Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор «Флавоноиды. Рутин и кверцетин. Химическая модификация кверцетина» 8
1.1 Общая характеристика флавоноидов 8
1.1.1 Классификация флавоноидов 9
1.1.2 Распространение флавоноидов в природе.. 11
1.1.3 Роль флавоноидов в жизнедеятельности растений и их взаимодействии с окружающей средой 12
1.1.4 Флавоноиды как природные антиоксиданты 14
1.1.5 Другие виды биологической и фармакологической активности флавоноидов 17
1.2 Рутин и кверцетин 20
1.2.1 Способы выделения рутина и кверцетина из растительного сырья 25
1.3 Химические трансформации кверцетина 28
1.3.1 Синтез биологически активных эфиров кверцетина 29
1.3.2 Синтез фосфорилированных производных кверцетина 39
1.3.3 Синтез других эфиров кверцетина 41
1.3.4 Модификация колец А и В кверцетина реакцией электрофильного замещения 42
1.3.5 Синтез некоторых природных гликозидов кверцетина 44
1.3.6 Синтез моногликозидов кверцетина 45
1.3.7 Синтез дигликозидов кверцетина 48
ГЛАВА II. Обсуждение результатов 53
2.1 Выделение фенольных соединений из плодовых оболочек (лузги)
гречихи посевной (Fagopyrum Esculentum Moench) 53
2.1.1 Выделение фенольных соединений из лузги гречихи 54
2.1.2 Фракционирование экстракта из лузги гречихи 55
2.1.3 Количественное определение флавоноидов 56
2.1.4 Качественный анализ полифенольных соединений 57
2.1.5 Качественные реакции на флавоноиды 57
2.1.6 Выделение рутина из лузги гречихи 60
2.1.7 Изучение влияния срока хранения лузги гречихи на содержание фенольных соединений и рутина
2.2 Получение кверцетина кислотным гидролизом рутина 63
2.3 Химическая модификация кверцетина 64
2.3.1 Синтез простых эфиров кверцетина 64
2.3.1.1 Синтез и спектральные характеристики метиловых эфиров кверцетина 65
2.3.1.2 Метилирование кверцетина диазометаном 69
2.3.1.3 Синтез других алкиловых эфиров кверцетина 73
2.3.1.4 Синтез и идентификация бензиловых эфиров кверцетина 74
2.3.1.5 Синтез бензиловых эфиров кверцетина в присутствии четвертичной аммонийной соли 80
2.3.2 Синтез сложных эфиров кверцетина 82
2.3.3 Синтез бромпроизводных кверцетина
2.3.3.1 Бромирование кверцетина бромом 84
2.3.3.2 Бромирование кверцетина N-бромсукцинимидом
2.4 Масс-спектры отрицательных ионов производных кверцетина 90
2.5 Биологическая активность производных кверцетина
2.5.1 Гипогликемическая активность эфиров кверцетина in vitro 94
2.5.2 Антиоксидантная активность эфиров кверцетина in vitro 95
2.5.3 Противовирусная активность бромпроизводных кверцетина 96
ГЛАВА III. Экспериментальная часть 98
3.1 Выделение фенольных соединений из плодовых оболочек (лузги)
3.1.1 Экстракция фенольных соединений 99
3.1.2 Количественное определение рутина и кверцетина в экстрактах 100
3.1.3 Качественные реакции на группы фенольных соединений 102
3.1.4 Изучение влияния срока хранения лузги гречихи на содержание фенольных соединений и рутина 104
3.2 Выделение рутина из лузги гречихи 104
3.3 Получение кверцетина кислотным гидролизом рутина 105
3.4 Синтез простых эфиров кверцетина
3.4.1 Синтез метиловых эфиров кверцетина 106
3.4.2 Синтез других алкиловых эфиров кверцетина 110
3.4.3 Синтез бензиловых эфиров кверцетина
3.5 Синтез сложных эфиров кверцетина 115
3.6 Синтез бромпроизводных кверцетина 117
Выводы 121
Принятые сокращения 123
Литература 125
Приложение 1 (справочное).
- Другие виды биологической и фармакологической активности флавоноидов
- Выделение фенольных соединений из лузги гречихи
- Синтез и спектральные характеристики метиловых эфиров кверцетина
- Изучение влияния срока хранения лузги гречихи на содержание фенольных соединений и рутина
Введение к работе
Актуальность работы. Одним из современных подходов в разработке
новых лекарственных препаратов является химическая модификация
доступных биологически активных растительных метаболитов. Флавоноиды –
одна из наиболее многочисленных групп растительных полифенольных
соединений с широким спектром биологической активности (антиоксидантной,
антиканцерогенной, антимикробной, спазмолитической, противоязвенной,
противовоспалительной, противоопухолевой и др.). Известными
флавоноидными препаратами с Р-витаминной активностью являются кверцетин
(КВ) и его гликозид – рутин, которые применяются в медицине для
профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, бронхиальной
астмы, сахарного диабета, а также в качестве антиоксидантов,
гепатопротекторов, противовоспалительных, противоязвенных и
противоопухолевых средств.
