Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор. Функционализированные полисахариды: гидроксаматы, азиды, малеинаты и альдегиды .9
1.1. Гидроксамовые кислоты (гидроксаматы) .9
1.2. Методы введения гидроксамовой группы 16
1.2.1. Получение гидроксаматов из карбоновых кислот 16
1.2.2. Синтез гидроксаматов из эфиров карбоновых кислот .19
1.2.3. Получение гидроксаматов с использованием N-гидроксисукцинимидных
эфиров карбоновых кислот 23
1.2.4. Синтез гидроксаматов из амидов, ангидридов и альдегидов 25
1.3. Азиды полисахаридов .27
1.4. Малеинаты полисахаридов .34
1.5. Альдегиды полисахаридов .41
Глава 2. Обсуждение результатов 46
2.1. Гидроксаматы полисахаридов 47
2.1.1. Синтез с использованием О-ацилизомочевин полисахаридов .49
2.1.2. Синтез гидроксаматов в присутствии 1-этил-3-[3 (диметиламино)пропил]карбодиимида и N,N -карбонилдиимидазола .57
2.1.3. Синтез гидроксаматов через О-метиловые эфиры, O ацилциклогексилизомочевины, амиды и альдегиды 57
2.2. Азидирование гиалуроновой кислоты, дерматансульфата, каппа-каррагинана и арабиногалактана однореакторным методом 60
2.3. Синтез малеинатов полисахаридов (без применения органических растворителей)... 61
2.4. Синтез глиоксалатов полисахаридов озонированием малеинатов 71
2.5. Биологическая активность гидроксаматов полисахаридов .79
2.5.1. Устойчивость гидроксамата гиалуроновой кислоты к тестикулярной гиалуронидазе 79
2.5.2. Устойчивость гидроксаматов полиуроновых кислот к Aspergillus niger 80
2.5.3. Действие in vitro гидроксамата и конъюгатов гиалуроновой кислоты с биологически активными аминами на фермент матриксную металлопротеиназу-2 81
2.5.4. Антирадикальная активность гидроксаматов и конъюгатов гиалуроновой
кислоты и гепарина с фенольными соединениями 89
Глава 3. Экспериментальная часть 91
3.1. Получение, выделение и очистка полисахаридов 92
3.2. Синтез гидроксаматов полисахаридов 99
3.2.1. Получение с использованием О-ацилизомочевин 99
3.2.2. Синтез гидроксаматов в присутствии 1-этил-3-[3 (диметиламино)пропил]карбодиимида и AyV-карбонилдиимидазола 101
3.2.3. Синтез гидроксаматов через О-метиловые эфиры, О ацилциклогексилизомочевины, амиды и альдегиды 102
3.3. Азидирование полисахаридов 103
3.4. Малеинаты полисахаридов 104
3.5. Малеинирование 1-0-метил-2-амино-2-дезокси- -0-глюкопиранозида... 105
3.6. Синтез глиоксалатов l n, In, Зп, 13п-15п озонированием малеинатов 1 1, 11, 31, 131-151 106
3.7. Синтез конъюгатов гиалуроновой кислоты и гепарина 107
3.8. Определение биологической активности гидроксаматов полисахаридов... 108
3.8.1. Устойчивость гидроксамата гиалуроновой кислоты к тестикулярной гиалуронидазе 108
3.8.2. Оценка развития Aspergillus niger в растворах гидроксаматов 109
3.8.3. Определение ингибирующего действия гидроксамата гиалуроновой кислоты и ее конъюгатов на фермент матриксной металлопротеиназы 109
3.8.4. Антирадикальная активность гидроксаматов гиалуроновой кислоты и гепарина и их конъюгатов 111
Выводы .112
Список сокращений и условных обозначений .114
Список литературы 116
- Получение гидроксаматов из карбоновых кислот
- Синтез гидроксаматов в присутствии 1-этил-3-[3 (диметиламино)пропил]карбодиимида и N,N -карбонилдиимидазола
- Устойчивость гидроксаматов полиуроновых кислот к Aspergillus niger
- Синтез гидроксаматов через О-метиловые эфиры, О ацилциклогексилизомочевины, амиды и альдегиды
Введение к работе
Актуальность работыa. Химически модифицированные полисахариды широко
применяются во многих отраслях промышленности, среди них текстильная, пищевая,
нефтедобывающая, строительная, бумажная, медицинская и косметическая. Такой
многотоннажный продукт, как карбоксиметилцеллюлоза, используется для повышения
нефтеотдачи, применяется в качестве клея для обоев и зубных протезов, на ее основе
разработаны биоматериалы для профилактики спаечной болезни после операций на
кишечнике. Нитроцеллюлоза используется для изготовления взрывчатых смесей
(пироксилина), лаков и эмалей, ацетат и ксантогенат - для производства ацетатного шелка и
вискозного волокна. Гидроксипропилцеллюлоза, ацетат крахмала,
гидроксипропилдикрахмалфосфат и другие производные являются пищевыми эмульгаторами и стабилизаторами, а диальдегид клинического декстрана стал основой разрабатываемого в последнее время биосовместимого, биодеградируемого и нетоксичного хирургического клея, адгезивность которого в 4 раза превышает аналогичный показатель фибринового клея.
