Пространственное строение и внутримолекулярная динамика модифицированных аналогов стероидных гормонов на основе данных спектроскопии ЯМР Селиванов Станислав Иванович

Содержание к диссертации

Введение

2. Глава 1. Спектроскопия ЯМР стероидных молекул

1.1 История взаимоотношений спектроскопии ЯМР и стероидов 12

1.2 Использование скалярных констант в конформационном анализе стероидов...16

1.3 Использование ЯЭО в конформационном анализе стероидов .21

1.4 Основные направления развития методологии исследования 31

3. Глава 2. Конформационный анализ 8-аналогов эстрогенов на основе данных спектроскопии ЯМР 54

2.1. 6-Окса-8-аналоги эстрогенов .54

2.2. 6-Окса-D-гомо-8-аналоги эстрогенов .71

2.3. 8-Аналоги эстрогенов .91

2.4. D-Гомо-8-аналоги эстрогенов .111

2.5. В-Нор-8-аналоги эстрогенов 125

4. Глава 3. Конформационный ЯМР-анализ других изоаналогов эстрогенов 143

3.1. 9-Аналоги эстрогенов .143

3.2. 13-Аналоги эстрогенов 162

3.3. D-Гомоаналоги эстрогенов природного ряда 189

3.4. 9,14-Аналоги эстрогенов 196

3.5. 8,14-Аналоги эстрогенов .211

5. Глава 4. Конформационный ЯМР-анализ модификаций эстрогенов с дополнительными двойными связями 234

4.1. Тетраены .234

4.1.1. 6-Оксаэстра-1,3,5(10),8(9)-тетраены 234

4.1.2. D-Гомо-В-нор -, D-гомо- и 14-аналоги эстра-1,3,5(10),8(9)-тетраенов 256

4.1.3. Модифицированные аналоги эстра-1,3,5(10),8(14)-тетраенов 285

4.2. Пентаены 302

4.2.1. Эквиленины .302

4.2.1.1. 14-Эквиленины .304

4.2.1.2. D-Гомоаналоги 14-эквиленинов 313

4.2.1.3. 14-Аналоги эквиленинов 325

4.2.2. 14-Аналоги эстра-1,3,5(10),8(9),15(16)-пентаенов 342

6. Глава 5. Конформационный ЯМР-анализ изоаналогов андрогенов .350

5.1. 19-Нораналоги андрогенов 350

5.2. 19,В-Биснораналоги андрогенов .362

7. Заключение 373

8. Выводы 384

9. Экспериментальная часть 387

10. Литература 392

• Использование ЯЭО в конформационном анализе стероидов
• 6-Окса-D-гомо-8-аналоги эстрогенов
• D-Гомоаналоги эстрогенов природного ряда
• Модифицированные аналоги эстра-1,3,5(10),8(14)-тетраенов

Введение к работе

Актуальность темы данной работы определяется произошедшими в последнее время изменениями в стратегии отбора новых веществ, предназначенных для биологических исследований. В настоящее время создание новых препаратов с улучшенными характеристиками требует значительно больше материальных и временных затрат для изучения их биологических свойств, чем это было необходимо ранее. Поэтому в основе нового подхода лежит предварительный анализ различных докинг-взаимодействий лиганд-рецепторных комплексов. Это позволяет провести обоснованный отбор веществ, предназначенных для биологических исследований и значительно удешевить программы по созданию препаратов с улучшенными свойствами и/или сократить время их проведения. Для успешной реализации этой стратегии крайне важно обладать достоверными данными об особенностях пространственного строения новых веществ еще до стадии их биологического тестирования.

Среди физико-химических методов структурных исследований органических соединений, способных эффективно решать такую задачу, важное место занимает спектроскопия ЯМР. Результаты ее использования, наряду с данными рентгеноструктурного анализа (РСА) и молекулярного моделирования (ММ), являются необходимым и крайне важным условием успешной реализации новой стратегии предварительного отбора потенциальных лекарственных средств среди модифицированных аналогов стероидных гормонов, являющихся объектами настоящего исследования. Поэтому уровень развития спектроскопии ЯМР и расширение ее возможностей по установлению пространственного строения и конформационного состава данного класса органических соединений являются, соответственно, определяющим эту успешную реализацию фактором и, одновременно, самостоятельной задачей.

Революционные изменения в спектроскопии ЯМР, связанные с переходом на импульсный способ регистрации (Ernst R. R., Andersen W. A., 1966), и появление новых высокоэффективных корреляционных методов получения необходимой информации и способов ее обработки привели к интенсивному поиску и развитию принципиально новых подходов, позволяющих решать задачи, постановка которых ранее казалась невозможной. Особенно значительный прогресс наблюдался в области применения спектроскопии ЯМР для установления строения и изучения динамики биоорганических макромолекул с учетом особенностей их спектральных и релаксационных характеристик. Именно здесь наиболее полно были использованы преимущества анализа данных ЯМР на основе математических методов обработки информации.

