Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Синтез и биологическая активность n замещенных производных пиримидин-2,4(1н,3н)-диона (литературный обзор) 12
1.1. Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N-алкильные
заместители 13
1.2. Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N алкенильные и N-алкинильные заместители 18
1.3. Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N-бензильные заместители 22
1.4. Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N-арильные заместители 25
1.5. Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N-гидрокси-, N-алкокси- и N-феноксиалкильные заместители 28
1.6. Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N-гетероциклические заместители 34
1.7. Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N-ацетамидные заместители 37
Глава 2. Синтез N-ацетамидных производных 6 метилпиримидин-2,4(1н,3н)-диона, содержащих тиетановый, оксо- и диоксотиетановые циклы (обсуждение результатов) 41
2.1. Синтез исходных соединений 42
2.2. Синтез N1-ацетамидных производных 6-метил-3-(тиетан-3 ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 46
2.2.1. Синтез N1-(аминооксоэтил)производных 6-метил-3-(тиетан-3 ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона
2.2.2. Синтез N1-ацетанилидпроизводных 6-метил-3-(тиетан-3 ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 51
2.2.3. Синтез гидразонов на основе 6-метил-3-(тиетан-3-ил)пиримидин 2,4(1Н,3Н)-диона, содержащего N-(4-ацетилфенил)ацетамидный заместитель 57
2.3. Синтез N1-ацетамидных производных 6-метил-3-(1-оксотиетан-3 ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 62
2.3.1. Синтез N1-(аминооксоэтил)производных 6-метил-3-(1-оксотиетан-3 ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 63
2.3.2. Синтез N1-ацетанилидпроизводных 6-метил-3-(1-оксотиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 65
2.3.3. Синтез гидразонов на основе 6-метил-3-(1-оксотиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона, содержащего N-(4-ацетилфенил)ацетамидный заместитель 69
2.4. Синтез N1-ацетамидных производных 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6 метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 73
2.4.1. Синтез N1-(аминооксоэтил)производных 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6 метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 74
2.4.2. Синтез N1-ацетанилидпроизводных 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6 метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 77
2.4.3. Синтез гидразонов на основе 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6-метил пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона, содержащего N-(4-ацетилфенил)ацетамидный
заместитель 81
Глава 3. Экспериментальная часть 86
3.1. Методики синтеза исходных соединений 87
3.2. Методики синтеза N1-ацетамидных производных 6-метил-3-(тиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 92
3.3. Методики синтеза N1-ацетамидных производных 6-метил-3-(1 оксотиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 102
3.4. Методики синтеза N1-ацетамидных производных 3-(1,1-диоксотиетан-3 ил)-6-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 110
Глава 4. Оценка биологической активности n ацетамидных производных 3-(тиетан-3-ил)-, 3-(1 оксотиетан-3-ил)- и 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6 метилпиримидин-2,4(1н,3н)-дионов 121
4.1. Оценка психотропной активности 122
4.2. Оценка противомикробной и противогрибковой активностей 130
4.3. Оценка антиоксидантной активности 132
4.4. Оценка цитотоксичности 136
Выводы 139
Список литературы
- Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N алкенильные и N-алкинильные заместители
- Синтез N1-(аминооксоэтил)производных 6-метил-3-(тиетан-3 ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона
- Методики синтеза N1-ацетамидных производных 6-метил-3-(тиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона
- Оценка противомикробной и противогрибковой активностей
Введение к работе
Актуальность и степень разработанности темы диссертационного
исследования. Создание новых высокоэффективных отечественных
лекарственных средств путем модификации природных и синтетических соединений с широким спектром биологической активности является приоритетным направлением органической и медицинской химии. Среди обширных классов органических соединений особое место занимают гетероциклические соединения, в частности пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионы.
Пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионовый фрагмент является составной частью важных в физиологическом отношении соединений (нуклеотидов, витаминов, коферментов), играющих существенную роль в процессах жизнедеятельности организма, а также является структурной основой лекарственных средств широко применяемых в медицине в качестве препаратов, проявляющих противоопухолевую (фторурацил, фторафур), противовирусную (зидовудин, иодуксидин, фосфазид), регенерирующую и противовоспалительную (6-метилурацил), гипотензивную (урапидил) активности и многие другие.
