Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор
1. Общие сведения о структуре гликопротеинов 7
2. Методы синтеза p-N-гликозиламидов и гликозил-аспарагинов 16
Обсуждение результатов
1 Введение 45
2. Синтез гликозилизотиоцианатов 46
3. Взаимодействие гликозилизотиоцианатов с карбоновыми кислотами 53
4. Синтез 4-]М-гликозил-Ь-аспарагинов 62
5. Синтез аспарагин-связанного гликопептида 65
6. Синтез тиокарбамоилпептидов - возможное новое направление использования гликозилизотиоцианатов. 70
7. Заключение 73
Экспериментальная часть 75
Выводы 98
- Методы синтеза p-N-гликозиламидов и гликозил-аспарагинов
- Взаимодействие гликозилизотиоцианатов с карбоновыми кислотами
- Синтез аспарагин-связанного гликопептида
- Заключение
Введение к работе
Гликопротеины - гликозилированные белки - широко распространены в природе и выполняют целый ряд жизненно важных функций. К гликопротеинам относится большое число ферментов и гормонов. Гли-копротеинами являются групповые вещества крови; гликопротеины -обязательный компонент в клеточных мембранах.
В связи с большой значимостью гликопротеинов исследования их структуры, биосинтеза и биологической функции постоянно расширяются. Вполне естественно, что гликопротеины, представляющие собой конъюгаты белков с углеводами, одновременно являются носителями как углеводных, так и белковых свойств. В то же время наличие ко-валентной белок-углеводной связи определяет качественно новые свойства гликопротеинов, характерные только для этого класса биополимеров. Поэтому актуальной является задача синтеза соединений, воспроизводящих структуры фрагментов, включающие углевод-белковые связи в гликопротеинах. В настоящее время синтез таких гликопепти-дов важен по следующим причинам.
Во-первых, такие соединения необходимы для изучения свойств самой связи и в особенности для разработки новых эффективных методов структурного анализа гликопротеинов.
Во-вторых, они нужны для изучения специфичности и механизма действия ферментов, участвующих в биосинтезе и метаболизме гликопротеинов.
Несмотря на большое число известных синтезов модельных гли-копептидов, имеющиеся методы не всегда оказываются эффективными, особенно это относится к синтезу гликопептидов, моделирующих N-гликозиласпарагиновый тип углевод-белковой связи в гликопротеинах.
Настоящая работа посвящена разработке нового метода синтеза N-гликозиламидов, в том числе N-гликозиласпарагинов, основанного на взаимодействии гликозилизотиоцианатов с карбоновыми кислотами. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения собственных результатов и экспериментальной части.
В литературном обзоре мы сочли целесообразным дать общие сведения о структуре гликопротеинов, акцентируя главное внимание на структуре их углеводной части и узлах углевод-белковой связи. В обзоре рассмотрены существующие методы синтеза N-гликозиламидов и обсуждены их достоинства и недостатки. Рассмотрение этих литературных данных и привело нас к поиску нового метода синтеза N-гликозиламидов.
В обсуждении результатов, состоящем из семи параграфов, изложены полученные нами результаты: разработка нового способа получения гликозилизотиоцианатов, изучение взаимодействия гликозилизотиоцианатов с карбоновыми кислотами с целью поиска оптимальных условий синтеза гликозиламидов, синтез N-гликозиласпарагинов и гликопептидов, содержащих N-гликозилированные остатки аспарагина.
Поскольку мы располагали удобным и простым методом синтеза гликозилизотиоцианатов, то сочли целесообразным включить в работу описание нового возможного направления использования этих соединений. В результате взаимодействия гликозилизотиоцианатов со спей-сером, содержащим аминогруппу (аминокапроновая кислота), были получены лиганды для аффинной хроматографии ферментов. Использование этих лигандов другими авторами дало хорошие результаты.
Работа выполнена в лаборатории химии углеводов и гликопротеинов ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР - зав. лабораторией профессор А.Я.Хорлин.