Основным сырьем для получения рутина в России является зеленая масса гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Moench) (содержание рутина составляет 2-7%), что выводит часть урожая из товарной сельскохозяйственной продукции. Рутин содержится также в плодовых оболочках (лузге) гречихи (2.2-2.4%), которые до сих пор не находят эффективного использования. В связи с этим, вовлечение в процесс переработки гречихи лузги в качестве дополнительного источника для получения Р-витаминных веществ является актуальной задачей.
КВ (3,5,7,3',4'-пентаоксифлавонол), широко распространенный в
растительном мире, является одним из лидирующих флавоноидов с
антиоксидантной, канцеропревентивной и противоопухолевой активностью,
который вызывает усиленный интерес научного сообщества в последние годы
благодаря доступности и высокой биологической активности (кардио-, гепато-
и радиопротективной, спазмолитической, антитромботической,
мембраностабилизирующей, антивозрастной и др.). Р-витаминная активность
КВ вдвое превосходит рутин, а при некоторых патологиях его лечебные
свойства выше в 4–5 раз. Обнаружена противовирусная активность КВ,
который ингибирует обратную транскриптазу ВИЧ-1. Основной проблемой в
использовании КВ в фармацевтической области является его плохая
растворимость в водных средах и низкая биодоступность. Химическая
модификация КВ является одним из современных подходов для улучшения его
биодоступности и фармакологической активности, а также перспективным
путем получения новых биологически активных веществ медицинского
назначения. Одним из широко используемых типов химических превращений
КВ и других биофлавоноидов является синтез эфиров, представляющих интерес в качестве пролекарств и фармакологически ценных агентов. Несмотря на широко представленные в литературе примеры синтеза различных эфиров КВ, изучение реакций алкилирования или ацилирования КВ остается актуальной задачей, поскольку синтез полностью или частично замещенных эфиров КВ проводится обычно в несколько стадий. Кроме того, во многих работах, особенно, выполненных в начале 20-го века, не приведены ЯМР или масс-спектрометрические характеристики синтезированных эфиров КВ
Цель работы - установление состава фенольных соединений лузги гречихи посевной и разработка способа выделения из нее рутина; синтез, спектральные характеристики и оценка биологической активности эфиров и бромпроизводных кверцетина.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1) изучение группового состава фенольных соединений и разработка способа выделения рутина из лузги гречихи; 2) оптимизация способа получения КВ кислотным гидролизом рутина; 3) изучение реакции метилирования и бензилирования КВ в различных условиях, идентификация эфиров КВ спектральными методами; 4) синтез сложных эфиров кверцетина; 5) изучение реакции бромирования КВ; 6) изучение методом масс-спектрометрии отрицательных ионов резонансного захвата электронов эфирами КВ.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно-
исследовательских работ УфИХ РАН по темам: «Химия и биологическая
активность растительных веществ флоры РФ; их биогенез и функция» на 2008-
2010 (№ 0120.0801441), «Выделение, структурные исследования,
трансформации, синтез и биологическая активность природных соединений» на
2011-2013 годы (№ 01201152194), при финансовой поддержке ФЦП «Научные
и научно-педагогические кадры инновационной России на 2011-2013 годы» (ГК
№ 14.740.11.0367), грантов Президента РФ для поддержки ведущих научных
школ НШ-7014.2012.3, 3756.2010.3 и 1725.2008.3.
Научная новизна. Установлен состав фенольных соединений и
разработан способ получения рутина из плодовых оболочек (лузги) гречихи
посевной – отходов производства гречневой крупы. Разработаны
одностадийные методы синтеза полностью и частично замещенных (тетра-, три) метиловых эфиров КВ путем алкилирования КВ CH3I в ДМСО/ДМФА в присутствии КОН/K2CO3 и проведена идентификация эфиров с полным отнесением сигналов протонов и атомов углерода методами корреляционной 2D-ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Предложен новый способ бензилирования КВ в условиях межфазного катализа в присутствии четвертичной аммонийной соли (цетилтриметиламмоний бромида) с
получением пента- и тетра-О-бензиловых эфиров КВ. Синтезированы новые сложные эфиры КВ с биологически важными ароматическими кислотами. Установлено, что при бромировании КВ бромом в абсолютном этаноле происходит одновременно электрофильное замещение в кольца А и В по положениям 6,8 и 5', присоединение Br2 по двойной связи цикла С и этерификация ОН группы в положении 3. Предложен новый способ получения 6,8-дибром-КВ путем бромирования КВ N-бромсукцинимидом.
Методом масс-спектрометрии отрицательных ионов впервые изучен резонансный захват электронов молекулами ряда эфиров КВ. Показано, что в зависимости от заместителя для спектров характерно образование пиков М- или (М-R)-, причем интенсивность пика иона (M-R)- зависит от природы заместителя R.