Несмотря на множество исследований по разработке методов синтеза и
изучению биологической активности N-производных пиримидин-2,4(1Н,3Н)-
дионов ненуклеозидной природы, синтезу N-гетерилзамещенных пиримидин-
2,4(1Н,3Н)-дионов посвящено незначительное количество публикаций. В
литературе встречаются сообщения о синтезе (тиетан-2-ил)производных
тимина. В Башкирском государственном медицинском университете были
исследованы реакции производных пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона с 2-
хлорметилтиираном и изучены некоторые химические (реакции
аминометилирования, алкилирования и окисления), а также биологические
свойства продуктов N-тиетанилирования.
Однако до настоящего момента тиетансодержащие пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионы остаются не до конца исследованными соединениями, синтетический потенциал которых не исчерпан и представляет интерес для дальнейших исследований.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России по проблеме «Изыскание и изучение новых лекарственных средств» № государственной регистрации 01200707996.
Целью данной работы является разработка эффективных методов синтеза N-ацетамидных производных 6-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона, содержащих тиетановый, оксо- и диоксотиетановые циклы, изучение их биологических свойств и создание на их основе высокоэффективных биологически активных веществ.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Синтез N1-(аминооксоэтил)- и N1-ацетанилидпроизводных 3-
(тиетан-3-ил)-, 3-(1-оксотиетан-3-ил)- и 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6-
метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионов на основе алкилирования 2-
хлорацетамидами и 2-хлорацетанилидами.
2. Получение гидразонов путем взаимодействия N-(4-
ацетилфенил)ацетамидных производных 3-(тиетан-3-ил)-, 3-(1-оксотиетан-3-
ил)- и 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионов с
гидразином и его производными.
3. Установление структуры и возможных изомеров N-ацетанилидных
производных 6-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона, содержащих тиетановый,
оксо- и диоксотиетановые циклы, и гидразонов с применением современных
физико-химических методов анализа (РСА, двумерная спектроскопия ЯМР).
4. Проведение биологического скрининга впервые синтезированных N-
ацетамидных производных 6-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона, содержащих
тиетановый, оксо- и диоксотиетановые циклы, и установление некоторых
закономерностей «структура-активность».
Научная новизна. Впервые осуществлен синтез N1-(аминооксоэтил)- и
N1-ацетанилидпроизводных 3-(тиетан-3-ил)-, 3-(1-оксотиетан-3-ил)- и 3-(1,1-
диоксотиетан-3-ил)-6-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионов в реакциях
алкилирования с 2-хлорацетамидами и 2-хлорацетанилидами.
Установлено, что синтезированные тиетанилпиримидиндионы,
содержащие N-(4-ацетилфенил)ацетамидный заместитель, вступают в реакции
конденсации с гидразином и его производными с образованием
соответствующих гидразонов только в присутствии каталитических количеств кислот.
Показана устойчивость тиетанового, оксо- и диоксотиетановых циклов в
реакциях алкилирования и конденсации. Доказано, что при взаимодействии 6-
метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона с 2-хлорметилтиираном тиетанилирование
идет по положению N3 пиримидинового цикла. Выявлено, что
оксотиетаносодержащие производные существуют в виде смеси цис- и трансизомеров с преобладанием цис-изомера.
Впервые показано, что полученные N1-ацетанилидные производные 6-
метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона, содержащих тиетановый, оксо- и
диоксотиетановые циклы, существуют в одной пространственной форме Z-
конформера в твердой фазе, а в растворе ДМСО либо в форме Z-конформера,
либо в смеси у Е- и Z-конформеров в зависимости от строения анилидного
фрагмента. Показано, что гидразоны существуют в одной пространственной
форме Е’С=N,ZN–C=O-изомера.
Установлено, что антимикробная, противогрибковая и антиоксидантная активности зависят от строения ацетанилидного фрагмента, а психотропная активность зависит от степени окисления серы в тиетановом цикле.
Практическая значимость. Разработаны эффективные способы синтеза
N-ацетамидных производных 6-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона,
содержащих тиетановый, оксо- и диоксотиетановые циклы, и гидразонов на
основе 3-(тиетан-3-ил)-, 3-(1-оксотиетан-3-ил)- и 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6-
метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионов, содержащих N-(4-
ацетилфенил)ацетамидный заместитель.