Методы синтеза p-N-гликозиламидов и гликозил-аспарагинов
Как уже рассмотрено выше, N-гликозиламидная связь наряду с О-гликозидной, является распространенным главным типом связи в гликопротеинах. В настоящее время известны следующие основные методы синтеза N-гликозиламидов: а) хлорангидридный метод; б) ангидридный; в) метод смешанных ангидридов; г) карбодиимидный метод. Во всех случаях гликозиламиды получали ацилированием производных гликозиламинов N-защитеиными аминокислотами. Хлорангидридный метод [32] Ациламинокислота при обработке хлористым тионилом, треххло-ристым фосфором или пятихлористым фосфором в инертном растворителе превращается в соответствующий хлорангидрид. Взаимодействие последнего с соединением, имеющим аминогруппу, приводит к образованию соответствующего пептида (гликозиламида). Конденсации производятся или в водной среде, или в среде органического растворителя в присутствии подходящего основания для нейтрализации выделяющейся кислоты. Хлорангидридный метод является самым первым и старым из методов N-ацилирования, с помощью которого были синтезированы пептиды [17] и гликопептиды [18, 19]. Первые примеры N-ацилирования при С-1 [18-22] появились в 1957 году. Авторы [20] проводили аци-лирование рибозиламина хлорангидридом и хлорзамещенными хлорангид-ридами алифатических кислот в присутствии окиси магния. Соединение (4_1) было получено по методу [27] из соответствующего пер-0-бензоата [28], а соединение (4_3) - гидрогенолизом по методу [29] из соответствующего пер-0-бензоилированного глюкозилази-да (4_2) [30]. Взаимодействие хлоргидрата пер-0-бензоилглюкозилами-на с хлористым бензоилом в пиридиновой среде приводило к образованию соединения (45). Метод смешанных ангидридов По этому методу ациламинокислота или ацилированный пептид в инертном растворителе, содержащем один эквивалент основания, например триэтиламина, при действии хлорангидрида алифатической или ароматической кислот превращается в соответствующий смешанный ангидрид. Ангидрид, как правило, не выделяют в свободном состоянии, а сразу конденсируют с соединениями, имеющими аминогруппу, например гликозиламинами. В ходе реакции образуется соответствующий гликозиламид, хлоргидрат триэтиламина и карбоновая кислота, соответствующая исходному хлорангидриду [20, 31]. В реакции теоретически могут участвовать оба компонента смешанного ангидрида.
Применимость смешанных ангидридов в качестве промежуточных веществ для синтеза гликозиламидов или гликопепти-дов определяется, естественно, тем, в какой мере реакция конденсации идет в нужном направлении. Существенную роль при этом играют пространственные факторы, распределение зарядов по ацильным остаткам и полярность растворителя. Нуклеофильной атаке амином в первую очередь подвергается тот углеродный атом карбонильной группы смешанного ангидрида, который имеет наименьшую электронную плотность и при прочих равных условиях является стерически наименее экранированным. Та карбонильная группа ангидрида, реакционную способность которой необходимо подавить, должна обладать такими характеристиками, которые уменьшают ее чувствительность к нуклеофильной атаке. В работе [20] методом смешанных ангидридов синтезированы гликозил-амиды на основе рибозиламина с формилглицином и формилаланином типа (-52)-(54). Для получения промежуточного смешанного ангидрида был использован этилхлороформиат. Алкильная группа хлорангидрида алифатической кислоты в значительной степени обуславливает как пространственный, так и положительный индуктивный эффекты, поэтому смешанный ангидрид, содержащий остаток этой кислоты, теоретически должен приводить к такому соотношению продуктов ацилирования, в котором преобладает продукт ацилирования остатком ациламинокислоты. Выходы продуктов ацилирования остатками ациламинокислот соответствующих ри-бозиламинов составляют около 60%. Метод смешанных ангидридов применили для синтеза N-глюкозами-ниласпарагина [34], а также для синтеза (З-Ы-глюкозиламидов ряда L-аминокислот и никотиновой кислоты (55)-(60) [35, 36]. Этот метод удобен для получения амидов простых карбоновых кислот, например, N-ацетил и N-бензоилгликозиламидов [37-50, 53, 54]. Синтез I-N-ацетил и I-N-бензоилгликозиламидов ацилированием соответствующими ангидридами гликозиламинов рассмотрен в обзоре [23]. Японские авторы [51, 52] провели ацилирование (3-N-ацетилглю-козиламина ангидридами ряда алифатических и ароматических карбоновых кислот в пиридине. Получены p-N-гликоЗИЛамиды типа (65)-(75). Карбодиимидный метод построения амидной связи представляет собой разновидность метода смешанных ангидридов и является одним из самых распространенных методов в синтезе гликопептидов и глико-зиласпарагиновых соединений. Как видно на приведенной схеме, реакция включает промежуточное образование смешанного ангидрида (82_), который далее ацилирует аминогруппу гликозиламина. Получение пептида обычно проводят при комнатной температуре в органических растворителях, хотя в некоторых случаях в качестве растворителя с успехом можно использовать воду или смесь воды с органическими растворителями. В качестве N,N -дизамещенного карбо-диимида чаще применяется Г Ы -дициклогексилкарбодиимид (ДЦГК). Реакция сопровождается образованием N,N -дициклогексилмочевины. Поскольку это соединение практически нерастворимо в большинстве растворителей, оно может быть легко отделено от целевых продуктов реакции. Карбодиимидный метод синтеза N-гликозиламидов впервые описан Марксом и Нойбергером [55]. Было синтезировано соединение (85). Кочетковым и сотр. [64, 65] был разработан метод аминоацили-рования незащищенного глюкозиламина при действии карбобензокси-аминокислоты в присутствии карбодиимида в водном пиридине при 0-20 . Образование амидной связи проходило избирательно, гидроксиль-ные группы моносахаридного остатка в конденсацию не вступали.
