Окисление монотерпеновых тиолов диоксидом хлора Гребёнкина Ольга Николаевна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Гребёнкина Ольга Николаевна. Окисление монотерпеновых тиолов диоксидом хлора: диссертация ... кандидата Химических наук: 02.00.03 / Гребёнкина Ольга Николаевна;[Место защиты: ФГБОУ ВО Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева], 2017.- 123 с.

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Литературный обзор 8

1.1 Диоксид хлора 8

1.1.1 Физические свойства 8

1.1.2 Способы получения 9

1.1.3 Применение диоксида хлора 10

1.1.4 Реакции диоксида хлора с органическими соединениями

1.1.4.1 Реакции с углеводородами 12

1.1.4.2 Реакции со спиртами 15

1.1.4.3 Реакции с аминами 21

1.1.4.4 Реакции с серосодержащими органическими соединениями 22

1.1.4.5 Реакции с азотсодержащими гетероциклическими тиолами и сульфидами 25

1.2 Синтез серосодержащих монотерпеноидов 28

1.2.1 Синтез терпеновых тиолов и сульфидов 28

1.2.2 Окисление терпеновых тиолов и сульфидов 34

1.2.3 Синтез терпеновых сульфиновых и сульфоновых кислот и их производных 36

Глава 2 Обсуждение результатов 39

2.1 Синтез исходных терпеновых тиолов 39

2.2 Реакции терпеновых тиолов с диоксидом хлора

2.2.1 Окисление неоментантиола 42

2.2.2 Реакции тиолов изоборнановой структуры с диоксидом хлора 45

2.2.3 Окисление тиолов карановой структуры 49

2.2.4 Окисление тиолов пинановой структуры

2.2.4.1 Реакции гидроксипинановых тиолов с ClO2 51

2.2.4.2 Окисление пинановых тиолов с двойной связью 54

2.3 Антибактериальная активность 56

Глава 3 Экспериментальная часть 58

3.1 Приборы и оборудование 58

3.2 Используемые реактивы и растворители 59

3.3 Определение концентрации диоксида хлора 59

3.4 Методики синтеза терпеновых тиолов

3.4.1 Методика синтеза неоментантиола и изоборнантиола 60

3.4.2 Методика синтеза 10-сульфанилизоборнеола 60

3.4.3 Методика синтеза (3R)-4-сульфанилкаран-3-ола, (3S)-4-сульфанилкаран-3-ола 61

3.4.4 Методика синтеза 4-карантиола 61

3.4.5 Методика синтеза 10-сульфанилизопинокамфеола 63

3.4.6 Методика синтеза 3-сульфанилмиртанола 63

3.4.7 Методика синтеза миртентиола 64

3.4.8 Методика синтеза транс-вербентиола

3.5 Методика окисления тиолов и дисульфидов диоксидом хлора 65

3.6 Методика определения антимикробной активности 66

3.7 Основные характеристики синтезированных соединений 68

Выводы 88

Литература

Физические свойства
Синтез терпеновых тиолов и сульфидов
Реакции тиолов изоборнановой структуры с диоксидом хлора
Методика синтеза 10-сульфанилизоборнеола

Введение к работе

Актуальность работы. Интерес к химии окислительных

трансформаций серосодержащих монотерпеноидов обусловлен широким
спектром биологической активности продуктов окисления. Известно, что
монотерпеноиды являются природными биологически активными

соединениями, обладающими антибактериальным, противогрибковым,
противовирусным, иммуномоделирующим, антигистаминным и

противоопухолевым действием. Химическая модификация этих соединений позволяет расширить спектр биологической активности и повысить эффективность биологического действия. Так, например, введение в структуру терпена сульфогруппы позволяет снизить токсичность и повысить растворимость соединения в воде, что является важным при получении лекарственных средств.

Одним из наиболее удобных способов синтеза S-, O-содержащих
производных монотерпеноидов является окисление терпеновых тиолов.
Среди большого числа окислителей особый интерес представляет
используемый для отбелки целлюлозы и очистки питьевой и сточных вод
диоксид хлора (ClO₂). Ранее сотрудниками Института химии Коми НЦ УрО
РАН были изучены реакции окисления алкан-, арил- и гетерилтиолов
диоксидом хлора, в которых этот реагент зарекомендовал себя как
эффективный окислитель. Информация по реакциям ClO₂ с

монотерпеновыми тиолами до сих пор в литературе отсутствовала.

