«Получение и структурное исследование биологически активных соединений на основе имидазолиевых ионных жидкостей» Сейткалиева Марина Максутовна

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 8

1.1 Общие сведения об ионных жидкостях и областях их применения 8

1.1.1 Общие сведения об ионных жидкостях 8

1.1.2 Области применения ионных жидкостей 15

1.2 Ионные жидкости в качестве среды для биологических соединений 18

1.2.1 Специфичное поведение биологических молекул в ионных жидкостях 18

1.2.2 Природа взаимодействий ионных жидкостей с биологическими молекулами 26

1.3 Изучение природы взаимодействий ионных жидкостей с биомолекулами с помощью

различных теоретических и физико-химических методов. Спектроскопия ЯМР ионных

жидкостей 29

1.3.1 Теоретические и физико-химические методы изучения природы взаимодействий ионных жидкостей с биомолекулами 29

1.3.2 Спектроскопия ЯМР в ионных жидкостях 32

1.4 Использование ионных жидкостей для выделения биологических молекул 38

1.4.1 Существующие системы выделения на основе ионных жидкостей 38

1.4.2 Изучение механизмов распределения вещества в системах на основе ионных жидкостей 42

1.5 Токсичность, экологическая безопасность и биоразлагаемость ионных жидкостей 45

1.5.1 Токсичность и экологическая безопасность ионных жидкостей 45

1.5.2 (Био)разложение ионных жидкостей 50

1.6 Использование ионных жидкостей в медицине 53

2. Обсуждение результатов 63

2.1 Изучение стабилизирующего/дестабилизирующего действия ионных жидкостей на аминокислоты и пептиды 63

2.2 Разработка систем для экстракции пептидов из ионных жидкостей и изучение механизма процесса 80

2.3 Исследование токсичности ионных жидкостей, синтез функционализированных ионных жидкостей и определение их биологической активности 87

2.4 Синтез функционализированных фармацевтическими компонентами ионных жидкостей и определение их биологической активности 96

3. Экспериментальная часть 106

3.1 Общие сведения 106

3.2 Экспериментальная часть для раздела 2.1 «Изучение стабилизирующего/дестабилизирующего действия ИЖ на аминокислоты и пептиды» 107

3.3 Экспериментальная часть для раздела 2.2 «Разработка систем для экстракции пептидов из ионных жидкостей и изучение механизма процесса» 111

3.4 Экспериментальная часть для раздела 2.3 «Токсичность ИЖ, синтез функционализированных ИЖ и определение их биологической активности» 112

3.5 Экспериментальная часть для раздела 2.4 «Синтез функционализированных фармацевтическими компонентами ионных жидкостей и определение их биологической активности» 115

3.6 Исследование цитотоксического действия ионных жидкостей 121

Выводы 124

Благодарность 125

Список использованных сокращений 126

Список использованной литературы 1

• Ионные жидкости в качестве среды для биологических соединений
• Изучение механизмов распределения вещества в системах на основе ионных жидкостей
• Разработка систем для экстракции пептидов из ионных жидкостей и изучение механизма процесса
• Экспериментальная часть для раздела 2.3 «Токсичность ИЖ, синтез функционализированных ИЖ и определение их биологической активности»

Введение к работе

Актуальность темы. В последние десятилетия ионные жидкости (ИЖ) нашли широкое применение в различных приложениях, в том числе биологических и биотехнологических процессах. Ионные жидкости показали способность растворять белки, углеводы, ферменты, ДНК и другие природные соединения и биомолекулы, которые в обычных растворителях растворяются плохо или быстро теряют свои свойства. При этом многие ионные жидкости увеличивают эффективность, активность и селективность ферментативных реакций, повышают термическую стабильность белков, позволяя в течение длительного времени сохранять их специфичные свойства. Немаловажным преимуществом использования ионных жидкостей является низкое давление насыщенных паров, негорючесть, высокая термическая и химическая устойчивость. Взаимодействие между ионными жидкостями и биомолекулами в настоящее время всесторонне изучается, однако связь между строением аминокислот, пептидов и белков и необычными свойствами, проявляемыми ими в системах на основе ионных жидкостей, остается неисследованной. Природа и последовательность аминокислот во многом отвечают за индивидуальные характеристики белковых

молекул, поэтому исследование взаимодействии между ионными жидкостями и пептидами позволит получить важную информацию о стабильности белков и расширит возможности их применения в биотехнологии, химической и фармацевтической промышленности. Изучение биологических молекул в ионных жидкостях в отсутствие других растворителей является важной и одновременно сложной задачей, требующей соответствующих методологических подходов.