Химическая модификация (функционализация) предпринимается с целью направленного модулирования физико-химических и биологических свойств полисахаридов и последующей разработки на их основе новых продуктов и материалов многоцелевого назначения. В частности, введение в макромолекулы таких функциональных групп, как гидрокса-матная, малеинатная (ненасыщенная) и глиоксалатная (альдегидная) позволяет получать производные, обладающие комплексообразующими, антиоксидантными, противогрибковыми, биоадгезивными и др. биомедицинскими свойствами. При этом методология синтеза может зависеть от природы полисахарида. В этой связи разработка методов функционали-зации полисахаридов гидроксаматной, малеинатной и глиоксалатной группами, исследование их структуры и свойств представляется актуальной задачей.
Цель исследования. Разработка эффективных методов функционализации гидрокса-матными, малеинатными и глиоксалатными (альдегид-гидратными) группами таких водорастворимых полисахаридов, как высоко- и низкомолекулярная гиалуроновая кислота, дерматансульфат, гепарин, альгиновая, полигалактуроновая, полиглюкуроновая, полигулуроновая, полиманнуроновая и карбокси-гиалуроновая кислоты, крахмал, декстран и -циклодекстрин.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: разработать пути введения гидроксаматной функции по карбоксильной группе полисахаридов;
разработать методы получения малеинатов по гидроксильным группам полисахаридов без использования растворителей;
исходя из малеинатов, разработать озонолитические методики получения глиоксале-вых эфиров полисахаридов;
aАвтор выражает глубокую благодарность д.х.н., проф., заслуженному деятелю науки РФ В.Н. Одинокову за научные консультации, внимание и помощь, оказанные на всех этапах выполнения работы.
исследовать структуру функционализированных полисахаридов методами одно-
13С) и двумерной (Н-^С HSQC) спектроскопии ЯМР и разработать методы для определения степени функционализации (замещения).
провести биологические испытания функционализированных полисахаридов.
Научная новизна. Впервые с использованием в качестве субстратов О-ацилизомочевин (сложноэфирных аддуктов полисахаридов с 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимидом) синтезированы гидроксаматы кислых полисахаридов (полиуроновых кислот) и охарактеризованы содержанием гидроксамовых звеньев. Показано, что повысить эффективность гидроксамирования удается с помощью ультразвуковой обработки, а снизить рН реакции - добавлением TV-гидроксибензотриазола.
Разработаны эффективные, без использования растворителей, методы синтеза малеи-натов. Обычным или микроволновым нагреванием реакционной смеси до 100-120оС, в том числе с добавлением 10-50% К2СО3 впервые получены малеинаты гиалуроновой кислоты, гепарина, крахмала, декстрана, /?-циклодекстрина и хитина с высокой степенью конверсии спиртовых групп. Методом ЯМР спектроскопии выявлено, что первичные гидроксильные группы проявляют большую реакционноспособность, чем вторичные. Установлено, что ма-леинат гепарина, кроме 0-малеинатных, содержит TV-малеинатные группы, которые образуются в результате замещения TV-сульфатных групп в звене D-глюкозамина.