Практическая значимость работы. Показана перспективность
использования отходов производства гречневой крупы (лузги) как
дополнительного сырья для получения рутина и оптимизирован способ
получения КВ кислотным гидролизом рутина. В экспериментах in vivo
выявлена гипогликемическая активность тетра-О-метилового эфира КВ, in vitro
– антиоксидантная активность 3,7,4'-триметилового эфира КВ. Предложен
оптимизированный метод получения 6,8-дибром-КВ, обнаружившего
противовирусную активность в отношении вируса гриппа А/H1N1/pdm09 в культуре клеток MDCK.
Апробация работы. Основные результаты исследований представлены
на VIII Научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока»
(Томск, 2008), XLVI Международной научной студенческой конференции
«Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008), Всероссийской
научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа,
2008), Республиканской научно-практической конференции и Всероссийской
научно-практической конференции с международным участием «Новые
материалы, химические технологии и реагенты для промышленности,
медицины и сельского хозяйства на основе нефтехимического и
возобновляемого сырья» (Уфа, 2009, 2011), XII, XIV и XV Молодежных
конференциях по органической химии (Суздаль, 2009, Екатеринбург, 2011,
Уфа, 2012), Всероссийской молодежной конференции-школы «Идеи и наследие
А.Е. Фаворского в органической и металлорганической химии XXI века»
(Санкт-Петербург, 2010), VIII Всероссийской научной конференции с
международным участием «Химия и медицина» (Уфа, 2010), VI и VII
Всероссийских научных INTERNET-конференциях «Интеграция науки и
высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии»
(Уфа, 2011, 2013), Всероссийской научно-технической конференции
«Инновационные технологии в области химии и биотехнологии (Уфа, 2012), II
Всероссийской молодежной научной конференции «Химия и технология новых
веществ и материалов» (Сыктывкар, 2012), IX Всероссийской конференции
«Химия и медицина» с Молодежной научной школой по органической химии
(Уфа-Абзаково, 2013), II Всероссийской научной конференции «Теоретические
и экспериментальные исследования процессов синтеза, модификации и
переработки полимеров» (Уфа, 2014), Всероссийской научной конференции
«Химия и фармакология растительных веществ» (Сыктывкар, 2014),
Молодежной научно-практической конференции «Современные
биотехнологии» (Уфа, 2014), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2015» (Москва, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 7 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК, в том числе 2 статьи в зарубежных научных журналах, тезисы 18 докладов на конференциях, заявка на изобретение РФ.
Личный вклад автора состоит в проведении экспериментальных исследований, интерпретации и анализе полученных результатов, подготовке научных статей и тезисов, представлении результатов исследований на конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
введения, литературного обзора на тему: «Флавоноиды. Рутин и кверцетин.
Химическая модификация кверцетина», обсуждения результатов,
экспериментальной части, выводов, списка литературы из 248 наименований и приложения. Материал диссертации изложен на 160 страницах машинописного текста и включает 24 рисунка, 10 таблиц, 29 схем.
Автор выражает благодарность академику РАН Юнусову М.С. за предоставленную возможность выполнения исследований в ФГБУН УфИХ РАН (ИОХ УНЦ РАН), доктору химических наук, член-корреспонденту Академии технологических наук РФ, профессору кафедры технической химии и материаловедения БашГУ Абдуллину Марату Ибрагимовичу за научные консультации и поддержку при выполнении данной работы, заведующему лабораторией физико-химических методов анализа УфИХ РАН, кандидату химических наук Спирихину Леониду Васильевичу за помощь и консультации в спектральных исследованиях.
Другие виды биологической и фармакологической активности флавоноидов
Особую группу образуют ауроны и фураноауроны, являющиеся продуктами окислительной циклизации халконов [13]. Существующее многообразие флавоноидов определяется: - степенью окисления гетероцикла; - характером сочленения ароматических колец и степенью их конденсации; - природой и количеством заместителей и их положением (расположением); - наличием оптически активных форм. Димepныe структуры отличаются С-С и С-О-С типами связей между мономерными фрагментами и также достаточно широко представлены в растениях [8]. Молекулы биофлавоноидов могут образовывать полимеры, а также связываться друг с другом или с другими органическими молекулами [14].
Большинство флавоноидов присутствуют в растениях в форме гликозидов, что обуславливает их многообразие [15,16].
Таким образом, в настоящее время все флавоноиды поделены на восемь подгрупп, внутри которых выделяются типы, классы (более 70) и виды.
Флавоноиды широко распространены в растительном мире [1, 3, 13, 17]. Они обнаружены почти во всех высших растениях (цветковых и споровых), а также у папоротникообразных, голосеменных, мхов и зеленых водорослей.
Наиболее богаты флавоноидами следующие семейства: цитрусовые, гречишные, яснотковые, розоцветные, бобовые, астровые, хвощевые и др. Также хорошие источники флавоноидов – фрукты и ягоды, лук, зелёный чай, красные вина, облепиха и чёрный шоколад (70% какао и выше). Из отходов производства вин и соков (виноградные выжимки) получают дешёвые и эффективные биоконцентраты флавоноидов [18-21].