Важным этапом биотехнологических процессов является селективное выделение и очистка биомолекул. В качестве альтернативы низкокипящим органическим растворителям в процессах выделения и очистки с недавнего времени часто применяют ионные жидкости, обладающие превосходной растворяющей способностью, а также оказывающие активирующее/стабилизирующее воздействие. Изучение природы взаимодействий между биомолекулами и ионными жидкостями, а также влияния различных условий на распределение веществ между фазами в процессе экстракции и

Ч.У V/

^{механизма, по которому протекает этот процесс, является актуальной задачей.}

\s

**

Исследования взаимодействий биологических объектов с ионными жидкостями неразрывно связаны с изучением биологической активности самих ионных жидкостей. Долгое время считалось, что они являются альтернативными экологически безопасными средами, однако эксперименты показали, что это предположение не всегда верно. Токсичность ионных жидкостей сравнима, а в некоторых случаях выше, чем токсичность органических растворителей. Предполагают, что введение природных биологических молекул, таких как аминокислоты, в состав ионных жидкостей является эффективным способом снижения их токсичности и повышения биосовместимости, однако детально этот вопрос не исследовался. Помимо изучения токсичности известных

ионных жидкостей, также исследуется возможность создания ионных жидкостей с заданной биологической активностью. В настоящее время введение биологически

^{активных соединений в состав ионных жидкостей считается перспективным способом}

\_/ \_/ *_'

получения высокоактивных веществ, которые могут найти применение в медицине и биологии. Новые стратегии использования ионных жидкостей предполагают получение

лекарственных средств с низкой температурой плавления, улучшенной растворимостью, повышенной биодоступностью и высокой биоразлагаемостью.

Целью исследования являлось получение и структурное исследование пептидных и биологически активных систем на основе имидазолиевых ионных

\_/

^{жидкостей.}

Задачами данного исследования являлись: 1) изучение взаимодействий между имидазолиевыми ионными жидкостями и модельными аминокислотами и пептидами с помощью спектроскопии Я MP; 2) изучение механизма экстракции пептидных соединений из ионной жидкости в органическую фазу с помощью спектроскопии ЯМР и разработка эффективных систем для разделения смеси структурно схожих биомолекул;

1. изучение влияния аминокислотных заместителей на токсичность ионных жидкостей;

2. изучение биологической активности известных ионных жидкостей и ионных жидкостей, функционализированных фармацевтическими компонентами.

Научная новизна и практическая значимость

1. Впервые с помощью спектроскопии ЯМР было подробно изучено стабилизирующее/дестабилизирующее действие ионов серии Гофмейстера на ряд модельных соединений на основе аланина и валина в чистых ионных жидкостях. Было показано, что растворимость исследуемых соединений определяется гидрофобностью их боковых групп и природой катионов и анионов ионных жидкостей. На примере дипептида было показано, что стабилизирующее действие анионов не соответствует прямому порядку серии Гофмейстера.

2. Была обнаружена зависимость растворимости пептидов в ионной жидкости от их длины и аминокислотной последовательности. Выявленные закономерности взаимодействий между имидазолиевыми ионными жидкостями и модельными пептидами позволят в будущем подбирать наиболее эффективные и биосовместимые среды для биомолекул.

3. Впервые с помощью послойной спектроскопии ЯМР (slice-selective NMR) было показано, что процесс перехода молекулы пептида из ионной жидкости в органическую фазу соответствует случаю молекулярной экстракции, при которой молекулы вещества движутся индивидуально, не образуя супрамолекулярных ассоциатов. Была разработана эффективная система, позволяющая селективно выделять пептиды из смеси. Молекулярная природа механизма экстракции и сохранение структурной целостности биомолекул после выделения свидетельствуют о большом потенциале систем на основе ионных жидкостей для выделения биомолекул в нативном состоянии.

4. Впервые была изучена цитотоксичность ионных жидкостей, содержащих аминокислоты глицин, аланин и валин. Было показано, что введение аминокислот в состав ионных жидкостей не всегда приводит к снижению их токсичности. Токсичность

^{ионных жидкостей с аминокислотными анионами была сравнима с токсичностью}

*'

^{хлоридных и лактатных имидазолиевых ионных жидкостей, в то время как введение}

аминокислот в состав катиона впервые синтезированных ионных жидкостей приводит к значительному повышению токсичности. Было показано, что ионные жидкости с аминокислотными анионами, как и обычные ионные жидкости, вызывают апоптоз клеток (запрограммированную клеточную смерть). Высокая биологическая активность, которую можно направленно менять посредством изменения структуры ионных жидкостей, и вызываемый ими апоптоз свидетельствуют о противоопухолевом потенциале аминокислотных ионных жидкостей.