Цель работы. Выявление направлений реакций окисления моно- и
полифункциональных монотерпеновых тиолов диоксидом хлора,

установление закономерностей этих реакций в зависимости от условий.

Основные задачи. Выделение и установление структур продуктов взаимодействия терпеновых тиолов с диоксидом хлора.

Научная новизна. Впервые проведено окисление терпеновых тиолов
борнановой, карановой и пинановой структур ClO₂, проведено окисление
неоментан- и изоборнантиолов при обратном порядке реагентов, получены и
охарактеризованы соответствующие терпеновые дисульфиды,

тиолсульфонаты, сульфохлориды, сульфокислоты, их эфиры и соли. Установлена зависимость направления реакций окисления от структуры субстрата, природы растворителя, продолжительности реакции и мольного соотношения субстрат – окислитель. Показана антимикробная активность тиолсульфонатов пинановой структуры.

Практическая значимость. Подобраны оптимальные условия получения S-, O-, N-содержащих производных монотерпеноидов. Разработан

способ получения терпеновых сульфокислот. Синтезированы новые S-, O-
содержащие монотерпеноиды, которые являются перспективными
биологически активными соединениями с антимикробной активностью.

Апробация работы. По теме диссертационной работы опубликовано 5 статей, 4 из которых в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, подано 2 заявки на патент. Основные материалы работы представлены на третьем междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической и биологической химии и фармацевтике (Севастополь, 2017), VII Международной конференции Российского химического общества имени Д.И. Менделеева (Москва, 2015) и 8 российских конференциях (Всероссийская научная конференция «Химия и фармакология растительных веществ», Сыктывкар, 2014; V Всероссийская молодежная научная конференция «Химия и технология новых веществ и материалов», Сыктывкар, 2015; IX Всероссийская научная конференция с международным участием «Химия и технология растительных веществ», Сыктывкар–Москва, 2015; Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Наукоемкие биомедицинские технологии: от фундаментальных исследований до внедрения», Пермь, 2016; Кластер конференций по органической химии «ОргХим-2016», С-Петербург, 2016; ХХ Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Екатеринбург, 2016; VII Всероссийская молодежная научная конференция «Химия и технология новых веществ и материалов», Сыктывкар, 2017; Х Всероссийская научная конференция и школа молодых ученых «Химия и технология растительных веществ», Казань, 2017). Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (проекты 16-33-00783, 13-03-01312, 16-03-01064, 16-43-110358), гранта программы «Умник» (договор № 5722ГУ/2015) и Уральского отделения Российской академии наук (проект 15-21-3-16).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка литературы (145 наименований) и приложений. Объем работы 123 страницы машинописного текста, включая список литературы, 1 рисунок и 7 таблиц.

Физические свойства

Кроме того, ClO2 обладает сильными дезинфицирующими свойствами, благодаря чему успешно применяется для очистки питьевой и сточных вод [20, 21]. Данный реагент окисляет фенольные соединения, отвечающие за запах и привкус воды, и растворимые формы железа и марганца с образованием осадка, который легко удаляется фильтрованием.

Антимикробное действие обусловлено разрушением клеточных мембран микроорганизмов за счет окисления белков и ферментов, входящих в их состав [22-24].

В работах [25-27] показано, что при различных концентрациях ClO2 ингибирует рост клеток бактерий Yersinia enterocolitica, Klebsiella pneumoniae, Clostridium perfringens, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Legionella pneumophila, Bacillus subtilis, причем ингибирующая активность зависит от pH среды [28, 29]. Помимо бактерицидных свойств ClO2 эффективен по отношению к вирусам и грибкам [30-32]. Авторами [30, 31] изучено инактивационное действие ClO2 на полиовирус, вызывающий детский спинномозговой паралич. Показано, что дезактивирующая способность ClO2 пропорциональна концентрации агента и pH среды. Так, в нейтральной среде при повышении концентрации ClO2 с 0.2 до 0.6 мг/л время инактивации вируса уменьшается с 30 до 2 минут.