При конденсации в этих условиях З-Б-гликозиламина с N-карбо-бензоксиглицином и N-карбобензокси-Ь-аланином с хорошими выходами получены N-карбобензоксиаминоацильные производные глюкозиламина (116), (117) Жанло с сотр. [66, 67] осуществили синтез гликозиласпараги-нов из гликозиламинов ряда олигосахаридов. На схеме 10 представлены гликопептиды ди-1 -ацетилхитобиозиласпарагина (118) - (120), синтезированные в этих работах. К настоящему времени в литературе накоплен обширный материал по синтезу N-гликозиламидов с использованием карбодиимидного метода. В основном авторами применялись стандартные прцедуры. Фактический материал по синтезу этих соединений суммирован в таблицах 1, 2 и 3. В таблице 1 представлены достаточно простые (по агликоновой части) гликозиламиды. По большей части - это модельные соединения, полученные с целью отработки гликозиламидного синтеза. В таблице 2 представлены гликозиласпарагиновые соединения, в том числе и производные, моделирующие или повторяющие строение гликопептидных фрагментов гликопротеинов. В таблице приведены условия и выходы на стадии конденсации, а также суммарные выходы после полного снятия защитных групп. Аналогичные данные, касающиеся аспарагинсодержащих гликопеп-тидов, представлены в таблице 3. Представленный в этих таблицах материал охватывает работы, опубликованные до 1983 года. Приведенный материал показывает, что карбодиимидный метод является главным и наиболее популярным в синтезе N-гликозиламидов. Однако он не лишен ряда недостатков. В первую очередь, бросаются в глаза невысокие выходы на стадии конденсации, по сравнению с выходами в пептидном синтезе. Обычно они составляют 40-60, но в некоторых случаях значительно ниже (см. табл. 1-3). Последнее обстоятельство связано с протеканием ряда побочных процессов, обусловленных превращениями самих гликозиламинов, в частности димеризации гликозиламинов [71], их гидролиза [26, 85-90], перегруппировки [25, 91-93]. Еще одна непростая проблема в синтезе гликозиламидов (особенно сложных гликопептидов) - это проблема постановки и снятия защитных групп. Как видно из таблиц 2 и 3, суммарные выходы на стадиях элиминирования защитных групп сравнительно невысокие. Это обусловлено использованием защитных групп и для углеводов, и для пептидов. В результате избирательность защит не всегда соблюдается и возникает опасность частичного снятия одних защитных групп при постановке других. Естественно, что это влияет на всю стратегию синтеза гликопептидов.