5. Была изучена токсичность известных ионных жидкостей с салицилатным
анионом и впервые синтезированных ионных жидкостей с функционализированными
салициловой кислотой катионами. Было показано, что биологическая активность
функционализированных ионных жидкостей сравнима с активностью салициловой
кислоты; причем многие из функционализированных ионных жидкостей являются
жидкими при комнатной температуре и обладают хорошей растворимостью в воде, что
повышает их биодоступность. Использование салициловой кислоты в качестве аниона, а
также функционализация ею катионов позволяет получать соединения с
усовершенствованными физико-химическими свойствами, улучшенной

растворимостью, низкой температурой плавления и высокой биологической активностью.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано три статьи в научных журналах, рецензируемых и индексируемых в признанных международных системах цитирования, и четыре тезиса в сборниках докладов научных конференций. Основные результаты работы представлены в виде докладов на: Всероссийской научной конференции с международным участием «Успехи синтеза и комплексообразования» (Москва, Россия, 2014); Всероссийской конференции «VI молодежная конференция ИОХ РАН» (Москва, Россия, 2014); Международной конференция «International Conference Molecular Complexity in Modern Chemistry (MCMC-2014)» (Москва, Россия, 2014); VI Всероссийской конференции «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (Казань, Россия, 2015).

Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на 162 страницах. Работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка используемой литературы. Библиография насчитывает 453 наименования.

Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность к.х.н. Качале В.В. и к.х.н. Грачеву А.А. за совместные ЯМР-исследования; к.б.н. Посвятенко А.В. (институт Биологии гена РАН) и к.б.н. Егоровой К.С. за проведение экспериментов по определению токсичности.

Проведенные исследования поддержаны грантом РФФИ № 14-03-31478 мол_а (2014-2015).

Ионные жидкости в качестве среды для биологических соединений

Природу взаимодействий между биомолекулами и ИЖ изучали различными физико-химическими и теоретическими методами. С молекулярной точки зрения уникальные сольватирующие свойства ИЖ проявляются вследствие различных взаимодействий с биомолекулами: прямых (водородные связи) и дальнодействующих (электростатические взаимодействия). Tome и коллеги изучали поведение пяти различных аминокислот в системе вода - [BMIMJ[NTf2]. Было показано, что сольватная структура аминокислот определяется равновесием между двумя конкурирующими взаимодействиями аминокислот с ионами ИЖ и водой в зависимости от гидрофобности аминокислот [164]. В теоретической работе, посвященной изучению механизма растворения ДНК в ИЖ, было показано, что структура ДНК стабилизирована в различных ИЖ сильными водородными взаимодействиями катиона ИЖ со связями Р—О фосфатных групп ДНК [165]. В другой теоретической работе было показано, что сильные взаимодействия между ИЖ и ферментами, напротив, приводят к дестабилизации и уменьшению активности последних. Так, более гидрофильные и небольшие по размеру анионы сильнее взаимодействуют с липазами, что приводит к их дестабилизации [166]. Сериновая протеаза кутиназа менее стабильна в [ВМГМ][1ЧОз] по сравнению с [BMIM][PF6] вследствие сильного сродства нитрат-аниона к белку. В [BMIMJfPFe] кутиназа существует преимущественно в нативной форме при температуре окружающей среды, стабильность сохраняется даже при повышенных температурах [ 167].

Изучение сольватационного поведения металлсвязанного пептида феррихрома, осуществляющего важную транспортную функцию в бактериях и грибах, показало, что существенное влияние на его стабильность оказывают электростатические взаимодействия и способность ИЖ образовывать водородные связи [168]. Моделирование проводили в газовой фазе; конформация пептида в полярных растворителях и ИЖ была значительно искажена вследствие электростатических взаимодействий между пептидом и окружающими ионами. Катион ВМ1М+ обеспечивает наиболее стабильное окружение даже при высокой температуре. Связи между хлорид-ионами [ВМ1М][С1] и гидроксильными группами пептида преобладают над внутримолекулярными водородными связами, обнаруженными в других растворителях.

Shim и коллеги показали, что ключевым аспектом к пониманию стабилизации белков в среде ИЖ является равновесие между прямыми близкодействующими водородными связями, непрямыми дальнодействующими электростатическими и гидрофобными взаимодействиями [132]. Paluch и коллеги предполагают, что сольватацию гидрофобных аминокислот преимущественно определяют неполярные области на катионах ИЖ и, в незначительной степени, анионы. С другой стороны, в случае гидрофильных аналогов сольватация преимущественно определяется взаимодействиями между аминокислотами и полярными областями на анионах и, незначительно, катионами [169].