Таким образом, ClO2 обладает широким спектром биологической активности против различных микроорганизмов, причем эффективность биологического действия во многих случаях выше, чем у хлора и хлорированной воды. Это позволяет применять ClO2 для обработки свежих фруктов и овощей [33, 34].

Первые работы по изучению реакций ClO2 с органическими соединениями опубликованы во второй половине XX века. В этот период СЮ2 начинает активно использоваться в водоочистке, поэтому ранние работы посвящены изучению взаимодействия окислителя с загрязнителями воды, например, с ароматическими соединениями, непредельными углеводородами и фенолами, которые отвечают за привкус и запах воды [17, 35, 37]. В более поздних работах изучены реакции данного реагента с алкенами [37], спиртами, в том числе терпеновыми [38-40], карбонильными [40] и сероорганическими [41] соединениями.

В реакциях органических соединений с СЮ2 окислитель, как правило, в первую очередь атакует легко окисляемые функциональные группы или подвижный атом водорода без разрыва углерод-углеродных связей субстрата. Окислительное действие обусловлено одноэлектронным механизмом переноса, при котором СЮ2 восстанавливается до хлорит-иона (СЮ2–) [42]: СЮ2 + е = СЮ2–. Большинство исследований проводилось в водных средах при малых концентрациях реагирующих веществ (10-6 - 10– моль/л).

Большинство насыщенных углеводородов и ароматических соединений, не имеющих подвижный атом водорода, не реагирует с водным раствором СЮ2 [43, 44]. Однако в работах [45, 46] описано получение адипиновой кислоты 1 окислением циклогексана 2 и хлорциклогексана СЮ2 при температуре 55 С избытком окислителя (схема 1.1).

Предположительно, образование адипиновой кислоты происходит в результате взаимодействия циклоалканов с продуктами пиролиза СЮ2.

Большое число работ посвящено изучению реакций окисления ненасыщенных углеводородов СЮ2. Окисление алкенов подробно описано в обзоре [47]. Независимо от условий проведения реакции при взаимодействии алкенов с СЮг образуется смесь продуктов окисления и хлорированных продуктов. Кроме того, в результате окисления сравнительно редко может происходить разрыв двойной связи. Так, авторами [48, 49] было проведено окисление циклогексена 3, в результате чего получена смесь продуктов: 2-циклогексенол 4, 2-хлорциклогексанол 5, 2-хлорциклогексанон 6, 3-хлорциклогексен 7, 1,2-дихлорциклогексан 8, адипиновая кислота 1 и эпоксид циклогексена 9 (схема 1.2).

Содержание продукта в реакционной смеси, % он1 ггОИ гг С11 гга г СООН о ґ\ кА kJk ґ\ L А L .СООН О xi Х1 О а 16 11 11 13 5 3 3 13 15 7 14 7 4 В ряде работ исследовано влияние природы растворителя на направление реакции алкенов с ClO2. В случае окисления ненасыщенных эфиров жирных кислот ClO2 присутствие воды в реакционной смеси не оказывает существенного влияния на состав и соотношение продуктов реакции [43, 50]. А при окислении транс-стильбена 10 наличие воды приводит к образованию в качестве основного продукта 2-хлор-1,2-дифенилэтанола 11 (44%), помимо которого наблюдается большой набор продуктов окисления и хлорирования, в то время как в безводной среде основным продуктом является а-хлор-бензилфенилкетон 12 (43%) (схема 1.3) [50].

Как упоминалось выше, арены, не имеющие подвижный атом водорода в ароматическом кольце, с ClO2 не реагируют. Так, в нейтральной среде бензол и его алкилзамещенные производные (толуол, этилбензол, дифенилметан), а также нафталин, флуорен, флуорантен и фенантрен инертны по отношению к разбавленному раствору ClO2 [51–53]. Однако антрацен, бенз(а)пирен и бенз(а)антрацен, а также некоторые сопряженные многоядерные ароматические углеводороды в водной среде быстро окисляются ClO2 даже при малых концентрациях окислителя (10–6 – 10–4 моль/л). В результате окисления в качестве основного продукта образуются хиноны (схема 1.4) [52, 53].