Взаимодействие гликозилизотиоцианатов с карбоновыми кислотами
В обычных реакциях органических изоцианатов и изотиоциана-тов [94, 97] присоединение происходит по двойной связи азот -углерод. Известна высокая реакционная способность органических изотиоцианатов. В реакциях с соединениями, содержащими активный водород, атом водорода присоединяется к азоту изотиоцианатной группы, а оставшийся радикал (А) - к углероду тиокарбонильной группы. Известны лишь немногочисленные примеры подобной реакции изотиоцианатов [94-96]. Эта реакция в синтезе пептидов используется для активации аминогруппы. Нами впервые с целью создания и разработки нового метода синтеза N-гликозиламидов изучено взаимодействие ацетилированных гликозилизотиоцианатов с карбоновыми кислотами. В первую очередь, мы проверили возможность некаталитической реакции гликозилизотио-цианата с карбоновой кислотой. Особенности электронного строения изотиоцианата позволяют предположить возможность ионных реакций с нуклеофильными агентами, атакующими тиокарбонильный углерод, и с электрофильными агентами, атакующими серу или азот. В отсутствии катализаторов реакция перацетил-З-Б-галактопи-ранозилизотиоцианата с уксусной кислотой, даже взятой с большим избытком и при 100 С, не проходила. Такой же результат был получен при проведении реакции в среде апротонного растворителя толуола. В обоих случаях изотиоцианат оставался неизменным. Таким образом, нами показано, что некаталитическая реакция пераце-тил-р-Б-гликозилизотиоцианата с карбоновой кислотой не идет. В дальнейшем мы изучали только каталитические реакции. В качестве катализатора нами выбран третичный амин (триэтиламин).Основный катализатор, по-видимому, может принимать участие в реакции по следующей схеме: Третичный амин, атакуя атом углерода, образует комплекс с гликозилизотиоцианатом, тем самым облегчая присоединение R"COOH. Дальнейшая реакция осложняется тем, что, кроме целевых амидов, могут образовываться и другие продукты, например, N,N -дизамещен-ные мочевины и -тиомочевины. RNCS + R COOH -RNCOR + (RNH)2C=0 + (RNH)2C=S R - гликозильный остаток; R - остаток карбоновой кислоты. С целью разработки оптимальных условий синтеза 1-аминоациль-ных производных углеводов нами поначалу был подробно изучен синтез простейших модельных гликозиламидов на примерах реакций 2,3, 4, б-тетра-О-ацетил р-О-галактопиранозилизотиоцианата (1_1) и его глюкоаналога (IV) с уксусной и бензойной кислотами, а также 2-аце-тамидо-2-дезокси-З,4,6-три-О-ацетил-3-D-глюкопиранозилизотиоциана-та (VIII) с уксусной кислотой.
Реакцию проводили в безводном толуоле при небольшом избытке органической кислоты при-20 (для СН-СООН) или при 100-110 (для С,Н,.С00Н) в присутствии эквивалента триэтиламина. В этих условиях из изотиоцианата (II) и уксусной кислоты с выходом 34 получен 2,3,4,б-тетра-0-ацетил-М-ацетил-3-Б-галакто-пиранозиламин (XI) [108, 109], а из изотиоцианата (IV) - 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-М-ацетил-З-Б-глюкопиранозиламин (XV) [108, 109] с выходом 29. Наряду с гликозиламидами в реакциях с СН СООН образуются N,N -бис(2,3,4,6-тетра-0-ацетил-3=D-галактопиранозил)мочевина (XII) [108, 109] и -тиомочевина (XIII) - из (IT) и N,N -бис(2,3,4,6-тетра-0-ацетил-3-D-глюкопиранозил)мочевина (XVI) [108, 109] и -тиомочевина (XVII) [108, 109] из (IV) (схема 13). Количества образующихся мочевин (XII, XVI) сопоставимы с количествами амидов; производные тиомочевины (XIII, XVII) образуются с выходами 10-13. Конденсацией (I_I) и (IV) с бензойной кислотой получены с выходами 30 2,3,4,б-тетра-О-ацетил-Ы-бензоил-З-Б-галактопиранозил-амин (XIX) и 2 ,3,4 ,б-тетра-О-ацетил-М-бензоил-р-Б-глюкопиранозил-амин (XX) . Дезацетилированием перацетил-З -В-гликозиламидов ()С1 и XV) по Земплену получен соответствующий N-ацетил-іЬ-В-галактопира-но зиламин (XIX) и его глюкоаналог (XVIII) [109], а из (XX) получен соответствующий N-бензоил-З-В-глюкопиранозиламин (XXI) [109]. С уксусной кислотой изотиоцианат (VIII) в толуоле при комнатной температуре в присутствии I эквивалента триэтиламина реагирует , давая 2-ацетамидо-I-N-ацетил-3,4,6-три-0-ацетил-2-дезок-си-р-В-глюкопиранозиламин (XXII) [110] с выходом 70. Большинство синтезированных соединений описано в литературе. Структура их, кроме того, подтверждена спектральными данными. В ИК-спектре соединения (Х_1) присутствуют полосы поглощения, отвечающие группам NH (3300), сложноэфирной (1750) и амидной (1670, 1550). В спектре ПМР соединения (XI) присутствует дублет 8,70 м.д. (J, 2 = 9 Гц, NH) и пять синглетов 1,84; 1,92; 1,98; 2,00 и 2,12 м.д. (ЗН каждый, четыре О-ацетильные и одна N-ацетильная группы); дублет ано-мерного протона (5,31 м.д., J, = i wu = 9 Гц) соответствует 3-гликозидной связи. ИК- и ПМР-спектры соединений (XV, XIX, XX, XXII) также подтверждают их структуру (см. Экспериментальную часть). Образование амидов из изотиоцианатов и карбоновых кислот представляют обычно через промежуточный смешанный ангидрид, подвергающийся далее элиминированию COS [94]. Очевидно, подобные смешанные ангидриды (3) образуются первоначально из гликозилизо-тиоцианатов Д_ при их взаимодействии с карбоновыми кислотами, как это представлено на схеме 14. Образование дизамещенных мочевин в реакциях изотиоцианатов объясняют обычно присутствием влаги в реакционной среде [97].При этом из изотиоцианатов могут образовываться не только тиомочеви-ны 8, но и мочевины , если производное тиокарбаминовои кислоты типа А достаточно устойчиво.