Аналогичная тенденция к индивидуализации методологии и поиску оптимальной системы доказательств наблюдается в последнее время и в отношении других групп химических соединений, объединенных характерными для них проблемами использования спектроскопии ЯМР. Эти проблемы связаны, прежде всего, со спецификой спектральных проявлений и с различием релаксационных характеристик представителей каждой из этих групп. Важным следствием этого процесса является необходимость критического отношения к результатам методических и методологических подходов, разработанных для иных типов химических соединений, поскольку выводы об эффективности использования какого-либо метода спектроскопии ЯМР применительно, например, к большим

биоорганическим молекулам, могут оказаться противоположными при их использовании для случая малых стероидных молекул. Это, прежде всего, относится к способам получения наиболее важных для конформационного анализа исходных данных и к методологии определения на их основе соответствующих геометрических параметров исследуемой молекулы. Следовательно, разработка эффективного подхода применения спектроскопии ЯМР к изучению пространственного строения и внутримолекулярной динамики модифицированных аналогов стероидных гормонов в жидкой фазе с учетом специфичности их спектральных и релаксационных характеристик является неотъемлемой частью и необходимым условием решения общей задачи поиска наиболее перспективных веществ-лидеров при создания новых лекарственных средств.

К моменту начала данного исследования в литературе практически отсутствовали примеры корректной идентификации сигналов алифатических протонов стероидных гормонов. Применение спектроскопии ЯМР в структурных исследованиях стероидов ограничивалось использованием различных эмпирических закономерностей для химических сдвигов ядер ¹³С и/или нескольких наиболее характерных протонных сигналов. Такой подход, основанный на базе данных по химических сдвигам для структурно близких известных соединений, способен, в лучшем случае, давать достоверную информацию лишь о принадлежности исследуемой молекулы к тому или иному уже изученному изоряду, но не об особенностях ее пространственного строения в случае структурных модификаций и/или конформационных превращений.

Эти недостатки и ограничения существовавших подходов, а также новые возможности появившихся корреляционных гомо- и гетероядерных методов спектроскопии ЯМР явились определяющими при разработке стратегии настоящего исследования, основанной на: а) полном анализе перекрывающейся алифатической области спектра ЯМР ¹Н стероидных молекул, в которой сосредоточена основная и наиболее важная для конформационного анализа часть информации, б) – точном определении наиболее стереоспецифичных параметров парных взаимодействий – скалярных констант (^2-6J_Н-Н) и ядерных эффектов Оверхаузера (ЯЭО), в) количественной оценке соответствующих им геометрических характеристик – торсионных углов _Н-Н и межпротонных расстояний r_H-H, и сопоставлении их с соответствующими данными РСА и/или расчетных методов.

Цели работы

– Разработка новой эффективной методологии использования спектроскопии ЯМР для установления пространственного строения и внутримолекулярной динамики сложных насыщенных полициклических соединений и ее апробация на примере изучения модифицированных аналогов стероидных гормонов.

– Получение достоверных экспериментальных данных об особенностях пространственного строения модифицированных аналогов стероидных гормонов, включая сведения об их конформационной жесткости или лабильности.

Выявление на основе анализа полученных результатов наиболее перспективных направлений дальнейшего совершенствования разработанной и апробированной методологии, включая оценку возможности ее использования для конформационного анализа других насыщенных полициклических соединений, а также установление границ применимости отдельных ее элементов.

Задачи исследования

Выявление, анализ и решение наиболее существенных методических и экспериментальных проблем, возникающих при использовании спектроскопии ЯМР в конформационном анализе стероидных гормонов в растворе, предполагало последовательное решение следующих задач:

проведение полной и однозначной идентификации сигналов в спектрах ЯМР 'Н стероидных молекул в условиях их значительного перекрывания и возможного образования сильносвязанных спиновых систем;

анализ характера связанности протонов и соответствующий выбор способа упрощения спектров с помощью одного или нескольких методов спектроскопии ЯМР и/или спектральной симуляции;

определение точных значений наиболее важных для конформационного анализа стероидных молекул характеристик парных взаимодействий - вицинальных констант ³J_Н._Н и скоростей кросс-релаксации _Н._Н (ЯЭО);

количественная оценка значений геометрических параметров молекул в жидкости торсионных углов _Н-Н и межпротонных расстояний Г_Н-_Ні

сопоставление относительных (а не абсолютных) экспериментальных и расчетных вицинальных констант ³J_Н-Н и торсионных углов _Н-Н для устранения систематических ошибок их определения и использование таких корреляций для доказательства небольших (до 10-15 градусов) конформационных различий близких по структуре стероидных молекул;

апробация эффективности разработанной методологии на примере изучения известных и новых стероидных молекул путем сопоставления полученных для них количественных оценок торсионных углов _Н-_Н и межпротонных расстояний г_Н-Н^(ЯМР) с соответствующими данными РСА и/или ММ;

определение критериев конформационной жесткости или конформационной лабильности стероидных молекул в растворе;

применение разработанного подхода для структурного и конформационного анализа широкого круга модифицированных аналогов эстрогенов и андрогенов и получение на его основе достоверных и независимых данных об особенностях их пространственного строения и о наличии внутримолекулярной подвижности в растворе;

установление характера внутримолекулярных превращений в конформационно лабильных стероидных молекулах и количественная оценка населенностей конформеров в условиях быстрого в шкале времени ЯМР обмена;

выявление основных факторов, влияющих на точность количественных оценок методом ЯМР геометрических параметров стероидных молекул (_Н-Н^(ЯМР),г_Н._Н^(ЯМР)),

экспериментальное определение параметра анизотропии вращательной диффузии D/D на основе сопоставления гетероядерных ('Н¹³С) эффектов Оверхаузера в метиленовой группе стероидной молекулы.

Научная новизна и практическая значимость

Разработана новая эффективная методология использования корреляционной спектроскопии ЯМР в одном и двух измерениях для надежного установления пространственного строения стероидных гормонов и обнаружения быстрых в шкале времени ЯМР конформационных превращений в растворе, ключевыми элементами которой являются: анализ алифатической области спектра ЯМР 'Н, точные оценки

межпротонных расстояний и учет особенностей спектральных и релаксационных характеристик объектов исследования.

