Введение к работе
Уктуальность проблемы. Бимолекулярная липидная пленка - липидный жслой, япляется основной структурой клеточной мембраны. Бислой формируется в водном окружении из амфипатических липидных молекул, гид-юфильные полярные головы которых обращены наружу, в воду, а гидро-робные углеводородные "хвосты" - внутрь бислоя. Такая структура определяет два основных свойства клеточных мембран. Они замкнуты: 'мембраны ненавидят края", и плохо проницаемы для большинства водорастворимых молекул. Эти свойства лежат в основе барьерной функции шеточных мембран: мембраны отделяют содержимое внутриклеточных ор-:анелл от цитоплазмы, цитоплазму - от внеклеточной среды; практически тюбая биологическая мембрана формирует какой-либо замкнутый компар-гмент. Тем не менее нормальное функционирование клетки невозможно без многочисленных актов объединения или слияния таких исходно разделенных мембранных образований.
Под слиянием в строгом смысле понимается объединение водных объемов, ограниченных мембранами, и перераспределение липидного и белкового материала между взаимодействующими мембранами. Слияние происходит при каждом акте экзоцитоза или секреции, лежит в основе внутриклеточного транспорта, формирования и рециркуляции плазматической мембраны. Слияние клеток наблюдается в эмбриогенезе, например, при образовании миофибрилл (слияние миобластов), в процессе оплодотворения (слияние сперматозоида с яйцеклеткой). Оболочечные вирусы проникают в клетку путем слияния вирусной и клеточной (либо эндосомальной) мембран.
Клеточные мембраны не сливаются спонтанно. Слияние контролируется специальными белками слияния, как правило, целыми белковыми комплексами. В последнее время достигнут большой прогресс в определении и изучении белковых комплексов, опосредующих слияние в самых различных системах (секреция, вирусное слияние, оплодотворение). Обнаруженная высокая специфичность и регулируемость работы белковых "машин слияния" позволяет исследователям предполагать, что именно белок полностью определяет энергетику слияния на всех стадиях процесса [Lindau М. & Aimers W., 1995, Cur. Op. Cell Biol].
Тем не менее в основе любого акта слияния лежит локальное нарушение целостности липидных бислоев взаимодействующих мембран с последующим соединением их уже новым образом. Именно на этой стадии структурной перестройки бислоев липидный матрикс мембраны может играть решающую роль. Каким образом белок слияния индуцирует реструктуризацию бислоев, какова роль липидов в этом процессе? Какие небис-лойные, промежуточные структуры формируют при этом липиды? Белок или липид определяет энергетику этих промежуточных структур? Несмотря на большое количество информации о работе белковой машины слияния,
детали структурной реорганизации липидных бислоев клеточных мембран при слиянии неизвестны.
Таким образом, изучение промежуточных липидных структур в слиянии клеточных мембран важно и необходимо для понимания механизма слияния в целом.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение механизмов, лежащих в основе структурной перестройки липидных бислоев клеточных мембран в процессе слияния. При постановке задач была выбрана следующая рабочая гипотеза. Роль белка слияния сводится к локальному сближению липидных бислоев клеточных мембран до расстояния, на котором происходит спонтанное слияние двух плоских бислойных липидных мембран (БЛМ). Промежуточные структуры, принимаемые липидами клеточных мембран, аналогичны промежуточным структурам, наблюдаемым при слиянии двух БЛМ, их энергетика описывается в рамках сталко-вой (stalk) теории, развитой в лаборатории Ю.А. Чизмаджева для слияния БЛМ (1984-87 гг.). Для доказательства рабочей гипотезы предполагалось показать, что:
-
клеточное слияние можно регулировать так же, как и слияние БЛМ, добавляя на разных стадиях слияния экзогенные липиды в различные монослои мембран;
-
экзогенные липиды различной молекулярной геометрии влияют на кинетику слияния в соответствии с предсказаниями сталковой теории;
-
слияние липидных бислоев клеточных мембран проходит через те же промежуточные стадии, что и слияние двух БЛМ.
Для осуществления поставленных задач было необходимо:
-
разработать экспериментальные методики, позволяющие фиксировать различные стадии одиночного акта слияния клеточных мембран;
-
провести теоретические оценки кинетики диффузионного перераспределения липидов через промежуточные структуры слияния для выяснения временных ограничений экспериментальных методов, используемых для детектирования слияния моно- и бислоев.
Научная новизна и практическая значимость работы: в работе был использован новый экспериментальный подход, заключающийся в качественном сравнении двух процессов: слияния клеточных мембран и слияния двух плоских БЛМ. Несмотря на огромную разницу между двумя экспериментальными системами (наличие белка слияния, отсутствие контроля как ли-пидного состава так и геометрии области контакта в случае клеточного слияния), представленный материал демонстрирует качественное сходство процессов перестройки бислоев мембран при слияния в обеих системах. Тем не менее, в работе впервые экспериментально показано, что ни белок слияния, ни липиды не определяют полностью энергетику реструктуризации мембран. На примере слияния клеточных мембран, индуцированного белком слияния вируса гриппа гемагглютинином (ГА), предложен новый вариант "синтетической" модели слияния, учитывающий роль как липидного матрикса мембран, так и белка слияния ГА. Однако необходимо отметить,
что полученные результаты по липидной регуляции слияния клеточных мембран являются универсальными в том смысле, что они могут быть использованы в исследованиях и при интерпретации данных по слиянию, индуцированному различными белковыми комплексами. Результаты представляют практігческую ценность для прикладных медицинских исследований, снизанных со слиянием клеточных мембран, а именно для изучения механизмов инфекций, вызываемых оболочечными вирусами, нарушений секреции, процесса оплодотворения.
Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были доложены на Международной Конференции по Межклеточным Взаимодействиям (1994 г., Пущино), Фрумкинских конференциях молодых ученых в Институте Электрохимии им. Л.Н.Фрумкина РАН (Москва, 15 июня 1995 г. и 18 июня 1997 г.) на 40-м (26 февраля - 3 марта 1996 г., Baltimor, USA) и 41-м (2-7 марта 1997 г., New-Orleans, USA) конгрессах Американского Биофизического общества и на XXXIII Международном Конгрессе Физиологических Наук (30 июня - 5 толя 1997, Ст.-Петербург).
По материалам диссертации опубгагковано 5 печатных работ и 7 тезисов докладов на конференциях.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 82 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц и 21 рисунок.