Однако существенные количества производных мочевин, образующиеся в большинстве реакций гликозилизо-тиоцианатов с кислотами, не могут быть отнесены за счет возможного присутствия влаги в реагентах и растворителях. Причину образования мочевин 8 и 9 следует искать в дальнейших превращениях смешанного ангидрида _3. Последний, реагируя с избытком карбоновой кислоты, может превращаться в производное тиокарбаминовой кислоты _4, которое с исходным изотиоцианатом J_ дает ангидрид ]_. Этот ангидрид, элиминируя COS или CS?, может превращаться соответственно в производное тиомочевины 8 или мочевины 9_. Целевой продукт реакций - гликозиламид 5_ может образовываться при действии ангидрида карбоновой кислоты на соединение либо на образующийся из 4_ гликозиламин 6 Перечисленные превращения, по-видимому, не исчерпывают всех возможных путей взаимодействия гликозилизотиоцианатов с карбоно-выми кислотами в присутствии триэтиламина, поскольку нельзя исключить, что некоторые продукты этих превращений (гликозиламин, производные мочевины) могут сами катализировать отдельные стадии процесса. На примере реакций изотиоцианата (1_1) с уксусной кислотой был предпринят поиск оптимальных условий, позволяющих свести к минимуму выход побочных продуктов - производных мочевины и тиомочевины. В качестве переменных факторов использовались молярные отношения катализатор:изотиоцианат и кислота:изотиоцианат. Полученные результаты суммированы в таблице 4. Из приведенных в таблице 4 данных видно, что увеличение количества уксусной кислоты от 1,4 до 3 и более молей на 1 моль изотиоцианата {II) при примерно равных количествах (1_1) и катализатора приводит к повышению выхода амида (XI). Роль избытка кислоты сводится, по-видимому, к более полному превращению изо-тиоцианатов в смешанный ангидрид _3 и далее - в производное тио-карбаминовой кислоты 4_. Последнее может давать производные мочевины и тиомочевины лишь при наличии в системе исходного изотиоцианата. Необходимо подчеркнуть, как это было показано нами ранее [109], что прямого образования амида _5 из смешанного ангидрида Ъ путем элиминирования COS не происходит, так как при взаимодействии изотиоцианата (II) с бензойной кислотой в присутствии эквивалента уксусного ангидрида основным продуктом реакций был амид (XI), а соответствующий бензамид не был обнаружен. В реакции (1_1) с уксусной кислотой с добавкой эквивалента уксусного ангидрида выход (XI) увеличивается до 601, а выход мочевины (XII) изменяется лишь незначительно. В случае амида (XXII) высокий выход (70) по сравнению с выходами амидов на основе изотиоциана-тов нейтральных Сахаров, можно объяснить низкой растворимостью изотиоцианата аминосахара (VIII) в толуоле, что обеспечивало в растворе большой избыток кислоты по отношению к (VIII), способствующий протеканию реакции в желаемом направлении.