Флавоноиды обнаружены в различных частях и органах растения. Преимущественно они накапливаются в надземной части растения – травах: пустырника, горцев перечного, почечуйного, птичьего, сушеницы топяной, череды, зверобоя, фиалки полевой и трехцветной, астрагалов шерстистоцветкового, хвоща полевого; цветках: пижмы, бессмертника песчаного, боярышника, василька синего, бутонах софоры японской; плодах: боярышника, софоры японской, рябины черноплодной, экзокарпии цитрусовых; листьях чая китайского; реже в подземных органах – корнях солодки, стальника, шлемника байкальского.
Разные растения характеризуются разным составом биофлавоноидов. Например, цитрусовые фрукты содержат большое количество флавонов и флавононов, в ягодах содержится много антоцианинов, в чае – катехины. Кроме того, в одном и том же растении состав биофлавоноидов варьируется.
Процентное содержание флавоноидов в течение вегетационного периода подвержено большим колебаниям. Максимальное накопление флавоноидов в надземной части – в период бутонизации и цветения, затем содержание флавоноидов снижается, в подземных органах максимальное накопление в период плодоношения. Содержание флавоноидов в растениях колеблется в широких пределах: в среднем 0.5-5%, иногда достигает 30% (в цветках софоры японской) [14, 22-24].
Начало отечественным работам по изучению флавоноидов растений положено русским ботаником И.П. Бородиным в 1863 году, а в 1903 году H.A. Валяшко провел исследования по доказательству строения ряда растительных флавоноидов (рутина, робинина и др.) [20].
Флавоноиды играют важную роль в растительном метаболизме. Биологическая роль флавоноидов заключается в их участии в окислительно-восстановительных процессах, происходящих в растениях. Флавоноиды предохраняют растения от стрессовых воздействий окружающей среды, в результате которых образуются свободные радикалы, нарушающие процессы жизнедеятельности клеток. Флавоноиды играют роль фильтров в растениях, защищая ткани от вредного воздействия УФ лучей, выполняют защитные функции, предохраняя растения от различных неблагоприятных воздействий окружающей среды – биотических (патогены), и абиотических (нагревание, УФ-излучение) факторов [8, 17, 25-30].
Являясь растительными пигментами, флавоноиды придают яркую окраску цветкам, чем привлекают насекомых и тем самым способствуют опылению и размножению растений. Так, антоцианы определяют красную, синюю, фиолетовую окраску цветов, а флавоны, флавонолы, ауроны, халконы – жёлтую и оранжевую. Флавоноиды обуславливают также запах и вкус фруктов, цветов и семян, что делает их привлекательными для насекомых, птиц и животных [31].
Флавоноиды принимают участие в фотосинтезе, образовании лигнина и суберина, в качестве защитных агентов в патогенезе растений. Катехины и лейкоантоцианы бесцветны. Они являются родоначальниками конденсированных дубильных веществ [7].
Согласно гипотезе русского биохимика В.И. Палладина именно флавоноиды являются переносчиками водорода в дыхательной цепи митохондрий растительной клетки (дыхательные хромогены) [32, 33].
Флавоноиды участвуют в процессе фотосинтеза и окислительного фосфорилирования. Совместно с аскорбиновой кислотой участвуют в энзиматических (ферментативных) процессах окисления и восстановления, способствуют повышению иммунитета. Флавоноиды являются регуляторами транспорта ауксинов – растительных гормонов, которые контролируют рост и развитие растений [20, 34, 35].
Многие исследователи описывают антибактериальные и антигрибковые свойства биофлавоноидов, которые защищают растения от патогенных бактерий и грибов [36]. Флавоноидные соединения транспортируются в зараженные участки растений и индуцируют реакцию гиперчувствительности, которая является самой первой защитной реакцией в инфицированных растениях, приводящей к гибели клеток [37]. Кроме того, флавоноиды могут оказывать влияние на структуры и ткани растений путем модуляции активности ауксинов, что приводит к дифференциации тканей [38]. Они могут также непосредственно включаться в ингибирование патогенных энзимов [39]. Антиоксидантные свойства флавоноидов и их способность регулировать функции ферментов в организме человека считаются самыми важными свойствами флавоноидов [13, 20].
Выделение фенольных соединений из лузги гречихи
Рутин 1 и КВ 2 являются флавоноидными препаратами, обладающими Р-витаминной активностью, которые используются для профилактики и лечения различных заболеваний, связанных с нарушением проницаемости и ломкостью стенок капилляров, а также в качестве антиоксидантов, гепатопротекторов, противовоспалительных, противоязвенных и противоопухолевых средств [113, 116, 118, 119].