Озонированием малеинатов низко- и высокомолекулярной гиалуроновой кислоты, крахмала, декстрана и циклодекстрина в воде или в смеси вода/метанол впервые получены соответствующие производные глиоксиловой кислоты (глиоксалаты), которые охарактеризованы степенью замещения гидроксильных групп. С помощью спектров HSQC показано, что альдегидные группы в глиоксалатах находятся в гидратированном состоянии (то есть в виде альдегид-гидратных групп).
Практическая значимость. Получены устойчивые к плесневым грибкам Aspergillus niger гидроксаматы полиуроновых кислот, которые могут представить интерес в качестве водорастворимых и биосовместимых консервантов для косметической и фармацевтической продукции. Выявленные антирадикальные свойства и повышенная устойчивость гидрокса-мата гиалуроновой кислоты к тестикулярной гиалуронидазе и его ингибирующее действие на фермент матриксную металлопротеиназу-2 перспективны в создании лекарственных средств пролонгированного действия, предназначенных для лечения дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата человека и животных. Синтезированные малеинаты и глиоксалаты полисахаридов, способные реагировать с тиольными и аминными группами аминокислот белков и пептидов, могут найти применение в медицине в качестве биоадгезивных соединений (хирургических клеев).
Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на XV Молодежной школы-конференции по органической химии (Уфа, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» (Уфа, 2012), IX Республиканской конференции «Научное и экологическое обеспечение современных технологий» (Уфа, 2012), Всероссийской научной конференции «Теоретические и экспериментальные исследования процессов синтеза, модификации и переработки полимеров» (Уфа, 2013), интернет-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии», (Уфа, 2014), IХ Всероссийской научной конференции с международным участием «Химия и технология
растительных веществ» (Москва, 2015), II Всероссийской молодежной конференции «Достижения молодых ученых: химические науки» (Уфа, 2016), XIX Молоджной конференции-школе по органической химии (С.-Петербург, 2016), IV Всероссийской научной конференции «Теоретические и экспериментальные исследования процессов синтеза, модификации и переработки полимеров» (Уфа, 2016), VII Молодежной конференции (Москва, 2017) и Всероссийской молодежной конференции «Достижения молодых ученых: химические науки» (Уфа, 2017).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы три статьи в рецензируемых журналах и тезисы одиннадцати докладов на конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах, включает введение, литературный обзор на тему «Функционализированные полисахариды: гидрокса-маты, азиды, малеинаты и альдегиды», обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы, список сокращений и условных обозначений, список литературы из 179 ссылок и приложение.
Получение гидроксаматов из карбоновых кислот
Таким образом, гидроксамовая функция входит во многие природные соединения, поэтому она является привлекательной для синтеза лекарственных средств, обладающих антибактериальными, противовоспалительными, антиоксидантными, противогрибковыми и противоопухолевыми свойствами. Одним из самых простых по структуре синтетическим гидроксаматом является ацетогидроксамовая кислота; она ингибирует фермент уреазу и применяется для профилактики мочекаменной болезни (препарат «Литостат», Рисунок 9) [43, 44]. Современные консерванты, разработанные для косметической продукции, включают гидроксамат каприловой кислоты (серия Spectrastat, Inolex Chemical Co., Рисунок 9). Гидроксамовые кислоты, в том числе синтезированные из природных -аминокислот, могут применяться в качестве хиральных лигандов в катализаторах асимметрического синтеза, в частности, для эпоксидирования аллильных спиртов по Шарплессу [10, 12]. Салицилгидроксамовая кислота (Рисунок 9) используется в качестве лиганда катализаторов для синтеза так называемых металлокраунов, которые являются уникальным классом макроциклических соединений, состоящих из ионов металла и гетероатомов в кольце, и могут применяться в качестве молекулярных магнетиков, контрастных агентов для рентгенографических исследований; некоторые металлокрауны обладают антибактериальными свойствами [45]. О
Рисунок 9. Примеры синтетических гидроксамовых кислот. Для терапии дегенеративных заболеваний соединительной ткани разработан обширный класс содержащих гидроксамовую группу ингибиторов ММП -потенциальных лекарственных средств [46]. Недостатками синтезированных гидроксаматов является то, что они не водорастворимы и токсичны. Для улучшения растворимости (и биодоступности) или снижения токсичности в молекулы ингибиторов ММП вводят моносахаридные звенья, например, глюкозу (Рисунок 10) [47].