Синтез аспарагин-связанного гликопептида
Несмотря на нежелательность применения полярных апротонных растворителей [97], мы были вынуждены использовать их в N-гликозил-амидном синтезе гликопептидов, и это обусловлено тем, что глико-зилизотиоцианаты аминосахаров, моно- и олигопроизводные, малорастворимы в толуоле, а большинство защищенных аминокислот и пептидов практически нерастворимы в нем. Прежде чем перейти к синтезу аспарагин-связанного гликопеп-тида, нам надо было проверить применимость (пригодность) других апротонных растворителей для синтеза N-гликозиламидов, а также как влияет полярность апротонного растворителя на выход N-гликозиламидов. В качестве примера было выбрано взаимодействие 2-ацет-амидо-3,4,б-три-О-ацетил-З-Б-глюкопиранозилизотиоцианата (VIII) с N-защищенной аминомасляной кислотой (XXXII), катализируемое 0,1 эквивалента триэтиламина в среде хлористого метилена. Реакция продолжалась 3 суток при 20 до полного исчезновения исходного гликозилизотиоцианата (VIII). Кристаллизацией реакционной смеси с выходом 64 получен N-гликозиламид (XXXIII) (схема 16). Состав и строение соединения (XXXIII) подтверждались, помимо элементного анализа, спектральными данными (УФ, ИК и ПМР-спект-ры, см. Экспериментальную часть). Указанный опыт дал основание считать хлористый метилен растворителем вполне приемлемым для проведения реакции конденсации гликозилизотиоцианатов с карбоновыми кислотами. Дальнейшие эксперименты подтвердили это. Синтезу аспарагин-связанного гликопептида (XXXIX) предшествовало повторение синтеза соединения (XXVI) (см. стр. 63) в оптимальных условиях, аналогичных описанным ранее. Отличие состояло лишь в том, что неполярный апротонный растворитель (толуол) был заменен полярным апротонным растворителем - ацетонитрилом. В результате был получен 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-Ы-(І-бензил-И-бензил-оксикарбонил-Ь-аспарт-4-ил)-p-D-глюкопиранозиламин (XXVI), идентичный полученному ранее (см. Экспериментальную часть), с выходом 87,5. Таким образом, выход соединения (XXVI) при проведении реакции в полярном растворителе оказался столь же высоким, как и при использовании неполярного толуола. Результаты N-гликозиламидного синтеза и высокие выходы целевых N-гликозиламидов и N-гликозиласпарагинов при проведении синтеза как в среде неполярных апротонных растворителей, так и в среде полярных апротонных растврителеи позволяет сделать вывод о том, что существенным в N-гликозиламидном синтезе является использование апротонного растворителя, а полярность последнего на выход N-гликозиламида в оптимальных условиях проведения данной реакции влияет незначительно. Соблюдение найденного нами оптимального условия проведения N-гликозиламидного синтеза расширило круг используемых апротонных растворителей.
Развитием наших работ по синтезу N-гликозиламидов [108-110] и 4 -гликозил-Ь-аспарагинов [110, 111] был синтез гликопептида, содержащего 4- гликозил-Ь-аспарагиновый остаток. Полная общая схема образования аспарагин-связанных гликопептидов аналогична общей схеме образования N-гликозиламидов и N-гликозиласпарагино-вых производных (см. схему 14). Конденсацией синтезированного нами пептида - этилового эфира N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-L-a-acпapтилглицилглицинa (XXXVIII) (см. схему 17) с 2-ацетамидо-3,4,6-три-0-ацетил-2-дезокси-(Ь-Б-глюкопиранозилизотиоцианатом (VIII) в среде ацетонитрила получен гликопептид (XXXIX) [114] с выходом 65 (схема 18). Соединения (XXXIV), (XXXV), (XXXVI), (XXXVII) и (XXXVIII) были получены нами известными в химии пептидов методами [32, 115], укажем только, что защищенный трипептид со свободной карбоксильной N-концевой L-аспарагиновой кислотой (XXXVIII) получен нами впервые. Выход трипептида (XXXVIII) рассчитанный из исходного В результате параллельных опытов по кислотному гидролизу соединения (XXXVIII) 6 N соляной (100, 24 часа) и 2,5 N трифторук-сусной (1,00 , 7 часов) кислотами установлено, что образуются L-аспарагиновая кислота и глицин, идентифицированные ТСХ и бумажной хроматографией. Аминокислотный анализ продуктов гидролиза дал наличие аспа-рагиновой кислоты и глицина, соотношение 1:2. Синтез гликопептида (XXXIX) проводился в оптимальных условиях N-гликозиламидного синтеза, в среде абс. ацетонитрила, в присутствии 0,1 экв. абс. триэтиламина. Реакция велась при комнатной температуре, продолжалась 3 суток (контроль ТСХ).