Получение рутина во многих странах мира осуществляется в основном методом выделения его из растительного сырья, в частности, цветов и бутонов софоры японской – основного источника получения рутина. Содержание рутина в бутонах софоры японской составляет 12-30% и является наиболее высоким из всех известных на сегодняшний день растительных источников [155, 156]. Софора японская распространена в южных районах РФ, Китая, Средней Азии и Ближнего Востока, поэтому ограниченность сырьевой базы и высокая себестоимость рутина из-за ручной сборки цветочных бутонов делают применение данного растения малопригодным в качестве растительного сырья в условиях РФ. Известны способы получения рутина из плодов цитрусовых, ягод черной смородины, листьев табака, черники [149-153].
Для получения рутина используется также зеленая масса гречихи посевной в период бутонизации и цветения (содержание рутина составляет 2-7% от массы воздушно-сухого сырья в зависимости от климатических условий) [217, 218]. Преимуществом данного вида растительного сырья является широкое районирование гречихи и возможность механизированной заготовки сырья. Основные районы возделывания гречихи – средняя полоса России, Украина, Казахстан, Беларусь. Для использования в качестве лекарственного сырья (смесь листьев и цветов) гречиху убирают во время цветения, когда содержание в ней основного действующего вещества – рутина – достигает максимума [219]. Однако использование зеленой массы гречихи для получения Р-витаминных веществ требует значительного увеличения посевных площадей для сохранения объемов урожая этой культуры и выводит часть урожая из товарной сельскохозяйственной продукции. Из 10 тонн зеленой массы получают 100 кг рутина (1 га посевной площади) [220].
В процессе производства крупы гречки ежегодно образуются большие объемы отходов в виде соломы, плодовых оболочек и отрубей, которые до сих пор не находят эффективного использования. Количество отходов в виде плодовых оболочек (лузги) составляет примерно 200 кг на тонну зерна. Лишь незначительная их часть перерабатывается на фурфурол. Очистка зерна от лузги производится на предприятиях, выпускающих крупу, в результате чего образуется около 67% крупы ядрицы и до 20% лузги [221].
Химический состав соломы и лузги гречихи отличается высоким содержанием органических компонентов, среди которых обнаружены соединения группы флавоноидов (в том числе рутин и КВ), липиды, полисахариды, аминокислоты, являющиеся ценными биологически активными веществами [149, 222-224]. Содержание рутина в плодовых оболочках гречихи достигает 2.2-2.6% в зависимости от сорта, места произрастания и погодных условий. Известно также, что рутин и другие флавоноиды накапливаются во всех наземных частях этого растения [11]. В связи с этим, вовлечение в процесс переработки гречихи лузги, которая концентрируется на крупозаводах, в качестве дополнительного сырья для получения Р-витаминных веществ, является актуальной задачей.
С целью определения перспективности использования отходов производства гречихи как дополнительного источника Р-витаминных веществ нами был изучен групповой состав и предложена схема выделения фенольных соединений, извлекаемых из плодовых оболочек гречихи посевной (лузги, шелухи) (схема 2.1). Извлечение полифенолов проводили экстракцией измельченной лузги сначала 70%-ным этиловым спиртом (выход 5.6%), а затем хлороформом, при этом происходило увеличение выхода экстрактивных соединений до 7.0%. Учитывая различную растворимость агликонов и гликозидов, флавоноиды последовательно извлекали экстрагентами увеличивающейся полярности (описаны в 2.1.2). Для полученных фракций был определен количественный и качественный состав флавоноидных соединений. Выделение фенольных соединений из плодовых оболочек (лузги) гречихи плодовые оболочки гречихи 1) измельчение, просеивание 2) экстракция 70%-ным этанолом I этанольный экстракт, выход 5.6 % шрот 3) доэкстракция хлороформом хлороформный экстракт, выход 1.4 % 4) объединение экстрактов 5) упаривание экстракт, содержащий фенольные соединения, выход 7.0 %
Известно, что использование для экстракции растворителей различной полярности позволяет разделить сумму флавоноидов на группы [225]. Поэтому методом избирательной экстракции было проведено фракционирование сухого спиртово-хлороформенного экстракта, который последовательно промывали петролейным эфиром (фракция I), бензолом (фракция II), хлороформом (фракция III), этилацетатом (фракция IV), ацетоном (фракция V), этанолом (фракция VI) и, в заключение, водой (фракция VII) (Таблица 2.1).
Существующие методы определения суммарного количества полифенолов страдают многими недочетами, так как вещества, относящиеся к полифенолам, разнообразны по структуре. Поэтому их часто используют для сравнительной характеристики содержания полифенолов в образцах, сходных по химическому составу.
Синтез и спектральные характеристики метиловых эфиров кверцетина
Из вышеизложенного следует, что выделенный эфир соответствует структуре 3,4 ,7-три-О-бензилового эфира 12. Ацетилированием эфира 12 уксусным ангидридом в присутствии безводного ацетата натрия при кипячении по методике [183] получен известный ди-О-ацетат 13 [187] с выходом 78%. Спектр ЯМР 1Н ацетата 13 содержит сигналы протонов двух СОСН3 групп с 2.29 и 2.52 м.д.