Предложен технологический способ синтеза 2-хлорацетамидов,
заключающийся в ацилировании вторичных алициклических аминов 2-
хлорацетилхлоридом и позволяющий получить 2-хлорацетамиды в
кристаллическом виде с высокой степенью чистоты без дополнительной
очистки.
Показана возможность использования метода двумерной спектроскопии NOESY и ROESY для установления пространственных форм ацетанилидов и гидразонов.
По результатам биологических испытаний среди впервые
синтезированных соединений выявлены вещества с выраженными
психотропной, антиоксидантной, антимикробной, противогрибковой
активностями; а также цитотоксичностью в отношении клеток опухолевого происхождения (НерG2).
Результаты научных исследования внедрены в учебный процесс кафедры общей химии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России в дисциплины по выбору «Теоретические основы методов исследования строения химических соединений» и «Углубленный курс органической химии» при проведении
практических занятий со студентами 1-2 курсов специальности 33.05.01 «Фармация».
Разработан лабораторный регламент на способ синтеза N-(4-ацетилфенил)-2-[6-метил-2,4-диоксо-3-(тиетан-3-ил)-1,2,3,4-тетрагидропирими-дин-1-ил]ацетамида (ЛР 01963597–09.01–15) – перспективного синтона в органическом синтезе.
Методология и методы решения поставленных задач.
Методологическую основу исследования составили работы зарубежных и
российских ученых в области синтеза и исследования биологической
активности производных пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона. Для решения
поставленных задач были использованы современные методы и примы синтетической химии. Структуры соединений доказаны комплексным использованием спектральных методов – ИК спектроскопии, спектроскопии ЯМР 1Н, 13С, 15N, 2D ЯМР, рентгеноструктурного анализа.
Достоверность представленных результатов обеспечивалась
определенным набором физико-химических и биологических методов
исследования. Структура синтезированных соединений подтверждена
современными физико-химическими методами. Результаты биологического исследования получены на достаточно большом количестве повторений. Все результаты обработаны методом математической статистики и являются достоверными.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены и обсуждены на IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии (Уфа-Абзаково, 2013), первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013), четырнадцатой Всеукраинской конференции с международным участием студентов и аспирантов «Современные проблемы химии» (Киев, 2013), III Всероссийской конференции по органической химии «ОргХим-2013» (Санкт-Петербург, 2013), третьей Международной научной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Пятигорск, 2013), VI молодежной конференции ИОХ РАН посвященной 80-летию со дня основания ИОХ РАН (Москва, 2014), IV Всероссийской научной молодежной школе-конференции «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (Омск, 2014), XV Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Химия и химическая технология»
(Томск, 2014), XVII молодежной школе-конференции по органической химии (Екатеринбург, 2014), третьей Всероссийской научной конференции с международным участием «Успехи синтеза и комплексообразования» (Москва, 2014).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 19 работ, в том числе 1 патент РФ, 12 статей (из них 3 в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России) и 6 тезисов докладов на международных и всероссийских научных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальная часть, оценка биологической активности), выводов и списка литературы, включающего 153 источника отечественных и зарубежных работ. Общий объем диссертации составляет 156 страниц машинописного текста, содержит 10 таблиц, 29 рисунков, 68 схем.
Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N алкенильные и N-алкинильные заместители
TV-Алкенил- и TV-алкинилзамещенные производные пиримидин-2,4(1Н,ЗН дионов синтезируют аналогично алкилпроизводным: алкенилгалогенидами, гидрикси- и ацилсодержащими непредельными соединениями. Так, реакцией урацила с цис-1,4-дихлорбутен-2-ом в ДМФА и присутствии К2СОз получена смесь Л -моно- и 7V1 Д3-дизамещенных продуктов [23] (схема 1.12).
В этой же работе описано алкилирование #3-бензоилурацила транс-\,А-дихлорбутен-2-ом в аналогичных условиях, но при температуре 60 С. Алкилирование #3-бензоилурацила цис-1,4-дихлорбутен-2-ом осуществлено в присутствии основного агента NaH. Удобным способом синтеза алкенил- и алкинилзамещенных является использование в качестве основания ДБУ [5]. Алкилирование С5,С6 дизамещенных пиримилин-2,4-дионов 1-бром-3-метилбутен-2-ом протекает с образованием соответствующих N1-алкенил- и N1,N3-диалкенилзамещенных продуктов (схема 1.13). Выходы продуктов 55-60 не превышает 20%.