Преобладание электростатических взаимодействий фермента с анионом над незначительными взаимодействиями с катионом наблюдали при изучении взаимодействий между ферментами и ИЖ. Небольшие анионы, обладающие высокой плотностью заряда, в большей мере конкурировали с водой или акцепторами водорода на поверхности белка (амидными протонами), оказывая существенное влияние на стабильность белка и его растворимость, поскольку внутренняя структура ИЖ изменяется, и образование сольватной оболочки становится менее энергетически выгодно [167, 132].

В присутствии растворенного вещества микроструктура чистой ИЖ зависит от его топологии и содержания воды: полярные и неполярные области на поверхности фермента структурируют ионы ИЖ. В присутствии большого количества воды ионы имеют тенденцию собираться у областей с противоположным зарядом. В отсутствие воды противоположно заряженные ионы ИЖ попеременно формируют оболочки на поверхности белка. Это может быть связано с высоким дипольным моментом молекул воды и их высокой подвижностью, что позволяет воде проникать в полости и экранировать электростатические взаимодействия [170]. Таким образом, первая сольватная оболочка пептидов с суммарным положительным зарядом преимущественно состоит из катионов, что является косвенным следствием выталкивания катионов сетью, образованной анионами и водой.

ИЖ, своеобразный класс соединений, отличающихся по свойствам от обычных органических растворителей, по-разному влияют на биомолекулы. Полученные закономерности хорошо воспроизводятся при моделировании, однако ясной картины поведения белков в ИЖ не складывается, поэтому исследователи пытаются снизить уровень сложности, моделируя небольшие пептидные последовательности.

Уникальное поведение биомолекул в ИЖ изучают с помощью различных физико-химических методов, таких как оптическая спектроскопия (UV-vis; нативное и развернутое состояние белка, образование комплексов между ИЖ и белками) [171, 172], Фурье-ИК-спектроскопия (FTIR) (вторичная структура белка) [173,174], рамановская спектроскопии (вторичная и третичная структура белка) [175], спектроскопия кругового дихроизма (вторичная и третичная структура белка) [153, 176, 177], анализ флуоресценции триптофана (третичная структура белка и механизм образования комплексов между ИЖ и белками) [153, 178], динамическое светорассеяние (размер и структура агрегатов белков в ИЖ) [179], малоугловое нейтронное рассеяние (SANS) (форма, размер и структура агрегатов белка в ИЖ) [102, 180], тензиометрия (стехиометрия процесса связывания) [181, 182], микрокалориметрия (стехиометрия процесса связывания) [135, 183], спектроскопия ЯМР (конформация белков в системах ИЖ) [178].

Изучение механизмов распределения вещества в системах на основе ионных жидкостей

Изучение природы взаимодействий между биомолекулами и ИЖ, влияния различных условий на распределение веществ между фазами в процессе экстракции и механизма, по которому протекает этот процесс, является важной задачей, решение которой позволит предсказывать и подбирать более высокоэффективные системы в каждом конкретном случае.

Множество исследований было посвящено изучению механизма процесса экстракции в системах на основе ИЖ. Комбинируя различные физико-химические методы - определение проводимости, динамическое светорассеяние (DLS) и просвечивающую электронную микроскопию (ТЕМ) - исследовали микроструктуру двухфазных систем «ИЖ - вода» и механизм экстракции [218, 250-253].

Было показано, что химическая структура и химические свойства аминокислот влияют на их специфичное поведение и распределение в двухфазной системе с ИЖ. Распределение зависит от рН водного раствора: если рН меньше, чем рКа карбоксильной группы, то аминокислоты находятся в катионной или дикатионной форме; с увеличением рН карбоксильная и аммонийная группы начинают диссоциировать в зависимости от кислотности/основности аминокислот. Таким образом, в растворе могут существовать различные формы аминокислот, и на процесс распределения будут влиять различные взаимодействия. Предполагают, что экстракция аминокислот протекает по ионообменному механизму [254]: [RNH3]+(BOfl.) + [C6MIM]+[BF4]- = [СвМШ]%рд.) + [RNH3]+[BF4]-[RCO2]-(BOfl0 + [C6MIM]+[BF4]- — [BF4]-(BOfl.) + [C6MIM]+[RC02]" где [RNH.3]+(BOfl.) и [RCO2] (вод.) - это катионная и анионная форма аминокислот в водном растворе, [RNH3]+[BF4] и [СбМ1М]+[ЯС02]" - экстрагируемые в фазу ИЖ формы аминокислоты в катионной и анионной форме.