Еще более полярная фракция с Rf 0.65 была идентифицирована как 3,3 ,4 три-О-бензиловый эфир КВ 14 (выход 6.9%), спектры ЯМР 1Н и 13С которого совпали с расчетными данными. УФ-спектры соединения 14 в этаноле и в растворе слабого основания (C2H5OH+0.01% NaOCOCH3) практически одинаковы, что предполагает отсутствие свободной 4 -ОН. УФ-спектр не меняется и в 0.01%-ном этанольном растворе AlCl3, что говорит об отсутствии свободной 3-ОН [183]. В растворе сильного основания (C2H5OH+0.01% NaOC2H5) наблюдается небольшой батохромный сдвиг (21 нм) первого максимума в длинноволновую область, что говорит о наличии свободной 7-ОН [177, 183]. Таким образом, данное соединение является 3,3 ,4 -О-бензиловым эфиром КВ 14.
Ацетилированием эфира 14 получен ди-О-ацетат 15 с выходом 76%, в спектре ЯМР 1Н (500 МГц) которого наблюдается два синглетных сигнала протонов ацетильных групп при 2.35 и 2.50 м.д. (Рисунок 2.11). В спектре ЯМР 13С данного эфира наблюдается смещение сигналов атомов углерода С-5 и С-7 на 9-10 м.д. в более сильное поле.
Алкилирование КВ при соотношении КВ:С6Н5СН2Вr = 1:5 в ДМСО при 20-22 С в течение 4 ч проходило также с образованием смеси бензиловых эфиров с невысоким выходом. Хроматографированием смеси на СГ были получены в чистом виде два основных соединения, которые были идентифицированы по ТСХ с метками и спектральными методами. Наиболее подвижная фракция с Rf 0.82 (выход 18.2%) оказалась тетра-О-бензиловым эфиром КВ 11. Фракция с Rf 0.75 (выход 20.9%) была идентифицирована как три-О-бензиловый эфир КВ 12.
Алкилирование КВ С6Н5СН2Cl в ДМФА в присутствии КОН при соотношении 1:5 также привело к образованию смеси бензиловых эфиров, из которой КХ на СГ был выделен основной продукт – три-О-бензиловый эфир КВ 12 с выходом 17.5%, идентифицированный по ТСХ с метками и ЯМР спектрами.
Таким образом, бензилирование КВ в присутствии КОН в ДМСО или ДМФА при 20-22 С приводит к образованию полностью или частично бензилированных эфиров КВ в зависимости от соотношения субстрата и алкилирующего реагента. Оптимальным реагентом, дающим наиболее высокий выход бензиловых эфиров, является С6Н5СН2Br, а растворителем ДМСО.
При использовании избытка С6Н5СН2Br по отношению к КВ (1:10) в ДМСО происходит образование пента- и тетра-О-замещенных бензиловых эфиров КВ 10 и 11 ( 4:1) с общим выходом 98.5%. Алкилирование КВ в смеси ДМСО-ДМФА избытком С6Н5СН2Cl (1:10) приводит к образованию смеси 3,3 ,4 ,7-тетра-, 3,4 ,7-три- и 3,3 ,4 -три-О-бензиловых эфиров КВ. При использовании эквимолярного по отношению к КВ количества С6Н5СН2Br (1:5) в ДМСО основными продуктами реакции являются 3,3 ,4 ,7-тетра- и 3,4 ,7-три-О-бензиловые эфиры КВ (1:1), а в ДМФА – 3,4 ,7-три-О-бензиловый эфир КВ.
Продолжая наши работы по синтезу эфиров КВ, мы изучили реакцию бензилирования КВ в условиях межфазного катализа, который ранее в синтезе эфиров КВ не применялся. Реакции проводились в системе органический растворитель – водный раствор NaOH в присутствии четвертичной аммонийной соли – цетилтриметиламмоний бромида (ЦТМАБ) при различном соотношении КВ и бензилгалогенида (схема 2.5, d-e). Разделение продуктов реакции проводили КХ на СГ. Идентификацию образцов проводили по ТСХ с заведомыми образцами, а также спектральными методами. Результаты экспериментов приведены в Таблице 2.6.
Как видно из данных Таблицы 2.6, при бензилировании КВ С6Н5СН2Br в соотношении КВ:С6Н5СН2Br 1:5 ммоль в присутствии ЦТМАБ и 5- или 10%-ного водного раствора NaOH была получена смесь пента- и тетра-О-бензиловых эфиров КВ 10 и 11 в соотношении 1:1 (весовом и процентном) с общим выходом 26% и 43%, соответственно. При увеличении количества С6Н5СН2Br до 10 ммоль выход смеси эфиров 10 и 11 практически не изменился (43%). При использовании в качестве бензилирующего реагента С6Н5СН2Cl и соотношении КВ:С6Н5СН2Сl 1:10 общий выход смеси пента- и тетра-О-бензиловых эфиров КВ был ниже (23%) (соотношение 1:1).