Реакцией урацила и 5-фторурацила с 2-4-хлорбутен-2-ил- и Е-4-бромбутен-2-ил-производными фталимида в ДМФА и присутствии К2СО3 получены N1-алкенилпроизводные пиримидин-2,4-диона с выходами 45-71% [25] (схема 1.15). Исследование противовирусной и цитотоксической активностей выявило наличие у синтезированныех соединений слабой активности.
В продолжение исследований реакций 2-4-хлорбутен-2-ил- и Е-4-бромбутен-2-ил-производных фталимида с пиримидин-2,4-дионами, в работе [26] осуществлен синтез 5-иодурацила с данными алкилирующими агентами в аналогичных условиях, которые показали некоторую анти-ВИЧ-1 и анти-ВИЧ-2 активности, а также оказались цитотоксичными в отношении клеток гепатоцеллюлярной карциномы.
Синтез алкенилсодержащих пиримидин-2,4(1Н,ЗН)-дионов осуществляется также с использованием ацилсодержащих реагентов. Так, реакцией N3-бензоилтимина 35 с винилацетатом в среде аргона в присутствии 3-кратного избытка Na2PdCl4 синтезирован Л -бензоил-Л -винилтимин 66 с выходом 74% [27] (схема 1.16).
Реакцией О-ацетилпроизводных L-аскорбиновой кислоты с силилированным 5-иодурацилом в ацетонитриле осуществлен синтез N1-алкенилзамещенных продуктов, содержащих остаток аскорбиновой кислоты [28]. Одно из соединений обладают высокой противоопухолевой активностью.
Взаимодействием урацила и тимина с 2-кратным избытком пропаргилбромида в присутствии эквимольного количества К2СО3 получена соответствующая смесь N1-алкинил- и N1,N3-диалкинилзамещенных продуктов в соотношении примерно 1:1 [29] (схема 1.17).
Аналогичным способом осуществлена конденсация #3-бензоилзамещенного тимина с производным 2-фторпентен-2-диола по реакции Мицунобу с образованием соответствующего Л -алкенилзамещенного бензоилтимина с выходом 72% [32]. 1.3. Синтез производных пиримидин-2,4-дионов, содержащих N-бензильные заместители Синтез N-бензилзамещенных, как незамещенных, так и силилированных производных пиримидин-2,4-дионов, осуществляется с использованием бензилгалогенидов различного строения в присутствии карбонатов или гидридов щелочных металлов. Авторами в работе [33] приведены результаты взаимодействия 6-хлорурацила с бензилбромидом. Синтез протекает в ДМФА и присутствии К2CO3, выход образовавшегося N1-бензил-6-хлорурацила составляет 55% (схема 1.19). Последующая обработка продукта гидрокси-3,5 диметилбензилом в присутствии PPh3 и DIAD приводят к образованию N1,N3-дибензилзамещенного 6-хлорурацила 76 с выходом 86%.
Аналогичными способами получены различные N1-моно-, N3-моно- и N1,N3 дибензилзамещенные продукты 5-галогенпроизводных урацила [34]. В реакциях использованы различные 2-хлор-, 4-хлор-, 2,4-диметил- и 2,5 диметилбензилхлориды. N-бензилзамещенные производные 6-хлорурацила также получены действием -бром-о-толунитрила в смеси ДМФА-ДМСО (6:1) в присутствии NaH и LiBr с выходом 54% [35] (схема 1.20). Схема 1.20
Реакцией 3,5-дихлорбензилхлорида с 5-фторурацилом в бензоле в присутствии водного раствора NaOH и каталитических количеств ВщМЗг получен Л -бензилзамещенный 5-фторурацил [36]. В аналогичных условиях при действии на 5-фторурацил 3,4-дихлорбензилхлорида образуется N\N3-дизамещенный 5-фторурацил.