Протекание данных реакций не зависит от рН среды в диапазоне 4.5 рН 7.5 [54]. Авторами [17, 54, 55] предложен следующий механизм реакции: СЮ2 восстанавливается до хлорит-аниона, при этом образуются катион-радикалы аренов: А и -L. r-ir CF3COOH, сн2сі, + АгН + СЮ22 : 2 2 АгН +СЮ2 При температуре 50 С толуол 13 реагирует с избытком окислителя с образованием хиноидных и хлорированных продуктов (схема 1.5) [45]. 13 С1 С1 Схема 1.5 Фенантрен в водной среде с СЮ2 не взаимодействует, но при использовании в качестве растворителя четыреххлористого углерода образуются дифеновая кислота и ЮДО-дихлор-9-фенантрон [52].

Синтез терпеновых тиолов и сульфидов

К 1 г (6.5 ммоль) транс-вербенола при перемешивании добавляли 1.67 г (22 ммоль) AcSH в 20 мл CH2Cl2 и 0.2 г ZnCl2. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч. Затем смесь разбавляли 100 мл H2O, экстрагировали CH2Cl2. Органический экстракт сушили над MgSO4, отгоняли растворитель. Остаток (34 ммоль) добавляли в атмосфере аргона в суспензию LiAlH4 (2.7 г, 71 ммоль) в 150 мл сухого Et2O при 0 С. Доводили смесь до комнатной температуры, Полученную смесь перемешивали в течение 15 мин. За ходом реакции следили методом ТСХ. По окончании реакции в смесь добавили (осторожно!) 10 мл 10% раствора HCl. Далее экстрагировали Et2O, объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором NaCl, сушили над Na2SO4. Остаток делили методом колоночной хроматографии (силикагель, элюент – гексан) [123]. Выход транс-вербентиола 67%.

Масса навески тиола для окисления варьировалась от 0.05 до 0.10 г. Общий объем реакционной среды рассчитывали так, чтобы мольная концентрация растворенного в нем тиола была 0.02 моль/л. За ходом реакции следили методом ТСХ. Окисление проводили при разных порядках смешения реагентов (способы 1–3).

Способ 1. Растворяли навеску тиола в гексане, дихлорметане, хлороформе, пиридине, диметилформамиде или ацетонитриле, добавляли к нему водный или органический раствор ClO2 в мольном соотношении субстрат / окислитель, равном 1 : 0.5/1/2/3, перемешивали в течение 1-3 ч. Отгоняли растворитель под вакуумом. Остаток делили методом колоночной хроматографии.

Способ 2. Растворяли навеску тиола в гексане, дихлорметане, хлороформе, пиридине, диметилформамиде или ацетонитриле. Через раствор тиола при перемешивании барботировали ClO2 в течение 1-3 ч. Затем отгоняли растворитель при пониженном давлении. Остаток делили методом колоночной хроматографии.

Способ 3. Растворяли навеску тиола в органическом растворителе. Добавляли катализатор VO(acac)2 в количестве 10 мол.% и водный или органический раствор ClO2. Водную и органическую фазы разделяли. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток органической фазы делили методом колоночной хроматографии. 3.6 Методика определения антимикробной активности

Антимикробную активность определяли по ингибированию роста клеток бактерий и грибов при концентрации исследуемых соединений 32 мкг/мл. Исследование проводили в двух повторностях. Соединение считалось активным при ингибировании более 80%.

Подготовка образцов. Навеску исследуемого соединения растворяли в ДМСО (концентрация раствора составляла 10 мг/мл). Полученный раствор разбавляли до 320 мкг/мл 7%-м водным раствором ДМСО, наносили в микрокювету 384-луночного полипропиленнового планшета (StorPlate; PerkinElmer № 6008690). Во второй повторности 5 мкл наносили в микрокювету 384-луночного планшета (NBS; Corning № 3640). После добавления биологических сред концентрация соединения составляла около 32 мкг/мл, а концентрация ДМСО – 1%.

Антимикробные испытания. Бактерии выращивали на катион-скорректированной среде Мюллера Хинтона при 37 С. Затем образец каждой культуры разбавляли 40-кратно свежей средой и культивировали при 37 С в течение 1.5-2 ч. Далее 45 мкл культуры добавляли в микрокювету луночного планшета с испытуемыми веществами, при этом титр составлял 5105 КОЕ/мл (КОЕ/мл определялся по OD600). Все планшеты закрывались и инкубировались при 37 С в течение 18 ч без встряхивания.