На основе разработанного подхода проведено систематическое изучение
особенностей пространственного строения и внутримолекулярной лабильности в
растворе широкого круга следующих модифицированных аналогов стероидных
гормонов:

- изоаналогое эстрогенов, принадлежащих D-гомоаналогам природного ряда и
8-, Б-гомо-8-, В-нор-8-, Б-гомо-В-нор-8-, 6-окса-8-, 6-окса-Б-гомо-8-,
Б-гомо-9 -, Б-гомо-В-нор-Э-, 13-, D-гомо-ІЗ-, 8,14Ч 6-окса-D-гомо-8,144
6-окса-9,14- и 6-окса-0-гомо-9,14-аналогам эстра-1,3,5(10)-триенов;

- изоаналогое андрогеное, принадлежацих 19-нор-, 19-нор-8,10-, 19,В-биснор-
8,10-, 19,В-биснор-Б-гомо-8,10-, 19,В-биснор-9,10- и 19,В-биснор-Б-гомо-
9,10-изорядам;

изоаналогое эстратетраенов, принадлежащих 6-окса-, D-гомо-, б-окса-D-гомо-, В-нор-Б-гомо-, 6-окса-14- аналогам 1,3,5(10),8(9)-тетраенов, 1,3,5(10),8(14)-тетраенам и их 6-окса-, бокса-Б-гомо-Э-аналогам;

эквиленинов, принадлежащих 14-, 14-Б-гомо-, 14- и 14-Б-гомо-изорядам,

эстрапентаеное, принадлежащих 14- и 6-окса-14-аналогам 1,3,5(10),8(9),15(16)-пентаенов.

Для изученных стероидных молекул проведена полная идентификация сигналов в спектрах ЯМР 'Н и ¹³С, основанная на внутренних (скалярных и прямых, гомо- и гетероядерных) взаимодействиях, установлен целый ряд новых закономерностей для спектральных и релаксационных характеристик каждой из изученных модификаций и получены надежные экспериментальные доказательства их внутримолекулярной жесткости или конформационной лабильности в растворе.

Обнаружены и исследованы быстрые в шкале времени ЯМР конформационные превращения, связанные с изменением пространственного строения одного, двух или даже трех колец стероидной молекулы. Для конформационно лабильных стероидных гормонов проведена оценка относительных населенностей конформеров в растворе CDC1₃ и определены термодинамические и кинетические характеристики обменных процессов.

Впервые показано, что использование анизотропной модели расчета межпротонных расстояний для жестких аксиально-симметричных стероидных молекул, находящихся в условиях экстремального сужения линий (_0с « 1), позволяет с помощью ЯЭО измерять расстояния до 3.5 А с точностью не хуже ±5% от их абсолютных значений.

На основании измерения и сопоставления гетероядерных ('Н-¹³С) эффектов Оверхаузера в метиленовой группе СН₂ модельной стероидной молекулы показана возможность экспериментальной количественной оценки параметра анизотропии диффузии D/D, которая почти в 2.5 раза превышает его расчетное значение.

При изучении конформационно лабильных В-гомо-8,14-аналогов стероидных эстрогенов с помощью метода NOESY в условиях быстрого в шкале времени ЯМР двухпозиционного обмена и экстремального сужения линий (_0с « 1) впервые в явном виде было обнаружено явление скалярной релаксации 1-го рода, приводящее к инверсии знака эффективной скорости кросс-релаксации и, соответственно, к инверсии знака наблюдаемого эффекта Оверхаузера между ними. Полная идентификация сигналов всех протонов для каждого из двух конформеров и анализ температурных изменений алифатической области спектра ЯМР 'Н этих стероидов

позволили сформулировать необходимые условия, при выполнении которых возможно наблюдение этого аномального явления в экспериментах по измерению нестационарных ЯЭО условие сильносвязанности двух протонов только в одном из двух конформеров, и обосновать возможность использования эффектов скалярной релаксации 1-рода в спектрах NOESY для обнаружения быстрых в шкале времени ЯМР конформационных превращений в растворе.

Практическая значимость полученных сведений о конформационной жесткости или внутримолекулярной подвижности в растворе новых модифицированных аналогов стероидных гормонов, которые являются потенциальными лекарственными препаратами с избирательным действием, заключается в повышении уровня обоснованности отбора веществ, предназначенных для биологических исследований, и уровня качества предварительного анализа различных докинг-взаимодействий лиганд-рецепторных комплексов.

Самостоятельную практическую ценность представляет разработанная и апробированная при изучении стероидных гормонов методология использования спектроскопии ЯМР в структурном и конформационном анализе органических соединений, поскольку она или отдельные ее элементы могут быть эффективно использованы для исследования других насыщенных полициклических молекул в растворе.

Положения, выносимые на защиту

Методология использования спектроскопии ЯМР ¹Н для установления пространственного строения модифицированных аналогов стероидных гормонов в растворе и обнаружения быстрых в шкале времени ЯМР конформационных превращений.

Результаты использования этой методологии для установления особенностей пространственного строения широкого круга модифицированных аналогов стероидных гормонов и доказательства их конформационной жесткости или мобильности в растворе.