Л -Бензилзамещенные производные пиримидин-2,4-дионов получены при действии на #3-бензоилзамещененные производные тимина и урацила 4-иодбензилбромидом в ДМФА и присутствии К2СОз [37]. Последующая обработка продуктов 78 и 79 36%-ным раствором аммиака в метаноле приводит к образованию Л -монозамещенных производных тимина и урацила 80 и 81 (схема 1.21).
При аналогичных условиях реакцией 7V1-замещенного урацила с бензилбромидом получен дизамещенный урацил, содержащий в положении 3 бензиловый заместитель, с выходом 90% [38]. При таких же условиях получены Л Д3-дизамещенные производные урацила при действии на N1-алкенилзамещенные урацилы различными бензилгалогенидами, содержащих хлор- и бромалкилильные остатки, с выходами 73-81% [24]. Реакция N1-защищенного урацила с бензилбромидом, содержащем в положении 2 диэтилфосфатный остаток, в ДМФА, но в присутствии NаH, синтезировано N1 Д3-дизамещенное производное урацила [39]. Взаимодействием N3-алкенилзамещенного 6-метилпиримидин-2,4-диона с 2,6-дифторбензилбромидом в присутсвии (Bu)4NF в смеси ТГФ-ДМФА (1:1) осуществлен синтез Л Д3-дизамещенного продукта с выходом 59% [40]. При действии на 7V1-замещенный 585 С
Синтез N1-(аминооксоэтил)производных 6-метил-3-(тиетан-3 ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона
Соединения 26-34 представляют собой кристаллические порошки, растворимые в ДМСО, ДМФА, при нагревании в низших спиртах, ацетоне, ацетонитриле, не растворимы – в гексане, воде. Строение полученных соединений 26-34 подтверждено ИК-спектроскопией, спектроскопией ЯМР 1Н-, 13С- и 15N, а также РСА. Как известно, амиды за счет двоесвязности амидной связи могут существовать в виде двух плоских Z,E-конформаций, у ациланилидов необходимо учитывать также объем заместителей и ряд факторов, обусловленных взаимодействием ациламиногруппы с ароматическим ядром [120].
В спектрах ЯМР 1Н соединений 26, 29, 32, 33 содержится один набор резонансных сигналов, что свидетельствует о существовании их в растворе ДМСО-d6 в одной пространственной форме.
В спектрах наблюдаются сигналы протонов метильной группы, сигнал протона при атоме углерода С5 пиримидинового цикла и тиетанового фрагмента в характерных областях. Сигнал протонов остатка уксусной кислоты проявляется в интервале 4,66-4,76 м.д. с интенсивностью 2Н в виде синглета. В спектре соединения 29 (рисунок 2.5) регистрируется сигнал протонов еще одной метильной группы, принадлежащего остатку о-толуидина, а в спектре соединения 33 – сигнал метильной группы, принадлежащего ацетильному фрагменту. Химические сдвиги протонов бензольного кольца наблюдаются в характерных областях. Уширенный синглет с интенсивностью 1Н в области 9,74-10,76 м.д. отнесен к NH-группе амидной связи в структуре соединений. Для установления пространственной формы полученных N1-ацетанилид-замещенных 6-метил-3-(тиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона был проведен рентгеноструктурный анализ соединения 32, в спектре ЯМР 1Н которого содержится один набор резонансных сигналов. На основании данных РСА N-(2,4-дихлорфенил)-2-[6-метил-3-(тиетан-3-ил)- 2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропирими-дин-1-ил]ацетамид существует в форме Z-изомера (рисунок 2.6).
Пространственная форма N-ацетанилидов 29 и 33 установлена также по анализу 2D корреляционных спектров ROESY. Поскольку протон при амидном атоме азота близок в пространстве с метиленовыми протонами ацето-группы, то наличие ЯЭО-корреляции между ними дает возможность утверждать, что полученные N-ацетанилиды имеют структуру Z-конформера (рисунок 2.7).