Ингибирование бактериального роста определяли измерением оптической плотности при 600 нм (OD600). Процент ингибирования роста рассчитывали для каждой лунки, используя отрицательный контроль (только среда) и положительный контроль (бактерии без ингибитора). Значение величины ингибирования определяли через Z-множества, рассчитывали среднее и стандартное отклонение для лунок с образцами (без контроля) на каждом планшете. Образцы с величиной ингибирования более 80% и с Z-множеством порядка 2.5 в каждой повторности (n = 2 на разных планшетах) определялись как активные. Противогрибковая активность. Штаммы грибов культивировали в течение 3 дней при 30 С. Суспензию дрожжей с титром от 1106 до 5106 клеток/мл готовили из пяти колоний. Эти биомассы суспензий разбавляли средой Yeast Nitrogen Base (YNB) до конечной концентрации 2.5103 КОЕ/мл. Затем 45 мкл суспензии грибов добавляли в каждую микрокювету луночного планшета с исследуемым веществом. Планшеты закрывались и инкубировались при 35 С в течение 24 ч без встряхивания.

Величину ингибирования клеток C. Albicans определяли измерением оптической плотности при 530 нм (OD530), ингибирование роста клеток C. neoformans – измерением разности оптической плотности от 600 до 570 нм (OD600–570) после добавления резазурина (конечная концентрация 0.001%) и инкубирования при 35 C в течение еще 2 ч. Процент ингибирования роста вычисляли для каждой лунки с использованием отрицательного контроля (только испытуемые вещества) и положительного контроля (бактерии без ингибиторов) на каждой пластине. Значение величины ингибирования определялось через Z-множества, рассчитывалось среднее и стандартное отклонение для лунок с образцами (без контроля) на каждом планшете. Образцы с величиной ингибирования более 80% и с Z-множеством порядка 2.5 в каждой повторности (n = 2 на разных планшетах) определялись как активные.

Качественный контроль испытаний определялся по антимикробному контролю и Z-коэффициенту (используя положительный и отрицательный контроль). Планшет считался удовлетворительным по качественному критерию, если Z-коэффициент составлял 0.4 и антимикробные препараты сравнения показали полный спектр активности: полное ингибирование при самой высокой концентрации, и отсутствие ингибирования при самой низкой концентрации.

Реакции тиолов изоборнановой структуры с диоксидом хлора

На первой стадии в результате взаимодействия изо-Ви2А1Н с камфеном 71 образуется алюминийорганическое соединение 72. Реакция протекает в жестких условиях (t = 120 С). Дальнейшее взаимодействие алюминийорганического производного 72 с диоксидом серы приводит к образованию алюминиевой соли камфенсульфиновой кислоты. Сульфиновую кислоту 70 выделяют подкислением соли. Либо действием йодистого метила на алюминиевую соль камфенсульфиновой кислоты получают камфонилметилсульфон 73.

В работе [132] описано получение пара-мент-1-ен-7-сульфоната натрия 74. Данная соль получается в результате взаимодействия -пинена 52 с водным раствором сульфита натрия в присутствии нитрата калия (схема 1.42). Реакция проводится в условиях пониженного давления и нагревания.

Несмотря на осмоление и перегруппировку терпенового фрагмента при действии серной кислоты в работах [133, 134] описан способ получения сульфокамфорной кислоты 75 (схема 1.43).