Ионную силу растворов поддерживали постоянной, добиваясь преобладания катионной либо анионной формы аминокислот (нейтрального аланина, кислой глутаминовой кислоты и основного лизина). В случае катионной формы коэффициент распределения снижался при увеличении количества [СбМ1М][Вг], добавленного к водной фазе, и равновесие на схеме смещалось влево в результате катионного обмена. Подобные изменения коэффициента распределения наблюдались и для анионной формы аминокислот при добавлении NaBF4. Аналогичный механизм был предложен и в других работах [255-257]. Главной движущей силой процесса экстракции гемоглобина в гидрофобную ИЖ ([Btmsim][PF6]) является образование связей между атомом железа гемовой группы белка и катиона ИЖ, что было подтверждено с помощью 57Fe Мессбауэровской спектроскопии и спектроскопии кругового дихроизма [258].

Аналогично, цитохром с был эффективно ( 85 %) экстрагирован из водного раствора в [Btmsim] [РБб] (3 мл водного раствора цитохрома с (5 мкг/мл, 400 мкл ИЖ, 30 мин). Механизм экстракции исследовали с помощью оптической спектроскопии и спектроскопии кругового дихроизма. Было показано, что в кислой среде (рН 5) фермент претерпевает конформационные изменения: наблюдается разворачивание пептидной цепи с экспонированием гидрофобных гемовых групп в окружающую среду, что приводит к растворению белка. При рН=1 происходит образование координационной связи между катионом Btmsim+ и атомом железа гемовой группы, что облегчает переход фермента в фазу ИЖ [259].

Влияние рН и начальной концентрации компонентов на распределение лекарственного препарата цефалексина в двухфазных системах «вода - ИЖ» было проанализировано с помощью статистических методов (методология поверхности отклика, Response Surface Methodology). С помощью Фурье-ИК-спектроскопии продемонстрировали, что структура цефалексина не изменилась после процесса экстракции, а химические взаимодействия между веществом и [C4MIM][BF4] во время экстракции отсутствовали. Микроскопическая структура верхней фазы была исследована с помощью динамического светорассеяния, определения проводимости и просвечивающей электронной микроскопии; наблюдали образование кластеров, представляющих собой агрегаты ИЖ-цефалексин, что может являться движущей силой экстракции из водной фазы [260].

Двухфазные системы [OMIM][Br] - К2НРО4 показали свою эффективность при экстракции белков (альбумина, гемоглобина, лизоцима) из водной фазы в ИЖ. При рН фосфатного раствора близком к изоэлектрической точке маленький заряд на белке позволял ему переходить из фосфатной фазы в ИЖ за счет гидрофобных взаимодействий между аминокислотными остатками и имидазолиевым кольцом. Помимо гидрофобных взаимодействий на эффективность экстракции также влияют электростатические взаимодействия и эффект высаливания. Повышение температуры влияет на эффективность экстракции, но негативно сказывается на активности белков [253].

Двухфазные водные системы [МІМ] [О] - К2НРО4 успешно применяли для экстракции белков из биологических жидкостей. Фурье-ИК-спектроскопия и оптическая спектропия не показали наличия взаимодействий между ИЖ и белками, структура белка после экстракции не изменялась [233]. Влияние длины боковой цепи имидазолиевого катиона на эффективность экстракции алкалоидов (никотин, кофеин, теофиллин, теобромин), имеющих различную гидрофобность, исследовали в двухфазных системах «вода - ИЖ», состоящих из [CnMIM] [С1] (п=4, 6, 7, 8 и 10) и водного раствора цитрата калия (при различных рН). Было показано, что коэффициент распределения увеличивается с удлинением боковой цепи до [СбМ1М][С1]; при дальнейшем увеличении гидрофобности ИЖ коэффициент распределения начинает снижаться. Предположительно, дальнейшему росту эффективности экстракции препятствует процесс самоагрегации ИЖ. Образование мицелл в двухфазных водных системах наблюдали с помощью ТЕМ, причем с увеличением длины боковой цепи размер мицелл увеличивался [261]. DLS- и ТЕМ-исследования также выявили образование агрегатов в верхней ИЖ-фазе при экстракции белков из водной фазы [252, 253].

Межмолекулярные взаимодействия, молекулярные структуры и водородные связи между [ВМ1М][РРб] и тремя природными биологически активными гомологами (агликонами изофлавоноидов сои) в качестве модельных соединений были исследованы методами теоретического моделирования и экспериментально. Экспериментальный коэффициент распределения генистеина составлял 182.6 в системе [BMIM][PF6] - вода. Кроме того, селективность извлечения генистеина по отношению к даидзеину и глицитину была равна 3. Наблюдалась хорошая корреляция между результатами DFT- и MD-моделирования, показывающими наличие водородных связей в первой сольватационной оболочке между анионами ИЖ и гидрокси-группаами фенола агликонов. Также было показано, что в процессах выделения анионы ИЖ играли большую роль, чем катионы [262].