В спектре ЯМР 1Н соединения 27, содержащий п-толуидиновый фрагмент наблюдается удвоение резонансных сигналов протонов заместителей при амидной связи, что связано с проявлением характерной конфирмационной E,Z-изомерии ацетанилидов. Сигналы изомеров в спектре соединения 27 были отнесены на основании РСА и анализа спектров Z-изомеров соединений 26, 29, 32 и 33. Рисунок 2.7. Спектр 1Н-1Н ROESY и схема ЯЭО-корреляций соединения 29
Сигналы протонов двух метильных групп Z-изомера регистрируются при 2,18 и 2,25 м.д., а Е-изомера – при 2,12 и 2,35 м.д. Сигнал протона при атоме углерода С5 пиримидинового цикла также расщеплен и проявляется в виде двух синглетов при 5,63 м.д. (Z-изомер) и 5,68 м.д. (Е-изомер). Сигналы протонов остатка уксусной кислоты Е-изомера наблюдаются в виде двух несимметричных дублетов c центрами при 4,38 м.д. (СНА) и 4,41 м.д. (СНВ) с геминальной КССВ около 11 Гц; сигналы протонов Z-изомера регистрируются в виде синглета при 4,64 м.д. Ароматические протоны бензольного кольца имеют вид двух дублетов: сигналы протонов в положении 3, 5 удвоены и резонируют при 7,13 и 7,32 м.д. (КССВ 8,1 Гц), сигналы протонов в положение 2, 6 проявляются в виде одного дублета при 7,46 м.д. (КССВ 8.1 Гц). Уширенные синглеты при 10,35 м.д. (Е-изомер) и 9,94 м.д. (Z-изомер) говорят о наличие амидной группы в структуре соединения 27. В спектре также проявляются сигналы протонов тиетанового цикла в характерных областях. Z-изомер является преобладающим в смеси изомеров, соотношение которых вычислено по интегральным интенсивностям и составляет 8:1 (рисунок 2.8).
Методики синтеза N1-ацетамидных производных 6-метил-3-(тиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона
Задачей этого раздела исследования была разработка методов синтеза гидразонов, содержащих в илиденовом фрагменте диоксотиетанпиримидин.
Гидразоны 73, 74 с выходами 48-65% получены при кипячении эквимольных количеств реагентов в спирте в присутствии каталитических количеств уксусной кислоты (схема. 2.19).
Семикарбазон 75 синтезирован взаимодействием соединения 72 с гидрохлоридом семикарбазида. Реакцию проводили в присутствии двукратного избытка ацетата натрия, необходимого для связывания хлороводородной кислоты. Конденсация соединения 72 с тиосемикарбазидом при кипячении в спирте в присутствии каталитических количеств серной кислоты приводит к образованию гидразона 76 с выходом 76%. При кипячении N-ацетанилида 72 с эквимольным количеством изониазида и 1,2-кратного избытка ледяной уксусной кислоты был синтезирован гидразон 77 с выходом 59%.
Соединения 73-77 представляют собой кристаллические порошки, растворимые в ДМФА, ДМСО, при нагревании в низших спиртах, не растворимы в хлороформе, гексане и воде.
В спектрах ЯМР 1Н соединения 73 и 74 (рисунок 2.26), снятых в DMSO-d6, наблюдаются сигналы протонов двух метильных групп, протона С5–Н пиримидинового цикла и остатка уксусной кислоты. Сигналы протонов диоксотиетанового цикла проявляются в виде мультиплетов: c интенсивностями по 2Н в областях 4,30-4,38 и 4,83-4,91 м.д. фрагмента S(CH)2 и с интенсивностью 1Н при 6,63-6,72 м.д. фрагмента NCH. Сигналы ароматических протонов одного фенильного заместителя проявляются в характерных областях. В спектре соединения 73, помимо сигнала протона амидной связи при 10,45 м.д., проявление еще одного уширенного синглета с интенсивностью 1Н при 9,20 м.д. следует отнести к фрагменту =N–NH, что доказывает образование соответствующего гидразона. Сигналы протонов амидной группы проявляются в виде уширенного синглета с интенсивностью 1Н при 10,40 м.д. и аминогруппы –NH2 при 6,28 м.д. в виде уширенного синглета с интенсивностью 2Н.