Наиболее существенные факторы, определяющие эффективность использования этой методологии и границы применимости отдельных ее элементов, и критерии конформационной жесткости или конформационной лабильности стероидных молекул на основе измерения ЯЭО.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на 25 международных и 8 российских конференциях и семинарах: Joint 29 AMPERE – 13 ISMAR International conference “Magnetic Resonance and Related Phenomena” (Berlin, Germany, 1998); X^th, XI^th International Conferences “Magnetic Resonance in Chemistry and Biology” (Suzdal, Russia, 1998; Zvenigorod, Russia, 2001); International Conferences “Modern Trends in Organic Synthesis on the Eve of new Era” (St.Petersburg, 1999, 2009); 30^th, 32^nd Congresses AMPERE “Magnetic Resonance and Related Phenomena” (Lisbon, Portugal, 2000; Lille, France, 2004); V^th, VI^th VII^th, VIII^th, IX^th, XI^th, XII^th International Workshops on Magnetic Resonance - Spectroscopy and Tomography, (Rostov-on-Don, Russia, 2000, 2002, 2004, 2006, 2008, 2013, 2015); IV^th International symposium IUPAC “Molecular Order and Mobility in Polymer Systems” (St.Petersburg, Russia, 2002); XVI^th, XVII^th, XVIII^th International Conferences “Spectroscopy of molecules and crystals” (Ukraine: Sevastopol, 2003; Crimea, 2005; Beregovoe, 2007); 1^st, 2^nd, 3^d, 4^th, 6^th International Symposiums and AMPERE Summer Schools in Saint

Petersburg - NMRCM (St.Petersburg, Russia, 2004, 2005, 2006, 2007, 2009); Международном симпозиуме “Magnetic resonance: from fundamental research to practical application” (Kазань, 2016); V Всероссийском семинаре по спектроскопии ЯМР памяти В.Ф.Быстрова (Москва, 1997); III-й, IV-й, VI-й Всероссийских конференциих “Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях” (Казань, 2000, 2005, 2015); II-й и III-й Всероссийских конференциях по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону, 2003, 2005); XVII и XVIII Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Казань, 2003; Москва, 2007).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 85 работ, из них: 41 статья в отечественных и зарубежных журналах, тезисы 33 докладов на международных и 11 докладов на российских конференциях и семинарах.

Структура и объем диссертации

Использование ЯЭО в конформационном анализе стероидов

Второй независимый способ количественного описания пространственного строения молекул в растворе основан на определении значений межпротонных расстояний с помощью ЯЭО. Первая работа по экспериментальному подтверждению зависимости между ЯЭО и межпротонными расстояниями была проведена на примере изучения нескольких стероидных молекул и опубликована еще в 1970 году [103]. Однако, до начала 90-х гг. все использования ЯЭО в конформационном анализе молекул с молекулярным весом, не превышающим 400 – 500, проводились только на качественном уровне без определения значений самих расстояний и их сопоставления с результатами других методов. Такое положение существенно отличалось от многочисленных примеров получения количественных оценок расстояний в больших биоорганических молекулах [104107]. Основные причины такого положения хорошо известны. Среди них в первую очередь следует отметить то обстоятельство, что для больших молекул выполняется соотношение ос 1, и наблюдаемый ЯЭО в условиях предела спиновой диффузии, оказывается значительно более сильным по сравнению с его значениями в пределе экстремального сужения линий (ос 1), в котором находятся молекулы с молекулярным весом менее 500, такие как стероиды. Во вторых, время спин-решеточной релаксации протонов в биоорганических молекулах значительно короче, чем для стероидов, для которых на резонансных частотах (300 – 500) МГц оно составляет обычно от 0.5 до 1.5 с. Следовательно, проводить накопление для получения приемлемого соотношения сигнал/шум, необходимого для хорошего количественного интегрирования, в случае малых стероидных молекул оказывается значительно сложнее, так как необходимо обеспечить выполнение требования для релаксационной задержки: D1 5T1max. Таким образом, период повторения экспериментов в случае стероидов должен быть не меньше 7.5 с. Аналогичный интервал для биоорганических молекул составляет лишь доли секунды и определяется только временем выборки данных. Два указанных обстоятельства заставили будущего Нобелевского лауреата (R.R.Ernst – 1991 г. [1]) в одной из первых работ по теоретическому описанию спектроскопии NOESY [108] предсказать для малых молекул в условиях экстремального сужения линий только качественное использование ЯЭО. Но основное объяснение возможности количественных оценок межпротонных расстояний для биоорганических молекул заключается в наличии теоретической базы, основанной на так называемой свободной модели (Free-Model Approach), предложенной в 1982 г. для одновременного описания зависимости скорости кросс-релаксации от межпротонных расстояний и внутримолекулярной динамики [109112]. Эта теория не может быть применена для аналогичного изучения малых молекул, находящихся в условиях экстремального сужения линий (ос 1), поскольку при ее создании авторами было сделано одно важное ограничение на соотношение между скоростью диффузии и скоростью внутримолекулярной подвижности: общее диффузионное движение молекул, характеризуемое временем м, находится в условиях предела спиновой диффузии: ом 1, а внутримолекулярная подвижность, характеризуемая скоростью с-1, которая превышает скорость диффузии м1, находится в условиях экстремального сужения линий: ос 1. Это соотношение скоростей представлено на рисунке 1-2, на котором показана функция спектральной плотности Д), описывающая оба вида движения /5/, где S - параметр порядка: 1 S 0, - эффективное время корреляции: -1 = м-1 + с-1.

Зависимость вероятностей одноквантовых W1, двухквантовых W2 и нульквантовых Wo переходов в двухспиновой системе от параметра о и соотношение между общим диффузионным и внутримолекулярным движениями для свободной модели Липари и Сабо [109].