После колоночной хроматографии реакционной массы с выходом 65 выделен целевой гликопептид (XXXIX) Для гликопептида (XXXIX), помимо элементного анализа, проведены параллельные опыты жесткого кислотного гидролиза 6N соляной (100 , 24 часа) и 2,5 N трифторуксусной (100 , 7 часов) кислотами. В результате образуются L-аспарагиновая кислота, глицин и глюкоз-амин, идентифицированные ТСХ и бумажной хроматографией. Аминокислотный анализ продуктов гидролиза защищенного гликопептида (XXXIX) показал наличие аспарагиновой кислоты, глицина и глюкозамина в соотношении, близком к 1:2:1. Таким образом, нами осуществлен синтез защищенного аспарагин-связанного гликопептида, который служит подтверждением универсальности разработанного метода, который таким образом дал хорошие результаты в синтезе N-гликозиламидов, N-тликозиласпарагинов и гли-копептидов, содержащих N-гликозилированный остаток аспарагина. 6. СИНТЕЗ ТИОКАРБАМОИЛПЕПТИДОВ - ВОЗМОЖНОЕ НОВОЕ НАПРАВЛЕНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЛИК03ИЛИ30ТИ0ЦИАНАТ0В Известно, что изоцианаты и изотиоцианаты с соединениями, содержащими свободную аминогруппу, реагируют быстрее, чем с карбоно-выми кислотами [94, 97], образуя соответственно производные мочевин и тиомочевин По аналогии [94, 97] один из возможных путей образования бисгликозилтиомочевин мы приписываем взаимодействию исходного гликозилизотиоцианата с образующим из гликозилтиокарба-миновой кислоты гликозиламином (см. схему 14 стр. 58). Для подобного рода реакций нами предложены незащищенные аминокислоты. Главным продуктом реакции при этом был N-гликозилтио-карбамоилпептид (схема 19). Нуклеофильный реагент - аминокислота (XL) со свободной первичной аминогруппой - в этой реакции одновременно служит и реагентом и катализатором. Нельзя в данном случае пренебречь и ролью растворителя (пиридина) - основания, блокирующего карбоксильную группу аминокислоты. Синтез тиокарбамоилпептида (XLI) проводился с двоякой целью: расширить сферу применения, во-первых, гликозил-изотиоцианатов, во-вторых, использовать тиокарбамоилпептиды как аффинные сорбенты, в частности, для выделения p-D-галактозидазы. Полученное нами гликозилтиокарбамоильное производное (XLII) было передано в Институт биохимии им. Баха АН СССР с целью его использования в качестве аффинного сорбента. Соединение (XLII), пришитое к сефарозе, оказалось прекрасным аффинным сорбентом для p-D-галактозидазы [116, 117]. Мы ограничились синтезом только этого одного гликозилтиокар-бамоилпроизводного (XLI) и испытанием его в дезацетилированном виде (XLII) как аффинного сорбента. Этим мы показали возможности еще одного нового направления гликозилизотиоцианатного пути и его прикладной характер.
Заключение
Подводя итоги проделанной работы, следует отметить, что предложенный нами метод синтеза (З-И-гликозиламидов обладает преимуществами по сравнению с известными методами. Они заключаются в большей простоте метода, а также в его большей эффективности. Последнее видно из сравнения выходов целевых соединений, полученных как по нашему методу так и известными ранее способами. Можно надеяться, что метод, предложенный нами, найдет применение в синтезе сложных гликопептидов. Возможность синтеза таких пептидов с использованием данного метода была проверена в нашей работе. Необходимо, однако, отметить, что это не единственный путь получения такого рода гликопептидов с использованием возможностей предложенного нами метода. Альтернативный путь заключается в применении гликозилированного защищенного аспарагина, который далее является исходным соединением в пептидном синтезе, т.е. в наращивании аминокислотных остатков на гликозиласпарагин. На наш взгляд, синтез гликозиламидов, предлагаемый нами, является более простым в значительной степени потому, что был найден удобный способ получения гликозилизотиоцианатов. Последнее позволило развить в данной работе "блок-синтез" сложных (т.е. состоящих из олигосахаридов и олигопептидов) гликопептидов, который имеет несомненные преимущества перед методом постепенного наращивания. "Блок-синтез" сложных гликопептидов осуществлен нами впервые. Достаточно широкий круг синтезированных соединений позволяет говорить об общности развитого подхода, а проведенная оптимизация синтеза - о его закоченности. Что же касается дальнейших перспектив данной работы, то они, по-видимому, будут связаны с применением синтезированных соединений в структурном анализе N-цепей гликопротеинов. Ввиду доступности гликозилизотиоцианатов мы хотели расширить круг их использования. Нам удалось показать, что эти соединения являются удобными исходными веществами в получении лиган-дов для аффинных сорбентов. Таким образом, на основании полученных результатов можно предполагать, что ставшие доступными гликозилизотиоцианаты найдут широкое применение в химии углеводов. I. Общие методы. Температуры плавления определены на приборе Boetius. Оптические вращения измерены на поляриметре Perkin-Elmer 141М при 20-25. Спектры ЯМР сняты на спектрометре Varian XL-100; химсдвиги даны в миллионных долях в шкале б. ИК-спектры сняты на приборе UR-20 в таблетках КВг или в вазелиновом масле. УФ-спектры записаны на спектрофотометре Cary-15, , а масс-спектры - на приборе Varian МАТ-СН-5 при температуре испарения 200 и энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Газо-жидкостную хроматографию (ГЖХ) осуществляли на хроматографе Hewlett-Packard 5710А с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке (50 м х 0,24 мм) с фазой SE-30 при 140-220 (2 /мин), газ-носитель Не (1,2 атм.). Аналитическая инообменная хроматография осуществлена на углеводном анализаторе Biotronic.