В спектрах ЯМР 1Н соединений 75 и 76, снятых в DMSO-d6, регистрируются все сигналы протонов 6-метилпиримидинового цикла, диоксотиетанового цикла, остатка уксусной кислоты, амидной связи CONH, а также метильной группы остатка ацетамидного фрагмента. В спектре соединения 75 сигналы протонов ароматического кольца проявляются в виде двух дублетов с интенсивностями по 2Н с центрами при 7,58 и 7,82 м.д. и КССВ 8,8 Гц. Сигналы протонов NH2 амидной группы проявляются при 6,46 м.д. в виде уширенного синглета с интенсивностью 2Н. В спектре соединения 76 ароматические протоны также проявляются в виде двух дублетов с центрами при 7,60 и 7,93 м.д. и КССВ 8,7, 8,6 Гц, соответственно, а сигналы протонов NH2 амидной группы в виде двух сигналов при 7,93 м.д. (вместе с ароматическими) и при 8,25 м.д. в виде уширенного синглета с интенсивностью 1Н.
Пространственная форма гидразонов 73 и 74 установлена на основании коореляционных спектров ROESY (рисунок 2.27).
Сигналы атомов углерода в спектре ЯМР 13С соединения 73 и 74 отнесены на основании DEPT-90- и DEPT-135-редактирования и методов двумерной гетероядерной 1Н-13С HSQC и 1Н-13С HMBC спектроскопии. Спектры ЯМР 13С соединениий 73-75, снятых в DMSO-d6, содержат характерные сигналы атомов углерода 6-метилпиримидинового цикла, диоксотиетнового цикла и N-ацетанилидного фрагмента. Сигнал атома углерода в азометиновой связи С=N проявляется в интервале 141,72-146,03 м.д. В спектре соединения 74 содержатся также сигналы атомов углерода фенильного заместителя в характерных областях, а спектр соединения 75 содержат также сигнал атома углерода фрагмента С=О остатка семикарбазида при 157,25 м.д.
В проекциях F1 со шкалой 15N в спектрах 1H-15N HSQC и 1H-15N HMBC соединений 73 и 74 помимо трех сигналов атомов азота, характерного для исходного 72, проявляются еще два сигнала, которые были отнесены нами к сигналам атомов азота остатков фенилгидразина (73) и гидразина (74).
В ИК спектрах соединений 73-77 имеются полосы поглощения валентных колебаний связей С=О, С=С в области 1708-1559 см-1, связей C–N в области 1477-1410 см-1, а также полосы поглощений валентных колебаний связей С–Н в области 3042-2971 см-1. Полосы поглощения при 3426-3247 см-1 отвечают валентым колебаниям связей NH, а при 1543-1517 см-1 деформационным колебаниям связей NH (амид II). Также в спектрах содержатся валентные колебания связей О=S=О диоксотиетанового цикла при 1322-1308 см-1 (асимметричные) и 1155-1137 см-1 (симметричные).
Таким образом, разработана методика синтеза N-ацетанилидзамещенных производных 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона. Показана перспективность использования N-(4-ацетилфенил)-2-[3-(1,1 диоксотиетан-3-ил)-6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-1-ил]ацет амид в качестве синтона для синтеза гидразонов различного строения. Изучены физико-химические характеристики синтезированных соединений, установлено строение методами одномерной и двумерной спектроскопии. Методами ЯМР 1Н и ROESY установлена пространственная структура гидразонов 2-[3-(1,1 диоксотиетан-3-ил)-6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-1-ил]-N-{4-[1-(2-фенилгидразон)этил]-фенил}ацетамида и N-[4-(1-гидразиноэтил)фенил]-2-[3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-1-ил]-ацетамида.
Оценка противомикробной и противогрибковой активностей
В группах животных, которым внутрибрюшинно вводили суспензию соединений 33 и 72 в дозе 1/10 от м.м., на 65% и 100% отмечалось снижение времени пребывания в светлом отсеке и на 5,5 % и 9,5 %, соответственно увеличение времени пребывания животных в темном отсеке по сравнению с контролем, но статистически незначимо. Такое изменение поведения может быть связано с седацией из-за большой дозы вводимых веществ, что подтверждают результаты теста «открытое поле».
В группе животных, которые получали суспензию 53 в дозе 1/200 от м.м., в 6 раз снижалось время пребывания в светлом отсеке, что может свидетельствовать об анксиогенном действии вещества 53, однако в тесте «открытое поле» соединение 53 в дозах 1/10 и 1/200 увеличивало количество заходов в центральный отсек открытого поля. Т.о. в данном случае нельзя сделать однозначный вывод о действии вещества 53. Остальные исследуемые соединения в данном тесте поведение животных не изменяли. Т.о. учитывая полученные результаты, веществ, проявляющих выраженную анксиолитическую активность, не обнаружено.