Хорошие результаты были получены в случае применения двухфазной водной системы ([HOEMIM][NTF2] - НБОз-вода) при извлечении кератина из куриных перьев. Извлеченный кератин хорошо растворяется в воде, что способствовало легкому выделению его из реакционной системы. Удалось добиться 21 % выхода при массовом соотношении 6noMacca:NaHS03 = 1:1 и соотношении биомасса:ИЖ = 1:40 при 80 С в течение 4 часов. ИЖ регенерировали и использовали без потери эффективности в пяти циклах [263].

Дисперсная жидкостная микроэкстракция in situ с ИЖ была использована для выделения и концентрирования ДНК. Высокие значения были получены в случае [СібРОНІМ][Вг]) и [(Cio)2NMDG][Br]. Эффективность экстракции достигала 97 % при использовании небольших количеств ИЖ (0.5 мг) для каждой микроэкстракции с общей продолжительностью 5 минут. Наличие металлов не мешало процессу экстракции ДНК, проведение процесса в слабокислых условиях приводило к снижению эффективности. С помощью Р ЯМР-спектроскопии наблюдали увеличение эффективности экстракции при увеличении концентрации. Также было показано, что при формировании комплексов ИЖ-ДНК доминируют электростатические и

Разработка систем для экстракции пептидов из ионных жидкостей и изучение механизма процесса

Из структуры дивалина следует, что наиболее вероятными центрами связывания анионов ИЖ и пептида являются амидные группы. При изучении ]Н ЯМР-спектров дивалина был обнаружен сдвиг амидного протона в слабое поле в [ЕМ1М][ОАс] (на 1 ррт) и в [EMIM] [L-lac] (на 1.5 ррт) по сравнению с [EMIM][SCN], для остальных протонов сдвигов сигналов обнаружено не было. Наблюдаемое изменение химического сдвига может являться следствием более сильного взаимодействия пептидной связи с анионом ИЖ, приводящего к лучшей растворимости, что согласуется с полученными результатами. Подобные закономерности наблюдали в других работах для пептидов и белков в водном растворе ИЖ [208].

Ранее было показано, что в случае пептидов, защищенных с двух сторон, взаимодействие анионов с пептидной связью сильнее в случае больших мягких анионов по сравнению с малыми жесткими анионами, обладающими высокой плотностью заряда. Это согласуется с прямым порядком высаливающего действия серии Гофмейстера. Наоборот, когда петиды или белки не ограничены с двух сторон, взаимодействие с положительно заряженным N-концом приводит к разворачиванию серии Гофмейстера вследствие комплексного эффекта, включающего множество взаимодействий с пептидом. Исследование проводили в водных растворах солей различной концентрации [385].

В данном случае стабилизирующее действие ионов не совпадает с прямым порядком серии Гофмейстера: ацетат-анион, стоящий в ряду слева от аниона СГ, должен проявлять высаливающие свойства, однако в данном концентрационном интервале дивалин растворялся в нем полностью. Анионы BF4" и HSO4 не взаимодействуют с пептидной связью дивалина, а также защищенными N- и С-концами пептида. СГ относится к нейтральным ионам в серии Гофмейстера и проявляет малое сродство к указанным группам. SCN" также проявляет небольшое сродство к данным группам. L-lactate демонстрирует поведение, аналогичное О Ас". Сообщали, что SCN" обнаруживает сродство к N-концу защищенного с двух сторон триглицина, способствуя его растворению [385]. Подобные результаты в случае SCN" были получены и для пептапептида Val-Pro-Gly-Val-Gly; где было показано, что предпочтительными местами связывания аниона являются амидная группа и СНг-группы глицина [386]. Несоответствие ацетат-аниона стабилизирующему ряду Гофмейстера также ранее наблюдали при изучении водных растворов глициновых, аланиновых и валиновых пептидов в ИЖ; этот эффект объясняли слабой гидратацией и повышением гидрофобности аниона. Так, стабильность лизосомы в присутствии [ЕМ1М]+ ИЖ снижалась в зависимости от природы аниона в следующем порядке: Cl" EtS04 MDEGS04 EtP04 CH3COOosylatoHexSCV, где ацетат-анион также оказывал более дестабилизирующее влияние, чем хлорид-анион [387]. Кааг и коллеги также наблюдали инактивацию ферментов в присутствии ацетат-иона [42].

Растворимость тривалина в [EMIM] [ОАс] оказалась такой же, как и в случае дивалина, и составила 0.047 г из 0.05 г, что отличается от поведения данных пептидов в [EMIM] [CI].