Для реализации этого подхода необходимо получить как можно большее число экспериментальных данных без особых требований к точности измерения. В этом случае, кросс-пики в NOESY или ROESY спектрах разделяются по интенсивности, как правило, на 3 группы: сильные (расстояния до 3.0 ), средние (расстояния от 3.0 до 5.0 ) и слабые (расстояния более 5.0 ), и в таком виде вводятся в программу обработки данных. Таким образом, при использовании свободной модели расчёта неточности в оценках исходных расстояний компенсируются очень большим массивом этих данных. Обеспечить такой большой объем исходной информации для сравнительно небольших стероидных молекул невозможно. Обычное число объемных интегралов, которые удается получить для одной стероидной молекулы, как правило, не превышает 20-ти. Следовательно, разделение на 3 группы, как это делается для больших биоорганических молекул, также невозможно, поскольку наблюдаемые кросс-пики соответствуют расстояниям до 3.0 – 3.5 , т.е. соответствуют только сильным взаимодействиям. Тем не менее, в последнее время появилось несколько работ, в которых методология анализа релаксационных данных, основанная на свободной модели Липари и Сабо (Lipari, Szabo) и предназначенная для вполне определенного случая, распространена на малые молекулы, такие как стероиды, для которых общее диффузионное движение находится в области экстремального сужения линий: ом 1. Поэтому результаты такого расширительного подхода вызывают сомнения и требуют независимого подтверждения или их опровержения. В качестве характерного примера можно привести работу [113], в которой на основании данных по измерению ЯЭО и расчетов возможных конформаций, соответствующих этим данным на основе свободной модели, делается вывод о существовании 17-эстрадиола (I) в растворе в виде конформационного равновесия, связанного с изменением конформации кольца С переход из конформации “кресло” в доминирующем конформере (А) в конформацию “ванна” в минорном конформере (В). В данной статье ни одного слова не сказано о правомерности использования такого подхода и отсутствует какой-либо анализ соотношения скоростей внутримолекулярной подвижности и общего диффузионного движения. Иными словами, складывается впечатление, что у авторов данной работы оказалась программа обработки данных больших биоорганических молекул и они воспользовались ею для исследования 17-эстрадиола (I) без предварительного ознакомления с общими принципами ее работы и границами применимости. В этой связи следует привести название статьи [109], в которой изложены эти принципы и границы применимости теории: – “Model-Free Approach to the Interpretation of Nuclear Magnetic Resonance Relaxation in Macromolecules. 1. Theory and Range of Validity”.

Аналогичные претензии можно высказать и авторам нескольких других работ [114117], в которых методология, разработанная для одного круга объектов, обладающих вполне определенным набором спектральных и релаксационных характеристик, переносится на другие молекулы, находящиеся в совершенно (или частично) иных условиях и обладающих, соответственно, иным набором спектральных и релаксационных параметров. Поэтому результаты таких работ требуют независимой проверки.

6-Окса-D-гомо-8-аналоги эстрогенов

Следует подчеркнуть, что экспериментальное наблюдение продольной скалярной релаксации и измерение ее скорости крайне затруднено из-за требования соизмеримости величины изменения протон-протонной скалярной константы в процессе химического обмена (JAB = JA - JB) и разности соответствующих частот оА - оВ [58, P. 213216]. Это предполагает сильносвязанность взаимодействующих протонов и незначительную разницу их химических сдвигов: в пределах 0.02 – 0.03 м.д. на частоте 300 МГц. Одновременное выполнение достаточно противоречивых требований для проявления скалярной релаксации и сложность ее регистрации при небольшой разнице химических сдвигов являются основной причиной небольшого числа доказанных примеров. Один из наиболее известных первых таких примеров был обнаружен в 1968 году при изучении ЯЭО между гидроксильным и метильными протонами в метаноле, в котором при рН 3 наблюдался максимальный отрицательный эффект до -85% [272]. Через год аналогичный эффект эти же авторы наблюдали в этаноле [273]. Из-за значительного различия ларморовых частот в гетероядерных системах известен лишь один пример наблюдения скалярной релаксации между разными магнитными ядрами в молекуле НF [274], которая происходит исключительно благодаря очень большой константе 1JН-F = 615 Гц. При оптимальных условиях обменная модуляция этой константы на частоте 90 МГц для ядер 1Н приводит в зависимости от скорости обмена к отрицательному усилению до 70% намагниченности ядер 19F. Еще один пример был представлен в работе [275] по конформационному анализу с помощью ЯЭО 2,4-динитрофенола в тетрагидрофуране на частоте 60 MГц. Несмотря на сравнительно слабый отрицательный эффект Оверхаузера между фенольным протоном и протоном в мета-положении, а также на небольшую величину скалярной константы между этими протонами (0.4 Гц), авторы пришли к заключению, что за аномальный ЯЭО ответственен скалярный механизм релаксации 1-го рода, связанный с образованием в исследуемой молекуле внутримолекулярной водородной связи. Хотя теоретическое обоснование возможности реализации в 2,4-динитрофеноле скалярного механизма было дано в работе [276], возникает вопрос в отношении выполнения необходимого условия сильносвязанности между взаимодействующими протонами при величине константы 0.4 Гц на частоте 60 МГц.