В тестах «вращающийся стержень» и «вертикальный экран-сетка» (таблица 4.4) время удерживания животных опытных групп во всех сериях эксперимента оставалось на уровне контрольных значений, что составило 180 секунд. Значит вещества 33, 38, 53, 57, 73, 76 не обладают нейротоксичностью и миорелаксирующим действием.
В тесте «подвешивание мышей за хвост» по сравнению с контрольными животными соединения 27, 67, 21, 63, 71 на 27, 61, 31, 32 и 62% недостоверно уменьшают время иммобилизации. В тесте «принудительное плавание по Парсольту» данные соединения проявляют тенденцию к увеличению времени иммобилизации. Время иммобилизации в опытных группах, которым внутрибрюшинно вводили суспензию веществ 33, 72, 53, 76, 57, оставались на уровне контрольных значений (таблица 4.5).
В таблице приведены медиана и межквартильный размах Me [25%;75%], - различия достоверны по сравнению с контролем ( р 0.05 для U-критерия Манна-Уитни) Анализируя полученные результаты установлено, что, среди изученных соединений, веществ с антидепрессивной активностью, не обнаружено. Таким образом, в тесте «открытое поле» соединение N-{4-[1-(2 карбамотиоилгидразоно)этил]фенил}-2-[6-метил-2,4-диоксо-3-(тиетан-1-ил) 1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил]ацетамид (38) в дозе 1/10 от м.м. оказало седативное действие. В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт», соединение 2-[3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро пиримидин-1-ил]-N-м-толилацетамид (67) в дозе 1/10 от м.м. проявляет анксиогенное действие. В тесте «вращающийся стержень» и «вертикальный экран-сетка» установлено, что изучаемые соединения не обладают нейротоксичностью и миорелаксирующим действием. В тесте «подвешивание за хвост» и «принудительное плавание по Порсольту», веществ с антидепрессивной активностью, не обнаружено. Соединения N-{4-[1-(2 карбамотиоилгидразоно)этил]фенил}-2-[6-метил-2,4-диоксо-3-(тиетан-1-ил) 1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил]ацетамид (38) и 2-[3-(1,1-диоксотиетан-3-ил) 6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-1-ил]-N-м-толилацет-амид (67) рекомендовано к дальнейшему углубленному изучению психотропной активности.
Противомикробная и противогрибковая активности была определены на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунология ГБОУ ВПО БГМУ под руководством д.м.н., профессора Булгакова А.К. Оценку противомикробной активности проводили для следующих соединений: 24, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 38, 53, 56, 57, 67, 68, 70, 72, 73, 74, 75, 76. Определение проводили методом «диффузии в агар» и десятиратных серийных разведений в питательном бульоне [145]. Для этого использовали раствор, содержащий 50 мг исследуемого соединения в 1 мл мясопептонного бульона, разведенного до рабочей концентрации 10 мг/мл. В ряд культур с последовательными десятикратно убывающими концентрациями исследуемых соединений в бульоне вносили тестовые культуры микроорганизмов, микробная загрузка которых составляла 2.0106 КОЕ/мл. В качестве тест культур использованы депонированные штаммы микроорганизмов в ВНИИТИ с кафедры микробиологии, вирусологии и иммунология ГБОУ ВПО БГМУ: E.coli, P.vulgaris, K.pneumonia, St.aureus, C.diversus, Ent.aergogenes, Ps.aeroginosa, Serratia abosit и низших грибов - С. аlbicans. Посевы инкубировались при 37 С в течении 72 ч., при 25 С – 48 ч. О наличии противомикробной активности судили по отсутствию роста культур через 1, 2, 3 и 5 суток. Для определения бактериостатической активности осуществляли дополнительный высев с жидких питательных сред, визуально рост бактерий не регистрировался на мясопептонный агар и пробирки с мясопептонным бульоном. Дополнительно посевы инкубировали при температуре 37С в течении 3 суток с учетом результатов через 24, 48 и 72 часа.