Гидроксамовые кислоты синтезируют из карбоновых кислот, алкиловых эфиров карбоновых кислот, тиоэфиров, альдегидов, амидов, ангидридов, хлорангидридов кислот, нитрокетонов. В качестве гидроксамирующих реагентов используют гидроксиламин NH2OH и его N-, О-производные: N метилгидроксиламин, О-трет-бутилдиметилсилилгидроксиламин [48] (Рисунок 11) и др. Растворителями являются Н2О, МеОН или их смеси с добавлением других растворителей, например, THF (рН 10). В качестве субстратов для гидроксамирования наиболее часто используются О-алкиловые эфиры кислот, особенно в случае полимерных кислот и ПС типа пектина.
Для получения гидроксаматов из карбоновых кислот используется несколько методов. Самым простым из них является обработка кислот гидроксиламином NH2OH (в виде гидрохлорида) (Схема 1).
Схема 1 R-COOH NH?OH» R-CONHOH При обработке полиакриловой кислоты 1 (Мп = 1000 - 500000 Да) в водной среде при 75-145оС (рН 3-4, 5 ч) получена кислота 2, содержащая 30-40% гидроксаматных звеньев (Схема 2) [49].
Иногда для синтеза гидроксаматов используется конденсация карбоновых кислот с NH2OH под действием карбодиимидов в качестве водоотнимающих реагентов, таких как дициклогексилкарбодиимид (DCC, в неводных средах) [50] и мета-п-толуолсульфонат 1 -циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид (CMC) (в воде). Эти реакции с применением карбодиимидов использовались для спектрофотометрического определения кислот 3, а также пектина 5 и др. кислых полисахаридов (хондроитинсульфат, гиалуронан) в виде гидроксаматов 4 и 6 (Схема 3) [51]. і
В редких случаях для синтеза гидроксаматов применяется карбонилдиимидазольный метод, в котором активация карбоновых кислот 7 N,N-карбонилдиимидазолом 8 (CDI) в органических (THF) или водных средах приводит к соответствующим имидазолам 10 (через соединение 9). При взаимодействии с безводным или водным гидроксиламин-гидрохлоридом имидазолы 10 превращаются в гидроксамовые кислоты 11. В случае ароматических соединений выход составляет 80% (Схема 4) [52, 53].
Синтез гидроксаматов в присутствии 1-этил-3-[3 (диметиламино)пропил]карбодиимида и N,N -карбонилдиимидазола
Для синтеза гидроксамовых кислот обычно используется реакция природных или синтетических алкиловых, обычно метиловых эфиров полиуроновых кислот (например, пектина и метилового эфира АК) с гидроксиламином-основанием в водной (рН 12) или спиртовой среде, при этом степень гидроксамирования не превышает 25% [59-61].
Ранее было показано, что при взаимодействии гликозаминогликанов (ГАГ) 1а-3а с 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимидом (КДИ) в водной среде при рН 4.7-4.8 легко образуются О-(гликозаминогликаноил)изомочевины (общее название О-ацилизомочевины), которые проявляли свойства эфиров и были получены с практически 100%-ной конверсией звеньев уроновых кислот ГАГ в изоуреидные звенья (Схема 2) [138-140]. Соответствующие О-ацилизомочевины ПС 1 а и 1а-9а были нами впервые предложены в качестве субстратов для синтеза гидроксаматов.
Действием 5-мольного избытка КДИ на ПС 1 а и 1а-9а были синтезированы соответствующие О-ацилизомочевины ГЬ и lb-9b (Схема 2). Содержание звеньев с изоуреидными группами (звенья В) в соединениях l b и lb-9b, найденное согласно [138-140], с помощью спектров ЯМР 1Н из отношения приведенных к одному протону интегральных интенсивностей сигналов метильных протонов (СН N-групп (8 2.8 м.д., от изоуреидного остатка в звеньях В) и характеристических сигналов, приведенных в Таблице 2 для каждого из ПС для звена А, составило в среднем 100% мольн. (в расчете на 100 звеньев). При обработке гидроксиламином NH2OH при рН 11.7 l b и lb-9b превращены в гидроксамовые кислоты 1 с и 1с-9с (Схема 2). При меньших рН эффективность реакций гидроксамирования резко снижалась: например, при рН 10 1с не был получен. Появление в ИК-спектрах гидроксамированных продуктов характерной для валентных колебаний N-H в -C(=0)NHOH полосы поглощения при 1552 1559 см"1 [59] и образование железогидроксаматных комплексов с максимумом поглощения при X 520 нм [67] свидетельствовали об образовании гидроксамовых звеньев в структуре ПС. Характеристика гидроксаматов 1 с и 1с-9с представлена в Таблице 2.
