Введение к работе
Актуальность исследования. Исследование протеолитических Фер-
ментов в растении представляет интерес в связи необходимость» выяснения закономерностей процессов нетаболизма белка. Прорастание семян характеризуется быстрой мобилизЗпией запасных веществ, в частности запасных белков. Участие протеолитических Ферментов в этом сложном, многоступенчатом процессе очевидно. Вопросы, связанные с изучением протеолиза запасных белков, представляют значительный интерес, т. к. эти белки служат источником азотистых соединений для растений на начальных этапах прорастания.
Однако, несмотря на большое число работ, посвященных изучению распада запасных белков семян растений при прорастании, до сих пор остается неясным, какие протеолитические ферменты и в какой последовательности участвуют в этом процессе, и каковы механизмы его регуляции. Нет единого мнения и о том, какая протеиназа инициирует протебяиз: присутствующая в покоящихся семенах или синтезируеная de novo в процессе прорастания.
Проблема иммунитета растений к болезням также принадлежит к числу наиболее интересных и сложных биохимических проблем. Известно, что растения способны противопоставить возбудителям болезней целую систему зашиты, названную Вавиловым "суммой из множества слагаемых". Все копмоненты этой суммы переплетены и взаимно дополняют друг друга. Это и высокоспениФичрские ингибиторы протеиназ, и антибиотические вещества типа Фитоалексинов, и лектини, участвующие в процессах распознавания растением патогена, и многие другие.
Поскольку ингибиторы протеиназ являются одним из важных компонентов естественной защитной системы растений от вредных насекомых и патогенов, то в настоящее время начаты работы по переносу генов ингибиторов протеиназ для.получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к грибам и вредителям.
Цель и задачи исследования, основной целью настоящей работы
явилось выделение и изучение сериновой протеиназы А покоящихся семян хлопчатника и ее роль в протеолизе глапкого запасного белка семян хлопчатника - lis глобулина при прорастании, а также исследование собственного ингибитора протеиназы А. В соответствии с этим были поставлены и решались следующие экспериментальные задачи:
- выделение и очистка сериновой. протеиназы иэ покоящихся семян хлопчатника;
-изучение Физико-химических свойств, субстратной специфичности выделенной протеиназы А;
- выделение и характеристика высокоочишенного препарата ингибитора протеиназы А. изучение его свойств, изменение активности при прорастании и влияние на протеолитические Ферменты фитопатоге-на - Vertlcilllum dahliae.
Научная новизна и практическая значимость работы, научная новизна определяется следующим: впервые из сенян хлопчатника получен гомогенный Фермент - сериновая протеиназа А, изучены его физико -хинические свойства, субстратная специфичность и сделано заключение о возможной Физиологической роли Фермента. Установлено, что протеиназа А осуществляет ограниченный протеолиэ главного запасного белка семян хлопчатника - lis глобулина на первой стадии его деградации при прорастании семян.
Из покоящихся сенян хлопчатника получен новый гомогенный белок - ингибитор собственной протеиназы А. изучены его свойства, изменения активности при прорастании, высказано предположение о возможной Физиологической роли ингибитора.
впервые показано, что покоящиеся семена хлопчатника содержат белки, способные ингибировать активность протеолитических Ферментов Фитопатогена - Vertlcilllum dahliae.
Проведенные исследования позволили сделать заключение о том, что в покоящихся семенах хлопчатника существует регуляторная система "протеиназа-ингибитор-субстрат", контролирующая начальный этап протеолиза главного запасного белка-іis глобулина при прорастании семян.
Впервые разработан количественный иммунохимический метод определения вилтоустойчивости новых селекционных сортов хлопчатника. Метод основан на анализе содержания ингибитора протеиназы А в- семенах хлопчатника реакцией иммунопреципитаиии. Показано, что устойчивость хлопчатника к заражению патогеном Еертиииллиум прямо пропорционально зависит от количественного содержания в семенах ингибиторов протеолитігческих ферментов.
Выводы диссертационной работы о существовании в семенах хлопчатника регуляторной системы "протеиназа-ингибитор-субстрат" имеют значение для детального обоснования механизмов протеолиза.
Изучение функциональных свойств ингибиторов протеиназ в семенах хлопчатника, основанное на установленной взаимосвязи содержания ингибиторов и вилтоустойчивости, позволяет однозначно говорить о вполне определенной роли ингибиторов в механизмах зашиты растений.
.Апробация работы, основные положения диссертационной ра&оті
были доложены и обсуждены на II Всесоюзяон симпозиуме . по химии протеолитических Ферментов (Углич, 1979); на Всесоюзном симпозиуме по химии белка (Тбилиси, 1990); на V Международном симпозиуме по
вертипиллиуму (Ленинград. 1990); на IX всесоюзном совещании по им-
о мунитету растений к болезням и вредителям (Нинск. 1991): на IV Международном симпозиуме "Protein structure Function Relationship" (Карачи, Пакистан, 1995).
публикации. По натериалаи диссертации опубликовано 14 печат-
ных работ в виде статей и тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 94 стра-