Также важным является анализ вклада в значение растворимости катиона ЕМ1М+, однако результаты многочисленных исследований показали, что обычно катион влияет меньше, чем анион. Так, более гидрофобные катионы с длинной алкильной цепью снижают активность ферментов, блокируя их неполярные активные группы; в то же время, наблюдались прямые взаимодействия ферментов с анионами ИЖ [388]. Влияние катиона или аниона на стабильность трудно объяснить вследствие сложности процессов, протекающих в растворе и включающих координацию с ионами, различные структурные перестройки, а также специфичные физико-химические явления. Кроме того, известно, что ИЖ ведут себя не как обычные соли, а образуют упорядоченные микрогетерогенные структуры, что является одной из уникальных особенностей ИЖ. Было показано, что размер этих гетерогенных областей может меняться от нанометрового до микрометрового диапазонов и зависит от типа аниона и катиона. Формирование данных доменов значительно меняет характер ИЖ и является причиной многих уникальных свойств, обнаруживаемых ИЖ, в том числе по отношению к биомолекулам.

Полученные результаты позволяют предположить, что различная растворимость является следствием различной гидрофобности соединений. Гидрофобность аланина (-2.09 кДж/моль) ниже, чем гидрофобность боковых групп валина и лейцина (-6.28 кДж/моль и -7.53 кДж/моль, соответственно) [389] (количественной мерой гидрофобности аминокислоты принимают значение изменения свободной энергии, приходящееся на боковую группу при переносе 1 моля аминокислоты из этанола в воду). Имеет место отталкивание между ионами ИЖ и гидрофобными боковыми алкильными группами пептидов; ранее подобное наблюдали для пептидов в водных растворах солей и водных растворах ИЖ. Для ряда Вос-А1а-ОМе Вос-А1а-А1а-ОМе Вос-А1а-А1а-А1а-ОМе наблюдается одинаковая растворимость, которая не снижается с удлинением цепи и повышением гидрофобности. Для пептидов валинового ряда Boc-Val-Val-OMe Boc-Val-Val-Val-OMe Boc-Val-OMe Boc-Val-Val-Val-Val-OMe повышение гидрофобности и снижение растворимости носит нелинейный характер. Однако в общем для этого ряда преобладает стабилизирующий эффект [ЕМ1М][С1].

Чтобы подробнее исследовать наблюдаемое явление, были синтезированы еще четыре молекулы, несущие более гидрофобные боковые алкильные группы. Были использованы аминокислоты лейцин и изолейцин, являющиеся структурными изомерами. На основе этих аминокислот были синтезированы две защищенные аминокислоты Boc-Leu-OMe и Вос-Пе-ОМе и два дипептида Boc-Leu-Leu-OMe и Вос-Ие-Ие-ОМе (рисунок 2.7). Пробоподготовка осуществлялась так же, как в случае с вышеописанными образцами, однако вследствие их более высокой гидрофобности первоначально наблюдалось застывание образца, поэтому температура перемешивания и съемки спектра ЯМР была увеличена до 85 С.

Экспериментальная часть для раздела 2.3 «Токсичность ИЖ, синтез функционализированных ИЖ и определение их биологической активности»

Общая процедура синтеза метилового эфира N-трет-бутилкарбонила аминокислоты (Boc-Ala-OMe, Boc-Val-OMe, Boc-Leu-OMe, Вос-Пе-ОМе) [425].

К раствору N-Boc-производного аминокислоты (2 ммоль) в CH2CI2 (3 мл) добавляли ДЦК (1 ммоль) и ДМАП (0.2 ммоль), затем по каплям метанол (1.5 ммоль) и перемешивали при охлаждении (ледяная баня (лед/соль)) в течение часа. Затем перемешивание продолжали в течение 16 часов при комнатной температуре. После окончания реакции осадок отфильтровывали, растворитель из фильтрата отгоняли на роторном испарителе. Остаток вновь растворяли в этилацетате и отфильтровывали, фильтрат промывали 2 М раствором НС1 (2x5 мл), насыщенным NaCl (3.6 г/10 мл, 2x5 мл), 0.1 М раствором NaOH (3x5 мл) и снова насыщенным NaCl (3.6 г/10мл, 2x5 мл). Органическую фазу сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали, продукт выделяли колоночной хроматографией. Полученные продукты представляли собой твердые белые вещества. Выход 82-88%.

Общая процедура синтеза метилового эфира 1Ч-/и/ »!-бутоксикарбонильного производного дипептида (Boc-Ala-Ala-OMe, Boc-Ala-Val-OMe, Boc-Val-Val-OMe, Boc-Val-Ala-OMe, Boc-Leu-Leu-OMe, Boc-Ile-Ile-OMe) [426].