Аналогичный вопрос о зависимости скалярного вклада в скорость кросс-релаксации от рабочей частоты спектрометра рассматривался в работе [277] для случая макромолекул, находящихся в условиях приближения спиновой диффузии (ос 1). Ее авторы на основании сопоставления экспериментальных и расчётных вкладов диполь-дипольного и скалярного механизмов релаксации в ЯЭО на частотах 90 и 250 МГц пришли к выводу, что при выполнении указанных условий скалярный механизм релаксации 1-го рода уменьшается с увеличением рабочей частоты ЯМР-спектрометра и, следовательно, его вклад в ЯЭО для больших молекул не может играть существенной роли. Этот вывод вполне предсказуем по двум независимым причинам. Во-первых, с увеличением частоты спектрометра степень сильносвязанности между протонами уменьшается и, следовательно, уменьшается вклад скалярной релаксации 1-рода в скорость кросс-релаксации. Во-вторых, для больших молекул при условии ос 1 диполь-дипольный и скалярный механизмы имеют одинаковый по амплитуде отрицательный вклад в ЯЭО. Следовательно, на фоне диполь-дипольного вклада наблюдается лишь небольшое дополнительное увеличение скорости кросс-релаксации за счет скалярного механизма релаксации.

Совершенно иная ситуация реализуется для малых молекул в условиях экстремального сужения линий (ос 1), в которых конкуренция неодинаковых по амплитуде положительного диполь-дипольного вклада и отрицательного скалярного вклада в скорость кросс-релаксации может приводить к более заметным эффектам в виде, например, значительного ослабления наблюдаемого ЯЭО или даже к изменению его знака на противоположный [244, 270, 271]. Совершенно очевидно, что наблюдать конкуренцию двух разных механизмов релаксации лучше на сравнительно низких частотах 300-400 MГц, при которых сильносвязанность между взаимодействующими протонами повышает относительный вклад скалярного механизма [278, 279]. Более того, на высоких частотах начинает возрастать роль релаксации анизотропии химического сдвига (CSA – Chemical Shift Anisotropy), которая не имеет никакого отношения к кросс-релаксации, но является дополнительным механизмом внешней релаксации и приводит к ослаблению всех сигналов в спектре NOESY [280].

Несмотря на крайне ограниченное число литературных примеров доминирования скалярной релаксации первого рода, есть все основания предполагать, что это явление распространено значительно больше, чем это удается экспериментально доказать. Это утверждение непосредственно относится к таким молекулам как стероиды, которые имеют крайне сложный протонный спектр, содержащий большое число перекрывающихся протонных сигналов, для которых выполняется условие сильносвязанности, являющееся одним из важных необходимых условий проявления эффектов скалярной релаксации [58, c. 213217]. Другим условием является наличие химического обмена, приводящего к модуляции скалярных констант. Следовательно, обнаружение необычных проявлений скалярной релаксации не должно являться в таких системах чем-то неожиданным. В качестве примера можно рассмотреть изучение влияние температуры на перенос намагниченности (ЯЭО) от протона 15 (5.66 м.д.) к ближайшим к нему протонам 16 (2.67 м.д.) и 16 (2.54 м.д.) и к удаленным на значительное расстояние протонам 17 (2.40 м.д.) и 17 (2.78 м.д.) стероида (VII), которое представлено на рисунке 1-10. Сопоставление 5-ти экспериментов NOE-difference в узком температурном интервале от 25 до 45 С приводит неожиданному выводу о том, что сравнительно небольшое повышение температуры приводит к изменению на противоположное относительных интенсивностей ЯЭО между перечисленными протонами.

D-Гомоаналоги эстрогенов природного ряда

Однако, в этом двумерном спектре из-за относительно невысокого цифрового разрешения точность ее определения путем измерения величины расщепления между противофазными компонентами кросс-пика невелика ( ±0.5 Гц). Более того, измеренное значение в этом случае является, как правило, завышенным по сравнению с действительной величиной JН-Н [102]. Поэтому более точное значение 3J8-14 = (6.8 ± 0.1) Гц было получено из анализа в спектре J-COSY проекций компонент этого же сигнала на ось F1, которые соответствуют величинам констант скалярного взаимодействия Jij (Гц), измеренным относительно химических сдвигов сигналов i, т.е. относительно центра симметрии их мультиплетной структуры. Следует отметить, что спектр J-COSY, обладающий значительно большей цифровой разрешающей способностью по оси F1 ( 0.1 Гц), чем спектр DQF-COSY (по координате F2 0.5 Гц), сам по себе не несет никакой информации о принадлежности измеряемой константы конкретному скалярному взаимодействию. Поэтому использование результатов его анализа в виде точных значений скалярных констант не может считаться корректным без дополнительного доказательства их происхождения. Оно может быть получено с помощью одного из известных гомоядерных корреляционных методов с фазочувствительным детектированием или, если есть возможность для селективного облучения, с помощью методов селективной “развязки” скалярных взаимодействий.

В качестве другого примера на рисунке 2-22.2 показано определение вицинальной константы 3J7-8 из анализа мультиплетной структуры сигнала протона 7 в спектре ЯМР 1Н стероида (36), который из-за наложения сигналов протонов 8 и 9 в области 2.55 - 2.70 м.д., согласно данным спектральной симуляции, в зависимости от соотношения между константами 3J8-9, 3J8-7, 4J7-9 и разностью химических сдвигов 8,9 = 8 - 9, помимо линий, соответствующих спектру первого порядка, может содержать различное число дополнительных комбинационных линий. Поэтому для определения точного значения вицинальной константы 3J7-8 требуется полная идентификация всех компонент мультиплетной структуры сигнала 7, включая комбинационные линии (см. линии 3, 8, 13 и 18). В результате сопоставления расчетного (Рис. 2-22.2а) и экспериментального (Рис. 2-22.26) спектров было получено точное значение константы 3J7-8 = (4.1±0.1) Гц.