После гидроксамирования в продуктах часть звеньев В иногда оставались непрореагировавшими, содержание которых также определяли с помощью ЯМР-спектров.
Гидроксамовые звенья (звенья С) в 1 с и 1с-3с (ВМ ГК и НМ ГК, ДС, ГЕП) и 6с (поли-ГЛ) находили по модифицированной методике спектрофотометрически и с помощью калибровочного графика (стандарт -бензогидроксамовая кислота) рассчитывали содержание гидроксамовых звеньев в ммоль/мг образца [67]. Для того чтобы выразить содержание гидроксамовых звеньев С в % мольн., была выведена формула, при этом принимались во внимание непрореагировавшие звенья В.
1) После реакции гидроксамирования продукты состоят из трех видов звеньев: А (немодифицированные), В (непрореагировавшие изоуреидные) и С (гидроксамовые) (Рисунок 2). Моль-массы этих звеньев обозначим как МА, Мв и Мс, мольные доли - как пА, пв и пс соответственно. Средняя молекулярная масса звена в модифицированном продукте равна Мср =МАпА+МвПв+МсПс.
Звенья А, В и С в гидроксамированных продуктах. 2) По данным гидроксамовой реакции, содержание звеньев C в гидроксамате ПС равно: Aa (в ммоль/мл), где A – оптическое поглощение образца раствора с концентрацией c (мг/мл), и а – тангенс угла наклона калибровочной прямой (а = 885 мл/ммоль).
Содержание гидроксамовых звеньев C в ммоль/мл может быть рассчитано из пропорции: если в образце с концентрацией в растворе с (мг/мл) содержится Х мг звеньев С, то в образце со средней моль-массой (МАnA+МВnB+МСnC) содержится MСnС мг звеньев C. Из этой пропорции находим Х: cMCnC X = , в мг/мл. MAnA + MBnB + MCnC Значение X, поделенное на MС, преобразуется в уравнение: cnC X = в ммоль/мг. MAnA + MBnB + MCnC С другой стороны, A X= . a A a Из этого следует, что A cnC (!) = aMAnA + MBnB + MCnC В модифицированном продукте сумма мольных долей каждого из звеньев равна 1: nA+nB+nC=1, или, преобразовав, получим выражение nA+nC=1-nB. Молярную массу звеньев B и C можно выразить как МB=МА+134 и МC=МА+15 (где 134 и 15 это разность между молекулярными массами звеньев). Преобразуем уравн. 1 следующим образом: вместо МC подставим (МА+15) и вместо МB подставим (МА+134)
После преобразований, уравнение 2 принимает окончательный вид: A (100МA+134B) ас-\5A где МА – молекулярная масса звена А в виде натриевой соли, В – содержание непрореагировавших изоуреидных звеньев, 134 – разность между молекулярными массами звеньев В и А, 15 – между С и А.