N-Вос-производное аминокислоты (1 ммоль) растворяли в CH2CI2 (3 мл), добавляли ДЦК (1 ммоль) и ДМАП (0.1 ммоль) и полученную смесь перемешивали при 0 С. Затем добавляли раствор метилового эфира аминокислоты (1.1 ммоль) в СТЬСЬ (Змл), предварительно приготовленный из гидрохлорида действием Et3N (1 ммоль). Смесь перемешивали при 0 С в течение 1 часа и затем при комнатной температуре в течение ночи.

Реакционную смесь отфильтровывали и отгоняли растворитель на роторном испарителе, осадок растворяли в холодном этилацетате и снова отфильтровывали образовавшийся осадок. Фильтрат промывали 2 М раствором НС1 (2x5 мл), насыщенным NaCl (З.бг/Юмл, 2x5 мл), 0.1 М раствором NaOH (3x5 мл) и снова насыщенным NaCl (3.6 г/10 мл, 2x5 мл). Органическую фазу сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали. Полученный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этил ацетат). Продукты представляли собой твердые белые вещества. Выход 78-88%.

Общая процедура синтеза /и/7е и-бутоксикарбонила дипептида (Вос-А1а-А1а, Boc-AIa-Val, Boc-Val-Val, Boc-Val-Ala) [427]

Метиловый эфир N-m/?em-6yTOKCHKap6oHRiia дипептида (1 ммоль) растворяли в метаноле (2 мл), затем по каплям добавляли 0.5 М раствор NaOH (0.5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 5 часов при комнатной температуре. После этого отгоняли метанол, остаток растворяли в воде (3 мл) и промывали диэтиловым эфиром (2x5 мл). К водному раствору по каплям добавляли 1 М НС1 до рН 2-3. После водный раствор экстрагировали этилацетатом (3 5 мл), органические слои собирали и сушили HaflNa2S04. После отгонки органического растворителя получили продукт в виде твердого белого вещества. Выход 83-88%.

Дальнейшее удлинение пептидной цепи продолжали по схеме снятия защитной группы и последующего присоединения аминокислоты [428].

Спектральные данные для каждого соединения были соотнесены с литературными данными. Boc-Ala-OMe, Boc-Val-OMe [429], Boc-Leu-OMe [430], Вос-Пе-ОМе [431], Вос-А1а-Ala-OMe [432], Boc-Val-Val-OMe [433], Boc-Ala-Val-OMe [434], Boc-Val-Ala-OMe [435], Boc-Leu-Leu-OMe [436], Boc-Ile-Ile-ОМе [437], Boc-Ala-Ala-Ala-OMe [438], Boc-Ala-Ala-Val-OMe [438], Boc-Val-Ala-Ala-OMe [438], Boc-Val-Val-Val-OMe [439], Boc-Ala-Val-Val-OMe [434], Boc-Val-Val-Val-Val -OMe [440].

Пробоподготовка образца и постановка ЯМР-эксперимента

Образец аминокислоты или пептида (50 мг) помещали в 5-мм ЯМР-ампулу и добавляли ИЖ (0.65 г). Далее ампулу переносили в масляную баню, смесь перемешивали с помощью верхнеприводной мешалки непосредственно в ампуле при 80 С в течение 1 часа при 800 об/мин. Затем образец помещали в ЯМР-спектрометр, не допуская перепада температур во время перемещения. Спектры ЯМР регистрировали при 70 С без добавления дейтерированных растворителей.

В случае ди- и тетравалина в ампуле находилось значительное количество осадка, которое не позволяло получить "С ЯМР-спектры с хорошим разрешением и отношением сигнал/шум. Для этих образцов при съемке в [ЕМТМ][С1] использовали другую процедуру пробоподготовки. ИЖ нагревали до 80 С, после чего постепенно добавляли к ней пептид до появления осадка (насыщенный раствор). Съемку образца проводили при 70 С. Были получены С ЯМР-спектры хорошего качества, позволяющего провести количественное интегрирование и анализ.

Спектры регистрировали с использованием внешнего стандарта, представляющим собой капилляр со смесью дейтерированного и недейтерированного бензола (2:1) (химические сдвиги бензола: 7.15 ( Н) и 128.62 ( С) и небольшого количества Сг(асас)з (для увеличения скорости релаксации). Использование дейтерированного бензола позволяло стабилизировать магнитное поле, а недейтерированный бензол (представляет собой синглет в С ЯМР-спектре) использовался в качестве точки отсчета для отнесения химических сдвигов и в качестве стандарта для определения интегральных интенсивностей сигналов.

По сигналу метильной группы Вос-фрагмента образцов (аминокислоты или пептиды) определяли количество растворенного вещества (таблица 3.1). Для количественных измерений спектры регистрировали с использованием импульсной последовательности с обратной протонной развязкой, чтобы исключить влияние ЯЭО (ядерный эффект Оверхаузера)