Сульфокамфорную кислоту 75 получают действием концентрированной серной кислоты, либо смеси серной кислоты и олеума в присутствии уксусного ангидрида на камфору. Сульфокамфорная кислота обладает коронарорасширяющей способностью, антибактериальной активностью и болеутоляющими свойствами. Применяется для получения полусинтетических антибиотиков (цефалллоспоринов). Кроме того, восстановлением метилового эфира сульфокамфорной кислоты получают сультон 51 (схема 1.44), который используется для синтеза борнанового гидрокситиола 50 [116]. СН3С(ОСН3)3 NaBH4 H3CO2SH2C \ H3CO2SH2C Схема 1.44 Таким образом, терпеноиды являются биологически активными соединениями широкого спектра действия. Химическая модификация терпенов позволяет расширить спектр биологической активности соединений. Перспективным способом функционализации терпенов является синтез тиолов и их окисление. Обзор литературных данных по реакциям диоксида хлора с различными классами соединений показал, что данный реагент может выступать в роли эффективного окислителя. Данные о закономерностях реакций диоксида хлора с серосодержащими терпеноидами в литературе отсутствуют. Глава 2 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для изучения реакций монотерпеновых тиолов с диоксидом хлора были синтезированы тиолы различных структур: ментановой (1), борнановой (2, 3), карановой (4-6) и пинановой (7-10)1.

Синтез неоментантиола и изоборнантиола. Диастереомерно чистые неоментантиол 1 (выход 60%) и изоборнантиол 2 (75%) получены трехстадийным синтезом (схема 2.1), основанным на взаимодействии соответствующих терпеновых спиртов 11, 12 с рsCl c последующим кипячением образующихся тозилатов 13, 14 с тиомочевиной и дальнейшим щелочным гидролизом ИТУС 15, 16 [106]. H H2OTs 2. НС1 Схема 2.1 Синтез 10-сульфанилизоборнеола. 10-Сульфанилизоборнеол 3 (выход 67%) синтезирован восстановлением (1S d-10-камфорсульфонилхлорида 17 2 эквивалентами ІІАІН4 в сухом Et20 (схема 2.2) [115]. LiAlH4 OH Et20 Схема 2.2 Синтез гидрокситиолов карановой структуры. Гидрокситиолы карановой структуры 4 и 5 получены раскрытием соответствующих

Соединения в главах 2 и 3 имеют самостоятельную нумерацию эпоксидов 18, 19 AcSH в присутствии TMAF. Восстановлением тиоацетатной группы соединений 20 и 21 одним эквивалентом LiAlH4 в Et2O синтезированы соответствующие гидрокситиолы 4 и 5 с выходами 80 и 76% соответственно (схема 2.3) [121]. Схема 2.3 Синтез 4-карантиола. 4-Карантиол 6 получен четырехстадийным синтезом (схема 2.4) [135]. На первой стадии гидроборирование-окисление 3-карена 22 приводит к образованию транс-каранола 23, при взаимодействии которого с psCl образуется тозилат 24 (выход 64%). Действием тиоацетата калия на тозилат 24 выделен тиоацетат 25 (выход 58%), при восстановлении которого одним эквивалентом LiAltLi в Et20 получен 4-карантиол 6 с выходом 95%.

Синтез 10-сульфанилизопинокамфеола. Гидрокситиол 7 синтезирован бромированием -пинена 26 N-бромсукцинимидом с образованием миртенилбромида 27 (выход 59%), гидроборирование-окисление которого привело к образованию 10-бромоизопинокамфеола 28 (выход 69%). Замещением атома брома тиоацетатной группой по реакции соединения 28 с тиоацетатом калия получен 10-ацетилтиопинан-3-ол 29 с количественным выходом, при восстановлении которого эквимолярным Br Br SAc NBS, СС14ос As ВН,. Е О Г ОН AcSK, DMF S HLiAlH4, Et,Ofc l J ОН7Н202, 0 С IQ/І room temp L J -5 С 28 29 количеством LiAlH4 образовался гидрокситиол 7 с выходом на исходный

Методика синтеза 10-сульфанилизоборнеола

В качестве препарата сравнения для грам-отрицательных и грам положительных бактерий использовали антибиотики Colistin и Vancomycin соответственно, для грибов в качестве препарата сравнения использовался Fluconazole. Антибиотики использовались в четырех различных концентрациях (две выше и две ниже минимальной ингибирующей концентрации) и наносились в первые восемь лунок 23-го столбца 384-луночного планшета. Качественный контроль испытаний определялся по антимикробному контролю и Z-коэффициенту (используя положительный и отрицательный контроль). Планшет считался удовлетворительным по качественному критерию, если Z-коэффициент составлял 0.4 и антимикробные препараты сравнения показали полный спектр активности: полное ингибирование при самой высокой концентрации, и отсутствие ингибирования при самой низкой концентрации.