Для определения моносахаридного состава производные олиго-сахаридов подвергали метанолизу и анализировали в виде ТМС-произ-водных. Метанолиз проводили 0,75 N раствором хлористого водорода в метаноле при 80 в течение 24 часов [118]. Кислотный гидролиз проводили 6 N соляной кислотой при 100 в течение 24 часов или 2,5 N трифторуксусной кислотой при 100 в течение 7 часов. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на силуфоле UV-254 (Chemapol, ЧССР). Пятна производных Сахаров обнаруживали в УФ-свете и нагреванием при 200-250 . Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 100-160 мкм или 40-100 мкм (Chemapol, ЧССР). Бумажную хроматографию (БХ) проводили на бумаге Filtrak-FN-1 или FN-3 в системе растворителей: изоамиловый спирт-пиридин-вода 5:5:4 и бутанол-этанол-вода 4:1:1. Сканирование тонкослойных хроматограмм производили узкой щелью на спектрофотометре PMQ-2 Opton при длине волны 483 нм. Упаривание растворителей осуществляли в вакууме при температуре бани 30-40 . Аминокислотный анализ трипептида (XXXVIII) осуществляли на приборе Durrum D-500, а гликопептида (XXXIX) на приборе Liquimat-I Labotron. 2-Ацетамидо-5,4 ,6-три-0-ацетил-2-дезокси-[3-Р-глюкопиранозил-изотиоцианат (VIII). Смесь 5,48 г (15 ммоля) 2-ацетамидо-2-дезокси-3,4,6-три-0-ацетил-а-Б-глюкопиранозилхлорида (VII), [119] и 2,5 г (33 ммоля) безводного роданида аммония кипятят 15 мин в 15 мл сухого ацетона. Растворитель отгоняют, остаток растворяют в хлороформе и промывают водой. Высушенный СаС1« хлороформный слой упаривают досуха, остаток кристаллизуют из смеси хлороформ-эфир. Получено 2,90 г (50) изотиоцианата (VIII), т. пл. 156-161, [а]р +9 (С I, хлороформ) . Лит. [103], т. пл. 161 , [о.]у. +10 (хлороформ). 2-Ацетамидо-5,4,6-три-0-ацетил-2-дезокси-&-Р-глюкопиранозил-изотиоцианат (VIII). Аналогично примеру (VIII) из 24,5 г того же хлорида и 10 г роданида аммония в сухом ацетонитриле последующей хроматографией на колонке с силикагелем (100-160 мкм), элюируя смесью эфир-ацетон (15:1), получают 14,2 г (56) продукта, хроматографичес-ки чистого по данным ТСХ на силикагеле в системе эфир-ацетон (10:1). После перекристаллизации из смеси хлороформ-эфир т. пл. 159-161С.
Похожие диссертации на Новый метод синтеза В-N-гликозиламидов синтез фрагментов гликопротеинов
![Синтез некоторых пиперидилпроизводных изохинолинов, [1,6]нафтиридинов и их N-замещенных в пиперидиновом фрагменте](/i/i/4448/391012.png "Синтез некоторых пиперидилпроизводных изохинолинов, [1,6]нафтиридинов и их N-замещенных в пиперидиновом фрагменте Ковальский Дмитрий Анатольевич")
![Синтез замещенных по нижнему ободу n-трет-бутилтиакаликс[4]аренов, содержащих фотопереключаемые аза- и азометиновые фрагменты](/i/i/4253/466090.png "Синтез замещенных по нижнему ободу n-трет-бутилтиакаликс[4]аренов, содержащих фотопереключаемые аза- и азометиновые фрагменты Зайков, Евгений Николаевич")