяной водой, обработали при перемешивании 110 мл 12%-ной соляной кислоты и извлекли метил-трет-бутиловым эфиром (3200 мл). Органические вытяжки отмыли от кислот 10%-ным водным раствором поташа (при разделении фаз смесь фильтровали на воронке Бюхнера для удаления небольшого количества осадка карбоната магния), промыли водой (до нейтральной реакции на лакмус) и осушили безводным сульфатом магния. Осушитель отфильтровали на воронке Шотта, фильтрат выпарили при атмосферном давлении на водяной бане, остатки растворителя удалили при пониженном давлении на кипящей водяной бане. В остатке был получен чистый ( 95% по ГЖХ-МС) целевой Р-кетоэфир 14. Выход -15.20 г (99%).