Таким образом, зная содержание звеньев В (из спектров ЯMР 1H) в модифицированных продуктах и рассчитав по данным гидроксамовой реакции мольное содержание звеньев С, по разности 100-(В+С) можно определить содержание звеньев А в % мольн. Несмотря на то, что железогидроксамовая реакция является методически несложной, ошибка определения гидроксамовых звеньев в гидроксаматах может быть высокой из-за остаточной влаги в образцах. Образцы должны быть тщательно обезвожены, что достаточно тяжело осуществить в случае ГК, известной своими влагоудерживающими свойствами. Поэтому для количественного определения звеньев С в гидроксамате ГК иногда может быть использован более удобный метод ЯМР 1Н, но при этом исследуемые образцы не должны содержать много непрореагировавших изоуреидных звеньев В, так как протоны -CH2-CH2-CH2-группы находятся в той же области, что и протоны МеСОN-групп, а содержание гидроксамовых звеньев С должно быть не менее 20-25%. При этих условиях в ЯМР-спектре гидроксамата ГК становится заметным расщепление синглета метильных протонов МеСОN-группы на два различных по интенсивности сигнала с 1.93 и 1.96 м.д., что свидетельствует о чувствительности ацетамидной группы к природе соседнего гидроксаматного звена (Рисунок 3). Сигнал с меньшей интенсивностью (37% от общей интенсивности), очевидно, следует отнести к метильным протонам в звене глюкозамина, соседнего с гидроксаматом GlcA. Таким образом, по данным 1Н ЯМР-спектра содержание гидроксамовых звеньев в 1с составило 37% мольн., что практически совпало с результатом железогидроксамовой реакции (40%).
Устойчивость гидроксаматов полиуроновых кислот к Aspergillus niger
Как видно из результатов, представленных в Таблице 4, для большинства ПС нагревание было не очень эффективным. В этих условиях ПГК не вступала в реакцию с МА, малеинаты 3l (ГЕП), 13l (КР), 14l (ДЕ), 9l (карбокси-ГК), 4l (АК), 15l (ЦД), 7l (поли-Г) и 8l (поли-М) были получены с DS от 0.06 до 0.36, при этом некоторые образцы содержали следовые количества дизамещенных малеинатных остатков. Степень N-малеинирования DSN в 3l составила 0.01. Неожиданно высокими оказались DS для малеината хитина (3.1 ммоль/г) и малеината ВМ ГК (2.15), в которых проэтерифицировалось больше половины ОН-групп. В этих условиях НМ ГК проявила меньшую реакционноспособность, DS составила не больше 1.4.
В условиях микроволнового нагревания ( 100-120oC) экспозиция образцов по времени была различной: большинство приобретали желтоватый цвет через 5 мин (2.5 мин для НМ ГК), смесям ГЕП/MA, КР/MA, ДЕ/MA и хитин/MA требовалось не менее 15-20 мин (Таблица 4). Согласно экспериментальным данным MW облучение практически не влияло на реакцию ангидрида с AК и ПГК, в то время как для малеинатов ДЕ, поли-Г и поли-M наблюдалась тенденция к небольшому повышению DS. Наиболее существенно DS увеличилась для малеинатов 3l (ГЕП), 13l (КР), 15l (ЦД) и 16l (хитина), при этом степень N-малеинирования в 3l повысилась до 0.23. Карбокси-ГК реагировала с MA с образованием преимущественно дизамещенных производных, в 13l доля дизамещенных малеинатов также повысилась. Эффективность малеинирования обоих образцов ГК под MW воздействием была достаточно высокой (DS 1.36 и 2.33), но не больше, чем при простом нагревании. Для увеличения в ГК конверсии ОН-групп, образец 1l с DS 1.21 был подвергнут повторному малеинированию в тех же условиях, как для MW реакции. DS в 1l повысилась до 3.23, но продукт был выделен с существенными потерями. Здесь следует отметить, что после MW реакций практически все малеинаты ПС были получены с более низким выходом, чем при обычном нагревании. По-видимому, потери продуктов обусловлены сильной деструкцией макромолекул как под действием MW [101], так и влиянием сильнокислотных карбокси-групп в малеинатных остатках.