Необходимо отметить, что при расчетах теоретических спектров не учитываются релаксационные эффекты, которые проявляются в реальных спектрах ЯМР сильносвязанных спиновых систем в виде неодинакового уширения линий, принадлежащих различным спиновым состояниям магнитного ядра, скалярно связанного с наблюдаемым протоном. Этот релаксационный эффект хорошо виден в экспериментальном спектре (рис. 2-22.26) при сравнении линий, принадлежащих а- и Р-состояниям ядерного спина протона 8: пары смежных линий 4,5, 9,10, 14,15, 19,20, соответствующие а-состоянию спина протона 8а, оказываются слившимися в результате их релаксационного уширения, а пары линий 1,2, 6,7, 11,12, 16,17, соответствующие его Р-состоянию, хорошо разрешены между собой, так как скорость их поперечной релаксации (р± = 1/Т2) заметно меньше, чем для линий, соответствующих а-состоянию спина протона 8а. Это различие в уширении линий связано с тем, что для положительной константы 3J7a-8a 0 и соотношения между химическими сдвигами 88а бэа именно низкочастотная a-часть (здесь a - состояние спина протона 7а) мультиплетного сигнала протона 8а находится в более сильносвязанном состоянии с протоном 9а, чем его высокочастотная Р-часть. Следовательно, эффективность нульквантовых переходов между еф- и Pa-состояниями ядер протонов 8а и 9а будет выше при нахождении спина протона 7а в а-состоянии. В свою очередь, дополнительное сокращение времени жизни спина протона 8а вызывает соответствующее уширение a-линий в спектре скалярносвязанного с ним протона 7а (Рис. 2-22.26). В результате этих релаксационных эффектов измерение вицинальной константы 3J7a-8a на сигнале протона 7а становится более сложным. Например, ее измерение между линиями 11 и 14 дает завышенный результат (4.2 Гц), а между линиями 12 и 15 - заниженный (3.9 Гц), по сравнению с действительным значением. Следовательно, среднее значение этих двух измерений (-4.1 Гц) является наиболее соответствующим константе 3J7a-8a.

Сравнение экспериментального и расчетного спектров сигнала протона 7а в стероиде (36) позволило также установить значение дальней скалярной константы 4J7a.9a = (1.2±0.1) Гц, которая оказалась на 0.2 Гц меньше, чем в стероиде (За). Это уменьшение вполне соответствует изменению величин торсионных углов Н7а_с7_с8_с9 (ф0 и Н9а_с9_с8_с7 при переходе от стероида (За) к (36), которые согласно данным метода РМЗ равны: ф1(3а) = 174.6, ф1(3б) = 163.5; ф2(3а) = 165.4, ф2(3б) = 152.5. Следовательно, дальняя константа 4J7a-9a достаточно чувствительна к конформационным изменениям в стероиде (36), связанным с введением метильной группы в положение 7р.

Структурные изменения в стероиде (36) по сравнению со стероидом (За) и соответствующее изменение его конформации, к которому приводит введение метильной группы в положение 7р, находят подтверждение и в результатах сравнительного изучения прямых диполь-дипольных взаимодействий (ЯЭО). Эти различия в их пространственном строении сильнее всего отражаются на соотношении величин ЯЭО между двумя парами протонов: 1/9а, 1/11а и 7а/15р, 7а/15а (Рис. 2-23а,б). На рисунке 2-23в показаны фрагменты спектров NOESY стероидов (За) и (36), соответствующие первой паре взаимодействий. Приведенные относительные величины объемных интегральных интенсивностей соответствующих кросс-пиков Sij (цифры под кросс-пиками) свидетельствуют о том, что в стероиде (За) отношение расстояний (гі.9а/гі-па)(3а) = (Si-n„/Si-9a)1/6 = (0.94)1/6 = 0.99, а в стероиде (36) составляет OiVri-iia) = (Si-na/Si.9a)1/6 = (2.2)1/6 = 1.14. Следовательно, по данным ЯМР в стероиде (За) п.9о П.па, а для стероида (36) наблюдается обратное соотношение: ri_9a гі.ца. Для того, чтобы на количественном уровне определить точность экспериментальных оценок этих расстояний, выберем одно из них - ri_9a, в качестве эталонного и воспользуемся расчетными данными для межпротонных расстояний, полученными в результате оптимизации геометрии стероидов (За) и (36) методом РМЗ (Рис. 2-23а, 6).

Модифицированные аналоги эстра-1,3,5(10),8(14)-тетраенов

При сопоставлении результатов, полученных с помощью изотропной и анизотропной моделей расчета межпротонных расстояний (Рис. 3-4), хорошо видно, что использование в качестве rэт. расстояния между геминальными протонами при атоме С12, имеющего полярный угол эт. = 35, приводит к относительно небольшим различиям между результатами экспериментальных оценок rij(ЯЭО) и rij(ЯЭО). Тем не менее, при использовании более корректной анизотропной модели расчета (сэт. сij) наблюдается, хотя и небольшое, но вполне заметное улучшение всех параметров, характеризующих линейную корреляцию между данными ЯМР и ММ+, по сравнению с аналогичными параметрами (приведены в скобках), полученными при сопоставлении этих же данных в случае использования изотропной модели расчета (сэт. = сij) межпротонных расстояний: А = -0.08 (-0.13), В = 1.02 (1.07), г = 0.989 (0.981), sd = 0.061 (0.082).