Увеличить региоселективность реакции удалось при добавлении в реакционную смесь ДМСО. При этом основным продуктом реакции оказался пента-О-бензиловый эфир КВ 10, выделенный с помощью КХ на СГ c выходом 44% при использовании в качестве реагента двукратного избытка С6Н5СН2Br и 42% – С6Н5СН2Сl, соответственно. Из продуктов реакции были выделены также небольшие количества (6%) тетра-О-бензилового эфира КВ 11. Таким образом, бензилирование КВ в условиях межфазного катализа в присутствии четвертичной аммонийной соли ЦТМАБ приводит преимущественно к образованию смеси пента- и тетра-О-бензиловых эфиров КВ (1:1), общий выход смеси эфиров зависит от соотношения КВ и бензилгалогенида, региоселективность реакции – от органического растворителя.
Изучение влияния срока хранения лузги гречихи на содержание фенольных соединений и рутина
Метод 1. Фенольную фракцию, полученную из 20 г лузги гречихи (см. выше 3.1.1), экстрагировали кипящей водой по 25 мл в два приема в течение 10 мин. Горячий раствор фильтровали и оставляли кристаллизоваться при 10-12 С. Выпавшие светло-коричневые кристаллы тригидрата рутина С27Н30О16 3Н2О отделили и перекристаллизовывали из абсолютного метанола. Получили 0.2 г чистого рутина 1 (1.0% в пересчете на воздушно-сухое сырье). Зеленовато-желтый мелкокристаллический порошок без вкуса и запаха. Т.пл. 196-198 5 (C-8), 78.5 (С-5 ), 77.4 (С-3 ), 75.9 (С-2 ), 73.9, 72.4, 72.0, 71.2 (С-4 , С-2 , С-3 , С-4 ), 69.4 (С-5 С, лит. [245]: 198 С; лит. [221]: 195 С. ИК-спектр, , см-1: 3400-3200 (ОН), 1654 (С=О), 1605 (Ph), 1558 (Ph), 1498 (C-O-C). Спектр ЯМР 1Н (300 МГц, Py-d5, , м.д.): 12.25 (уш. с., ОН), 7.50 (1H, c, Н-2 ), 7.25 (1H, д, J = 8.5 Гц, Н-6 ), 6.93 (1Н, с, Н-6), 6.50 (1Н, д, J = 8.5 Гц, Н-5 ), 6.31 (1Н, с, Н-8), 5.83 (1Н, д, J = 9 Гц, Н-1 Glc), 5.09 (1Н, д, J = 6.6 Гц, Н-1 Rha), 4.43-3.10 (10H, м, Н-2 -Н-6 Glc, H-2 -H-5 Rha), 0.67 (3Н, с, СН3 Rha). Спектр ЯМР 13С (75.5 МГц, Py-d5, , м.д.): 178.5 (C-4), 165.8 (C-7), 162.5 (C-5), 158.1 (C-9), 157.6 (C-2), 146.6 (C-4 , C-3 ), 135.3 (C-3), 122.8, 122.3 (C-1 , C-6 ), 117.8 (C-5 ), 116.2 (C-2 ), 105.1 (C-10), 104.7 (C-1 Glc), 102.4 (C-1 Rha), 99.7 (C-6), 94.), 68.4 (С-6 ), 18.4 (СН3 Rha).
Метод 2. Измельченные обезжиренные петролейным эфиром плодовые оболочки гречихи (20.0 г) экстрагировали в аппарате Сокслета 500 мл 70%-ного этанола при кипячении в течение 5-6 ч. Растворитель упарили и получили 1.2 г (5.6%) сухого этанольного остатка, который дважды обработали этилацетатом (25 мл2) при перемешивании в течение 10 мин при 20-22 С для удаления смол и липидных веществ. Полученную смесь фильтровали, осадок сушили на воздухе, затем экстрагировали кипящей водой два раза (25 мл2). Горячий раствор фильтровали, охлаждали до 10-12 С, при этом происходила кристаллизация рутина. Выпавшие кристаллы тригидрата рутина отфильтровывали и сушили. Выход 0.22 г (1.1%). Т.пл. 190-192 С. Лит. [222]: Т.пл. 190-192 С; лит. [245]: 192 С. После перекристаллизации из абсолютного этанола получили 0.16 г (0.8% в пересчете на воздушно-сухое сырье) свободного рутина С27Н30О16. Т.пл. 195-197 С. Практически нерастворим в воде; растворим в разбавленных растворах едких щелочей. Полученный рутин соответствовал требованиям ГФ XI [229].