Сравнительный эффект некоторых органических (DMAP, TEA) и неорганических оснований (K2CO3) на процесс MW малеинирования оценивался на примере ДЕ. Добавление 10% мольн. DMAP или TEA не оказало особого влияния: DS не превысила 0.4. В присутствии 10% K2CO3 гидроксигруппы ДЕ этерифицировались с большей эффективностью (DS 2), несмотря на меньшее время реакции (15 мин); при этом 1/5 часть малеинатных остатков были дизамещенными. C увеличением K2CO3 до 50% в малеинате ДЕ (DS 2) преимущественно образовывались монозамещенные заместители. Кроме ДЕ, поташ положительно влиял на эффективность этерификации НМ ГК, ЦД, карбокси-ГК, хитина и ПГК. Неожиданно для нас, в этих условиях (10% K2CO3/MW) КР и ГЕП не реагировали, а в малеинате 8l (поли-M) степень этерификации уменьшилась почти вдвое по сравнению с образцом без K2CO3 (Таблица 4). Очевидно, что для этих ПС добавление K2CO3 оказалось неэффективным. При замене K2CO3 на TEA (10%) общая DS в малеинате 3l (ГЕП) повысилась до 0.53 (DSm/DSd 0.28/0.09, DSN 0.16). Сравнительные опыты, выполненные в присутствии K2CO3 при комнатной температуре без MW нагревания, были нерезультативными для всех ПС, кроме ГК. Простое растирание смеси ВМ ГК/K2CO3/MA привело к малеинату ВМ ГК с неожиданно высокой DS 1.33, при этом продукт был выделен без потерь. Из этих результатов видно, что ГК является наиболее реакционноспособной, так как легко малеинируется в мягких условиях. При этом первичные гидроксильные группы в ГК этерифицировались легче, чем вторичные. Такая же закономерность характерна для КР и ЦД (Таблица 4). ПС, содержащие только вторичные ОН-группы, при всех условиях малеинировались с большим трудом, за исключением ГЕП (МW) и Рисунок 10. а) спектр ЯМР 1Н 3l (ГЕП); б) фрагмент спектра ЯМР НSQC 15l (ЦД) с DS 2.65. ДЕ (К2СО3/МW). В этой связи интересно поведение карбокси-ГК - С6-окисленного аналога ГК. Если в образцах малеината ГК DS каждой из вторичных ОН-групп составляла 0.28-0.48, то в малеинате карбокси-ГК DS в лучшем случае достигала 0.1 (К2СО3/МW). В качестве причины такой низкой реакционной способности вторичных ОН-групп мы предположили, что в карбокси-ГК (и в др. полиуроновых кислотах) эти группы недоступны для малеинирования сухим способом. Однако при добавлении в реакцию ПС/К2СО3/MA (МW) 10-15% (вес.) воды общая DS в малеинате карбокси-ГК повысилась только до 0.52 (или 0.17 на каждую из ОН групп). Полиуроновые кислоты реагировали также с низкой DS, остальные ПС, кроме КР и ЦД, этерифицировались в меньшей степени, чем без воды (Таблица 4). Следует отметить, что добавление воды сильно влияло на время проведения реакций. Смеси ПС/Н2O/К2СО3/МА выдерживали MW нагрев не больше чем в течение 0.5-3 мин, а затем сгорали. Продукты были выделены с выходом не более чем 10%, а структура некоторых ПС, по-видимому, сильно изменилась. Например, в ЯМР спектре малеината ГЕП наблюдались не характерные для него сигналы (Рисунок 10а), а в спектре малеината ЦД сигналы с 8 5.3 м.д., отвечающие, по-видимому, аномерным протонам концевого восстанавливающего звена, свидетельствовали о нарушении его циклической структуры (Рисунок 10б).
Синтез гидроксаматов через О-метиловые эфиры, О ацилциклогексилизомочевины, амиды и альдегиды