Таким образом, количественные оценки 15-ти межпротонных расстояний, полученные на основании данных по измерению скоростей кросс-релаксации ij и учета анизотропии диффузионного движения (D/D = 3.1), свидетельствуют о высокой (в пределах ±5%) степени соответствия конформации молекулы D-гомо-9-аналога (13) в растворе результатам оптимизации геометрии этой молекулы методом ММ+.

Среди полученных оценок межпротонных расстояний одним из наиболее важных результатов является значение 2.16 для расстояния между протоном 17 и протоном 18 этильного заместителя при атоме С13. Это значение является веским основанием для утверждения об отсутствии вращения этого заместителя вокруг простой связи С13-С18 и дает возможность для экспериментального доказательства его пространственного расположения относительно колец С и D молекулы стероида (13): метильная группа С18аН3 находится за пределами этих колец - в транс-ориетации относительно атома С14 (Рис 3-5). Согласно расчетам (ММ+) торсионный угол С18а-С18-С13-С14 для такой конформации равен 179.4, а торсионные углы Н18"_C18-C13-С12 и Н12«-С12-С13-С18 характеризующие “W”-ориентацию протонов 18`` и 12, составляют, соответственно, 176.6 и 172.2. Следовательно, независимым подтверждением указанной пространственной ориентации этильного заместителя может служить величина дальней скалярной константы которая составляет 1.5 Гц и достаточно хорошо проявляется как на сигнале протона 12 (1.24 м.д.) в спектре ЯМР 1Н (Рис. 3-5а), так и на сигнале протона 18``, полученного из F2-разреза (при 1.81 м.д.) повернутого на 45 спектра J-COSY (Рис. 3-5в).

Однако, само наличие небольшого расщепления линий каждого из этих сигналов (даже одинакового по величине) не может служить доказательством скалярного взаимодействия между соответствующими протонами, а использование гомоядерной селективной развязки в данном случае невозможно из-за практически полного наложения сигналов протонов 18`` (1.81 м.д.) и 11 (1.79 м.д.), последний из которых имеет скалярное взаимодействие с протоном 12 (3J11-12 12.5 Гц). Поэтому для доказательства скалярного взаимодействия протонов 18`` и 12 был использован анализ спектра DQF-COSY, а также сопоставление F2-проекций кросс-пиков 12/11 и 9/11 (Рис. 3-5г).

Рис. 3-5. а) – мультиплетная структура сигнала протона 12а в спектре ЯМР 1Н, б) – F1-разрез в спектре NOESY на частоте протона 17, в) – F2-разрезы в спектре J-COSУ сигналов протонов 18` и 18`` и г) – фрагменты спектра DQF-COSY стероида (13). Информация о дальних скалярных и пространственных взаимодействиях показана с помощью, соответственно, сплошных и пунктирных двойных стрелок на фрагменте молекулы.

Из представленных данных следует, что помимо кросс-пиков 12/12 и 12/11 (см. верхний фрагмент) в более высокочастотной области наблюдаются две значительно более слабые и разделенные между собой на 7 Гц синфазные компоненты кросс-пика 12/18``, каждая из которых имеет две противофазные составляющие с величиной расщепления около 1.5 Гц (показано на разрезе А-А) и, следовательно, свидетельствующие о наличии соответствующей активной константы 4J12-18``, которая на фрагменте молекулы стероида (13) указана сплошной двойной стрелкой. Следует отметить, что приведенные доказательства пространственной ориентации этильного фрагмента в виде наличия ЯЭО между протонами 17 и 18`` и дальнего “W”-типа скалярного взаимодействия между протонами 18`` и 12 являются достаточными, поскольку при другой возможной ориентации этильного заместителя над кольцом С (т.е. при повороте на 120 против часовой стрелки вокруг связи С18С13) должно было бы наблюдаться дальнее взаимодействие между протонами 18`и 12, аналогичное тому, которое было для предыдущей конформации (см. фрагмент молекулы на рисунке 3-5), а также скалярное взаимодействие “W”-типа между протонами 18`` и 14, для которых торсионные углы Н18``-С18-С13-С14 и Н14-С14-С13-С18 в такой конформации согласно расчетам (ММ+) составляют, соответственно, 159 и 169.

Поскольку наличие малой константы наблюдается только на одном из метиленовых протонов этильного заместителя, то возможность существования конформации молекулы стероида (13) с ориентацией этильной группы над кольцом С не имеет экспериментального подтверждения. Аналогичный вывод можно также сделать и на основании отсутствия у метильных протонов заместителя при атоме С13 пространственных взаимодействий c протоном 8, которое должно было бы наблюдаться в случае реализации указанной конформации. Кроме того, в пользу показанной на рисунке 3-5 ориентации этильного фрагмента свидетельствует наличие в спектре NOESY кросс-пика 17/18а, который отчетливо виден на F1-разрезе при 2.51 м.д. (17) этого спектра, показанного на рисунке 3-5б, а соответствующее пространственное взаимодействие протона 17, наряду с другими, указано с помощью пунктирной стрелки на фрагменте молекулы D-гомо-9-аналога (13).

Полученные экспериментальные данные противоречат и третьей возможной пространственной ориентации этильного заместителя над кольцом D. В этом случае ни один из протонов 18` или 18`` не может одновременно иметь скалярное взаимодействие “W”-типа с протоном 12 и пространственное взаимодействие (ЯЭО) с протоном 17. Следовательно, эта конформация молекулы стероида (13) в растворе не реализуется.