Рутин (0.61 г, 1ммоль) 1 в 60 мл 2.5%-ной серной кислоты кипятили с обратным холодильником в течение 6 ч с контролем по ТСХ (Г). Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой до нейтральной реакции, сушили и перекристаллизовывали из 70%-ного этанола. Выход КВ 2 0.27 г (90.0%). Т.пл.. 309-310 С. Лит. [246]: Т.пл. 316-317 С; [247]: Т.пл. 313-314 С. ИК-спектр, , см-1: 3400-3200 (ОН), 1663, 1610, 1560, 1522. Спектр ЯМР 1Н (300 МГц, Ру-d5, , м.д.): 11.85 (уш.с., 5ОН), 7.12 (1Н, с, Н-2 ), 6.65 (1Н, д, J = 8.1 Гц, Н-6 ), 5.95 (1Н, д, J = 8.1 Гц, Н-5 ), 5.30 (1Н, с, Н-6), 5.20 (1Н, с, Н-8). Спектр ЯМР 13С (75.5 МГц, acetone-d6+DMSO-d6, , м.д.): 147.2 (С-2), 135.2 (С-3), 175.3 (С-4), 160.4 (С-5), 97.8 (С-6), 163.7 (С-7), 93.0 (С-8), 156.0 (С-8а), 102.5 (С-4а), 119.8 (С-1 ), 114.6 (С-2 ), 144.6 (С-3 ), 146.2 (С-4 ), 115.0 (С-5 ), 121.8 (С-6 ).
Рутин (0.61 г, 1ммоль) в 60 мл 5%-ной серной кислоты кипятили с обратным холодильником в течение 3 ч. КВ 2 выделяли как описано выше и перекристаллизовывали из 70%-ного этанола. Выход 93.3%. Т.пл. 310-312 С.
Рутин (0.61 г, 1 ммоль) растворяли в 60 мл 5%-ной соляной кислоты и кипятили с обратным холодильником в течение 8 часов. КВ 2 выделяли как описано выше и перекристаллизовывали из 70%-ного этанола. Выход 81.6%. Т.пл. 309-312 С.
Метилирование кверцетина иодистым метилом в ДМСО (1:10). К раствору 0.30 г (1 ммоль) КВ 2 в 10 мл ДМСО добавляли 0.56 г (10 ммоль) растертого порошка КОН и перемешивали смесь 30 мин. Затем прибавляли по каплям 0.62 мл (10 ммоль) CH3I и перемешивали смесь в течение 4-х ч с контролем по ТСХ. Полученный раствор выливали в воду, подкисленную соляной кислотой (рН 2-3), осадок отфильтровывали, промывали водой до нейтральной реакции и сушили. Сухой продукт (0.37 г) хроматографировали на колонке с СГ, элюируя бензолом и градиентной смесью бензола – этанола, 100:0.150:1 (v/v). Гомогенные по ТСХ фракции объединяли и упаривали. Получили две основные фракции с Rf 0.77 и 0.73, которые перекристаллизовали из этанола. Первая фракция была идентифицирована как пента-О-метиловый эфир КВ 3 (выход 0.15 г, 40%), вторая фракция оказалась тетра-О-метиловым эфиром КВ 4 (выход 0.20 г, 55%).
Метилирование кверцетина иодистым метилом в ДМСО (1:5). К раствору 0.30 г (1 ммоль) КВ 2 в 10 мл ДМСО добавляли 0.28 г (5 ммоль) порошка КОН, перемешивали 30 мин, затем прибавляли по каплям 0.31 мл (5 ммоль) СН31 и перемешивали смесь в течение 4-х ч с контролем по ТСХ. Полученный раствор выливали в воду, подкисленную соляной кислотой (рН 2-3), осадок отфильтровывали, промывали водой до нейтральной реакции и сушили. Полученный продукт (0.32 г) хроматографировали на колонке с СГ, элюируя бензолом и градиентной смесью бензол-этанол, 100:0.1-50:1 (v/v). Выделили две основные фракции, которые перекристаллизовали из этанола. Первая фракция совпала по т.пл., ТСХ и ЯМР-спектрам с образцом тетра-О-метилового эфира КВ 4 (выход 0.15 г, 42%), вторая фракция была идентифицирована как три-О-метиловый эфир КВ 5 (выход 0.02 г, 6%).
Метилирование кверцетина иодистым метилом в ДМФА (1:7). К раствору 0.30 г (1ммоль) КВ 2 в 10 мл ДМФА добавляли 0.97 г (7.0 ммоль) К2СО3 и перемешивали 30 минут. Затем прибавляли по каплям 0.5 мл (7 ммоль) СН31 и перемешивали в течение 8 ч при 22-24 С с контролем по ТСХ. Полученный раствор выливали в воду, подкисленную соляной кислотой (рН 2-3). Выпавший желто-зеленый осадок отфильтровывали, промывали водой, сушили и хроматографировали на колонке с СГ, элюируя смесью бензол-этанол (200:1; 100:1; 100:2, 100:3, v/v). Выделили основную фракцию, которая была идентифицирована как три-О-метиловый эфир КВ 5 (выход 0.15 г, 44%). Остальные фракции содержали неразделенную смесь продуктов реакции.