а) Гидроксаматы 1 с, 1с-9с, общая методика получения в МеОН. Суспендировали О-ацилизомочевины l b, lb-9b (0.9 ммоль) в 20 мл МеОН, добавляли 8 мл 12.5% щелочного NH2OH в МеОН, оставляли при комнатной температуре на 48 часов при постоянном перемешивании. Затем реакционную смесь центрифугировали, осадок растворяли в 10 мл Н2О, добавляли трехкратный избыток по объему МеОН, выпавший осадок отделяли центрифугированием, промывали МеОН (23 мл), затем Et20 (23 мл) и высушивали. Получили от 94 мг до 360 мг (выход 53-99%) 1 с, 1с-9с в виде белого порошка с розоватым оттенком. Содержание гидроксамовых звеньев (звеньев С) определяли согласно [67]. Точную навеску образца соответствующего соединения (3-4 мг) растворяли в 2 мл Н2О, приливали 1 мл приготовленного согласно 5%-го раствора FeC104 и через 5 мин измеряли оптическое поглощение раствора D при X 520 нм образовавшегося железогидроксаматного комплекса. Из калибровочного графика (стандарт - бензогидроксамовая кислота) находили содержание гидроксамовых звеньев (ммоль/мг образца). Результаты приведены в Таблице 2, Глава 2. б) Гидроксаматы 1 с, 1с-9с, методика гидроксамирования в Н2О. Растворяли l b, lb-9b (0.9 ммоль) в 15 мл воды, затем при перемешивании добавляли к охлажденному до 0оС раствору 45 ммоль NH2OHHCl в 15 мл Н2О, рН до 11.7 с помощью твердого КОН. Реакцию проводили 18-36 ч при постоянном перемешивании при комнатной температуре, поддерживая рН с помощью КОН. Затем реакционную смесь нейтрализовали с помощью 0.1 н. НС1, обрабатывали и анализировали на содержание гидроксамовых звеньев С как в опыте а). Получили от 95 до 360 мг (выход 54-99%) 1 с, 1с-9с в виде белого порошка с розоватым оттенком. Содержание звеньев С приведено в Таблице 2, Глава 2. в) Гидроксаматы 1 с, 1с, Зс, гидроксамирование при действии УЗ. Растворы l b, lb, ЗЬ с NH2OHHCl готовили как в б), охлаждали до 0оС и подвергали УЗ в течение 5 мин. После нейтрализации, обработки и определения содержания звеньев С как в опыте а) в зависимости от вида ПС получили от 170 до 360 мг (выход 94-99%) 1 с, 1с, Зс (см. Таблица 2, Глава 2). г) Гидроксамат 1а, гидроксамирование при рН 10. Растворяли 102 мг lb (0.18 ммоль) в 3 мл воды, затем при перемешивании добавляли к охлажденному до 0оС раствору 625.5 мг NH2OHHCl (9 ммоль) в 3 мл Н2О, рН 10. Реакцию проводили 4 ч при постоянном перемешивании при комнатной температуре, поддерживая рН с помощью КОН. После нейтрализации, обработки и анализа [см. опыт а)] получили 69 мг соединения (выход 95%, С 0%). Спектр ЯМР 1Н был идентичен спектру 1а. д) Гидроксамат 1а, гидроксамирование в присутствии НOBt, рН 10. К раствору 102 мг (0.18 ммоль) lb в воде добавляли 121.5 мг НOBt (0.9 ммоль), рН доводили до 10 с помощью NaOH. Затем вносили NH2OHHCl, приготовленный как в опыте г) и далее реакцию проводили аналогично. После нейтрализации, обработки и анализа продукта на содержание звеньев С получили 67 мг (96%) 1с (С 17%). е) Гидроксамат 1а, гидроксамирование в присутствии KCNS. Растворяли 51 мг 1b (0.09 ммоль) в 1.5 мл Н2О, затем добавляли при перемешивании к раствору 312.1 мг NH2OHHCl (4.5 ммоль) в 1.5 мл воды и 1.7 мг KCNS (0.015 ммоль), рН 11.7, после чего вносили 0.15 мл H2O2. Реакцию проводили 12 ч при постоянном перемешивании. После нейтрализации и обработки получили 35 мг (97%) 1с, содержащего 9% звеньев С. 3.2.2. Синтез гидроксаматов в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида и N,N -карбонилдиимидазола а) Гидроксаматы 1с-3с и 5с. Растворяли 1а-3а, 5а (0.25 ммоль) в 3 мл воды, добавляли при перемешивании NH2OHHCl (1.25 ммоль) и КДИ (1.25 ммоль), рН 4.7. Реакцию проводили 18-36 ч при постоянном перемешивании. После нейтрализации, обработки и анализа, как в 3.3.1., а), получили от 48 до 140 мг (91 97%) 1с-3с и 5с, содержащих 5-9% гидроксамовых звеньев С, в виде порошка белого цвета. б) Гидроксаматы 1с, 3с и 5с. Суспендировали 1а, 3а, 5а (0.12 ммоль) в 1 мл THF при перемешивании, добавляли CDI (0.18 ммоль), оставляли на 1 ч при перемешивании. Далее к реакционной смеси при перемешивании добавляли NH2OHHCl (0.6 ммоль), реакцию проводили 12 ч, затем приливали 8 мл МеОН, центрифугировали, растворяли в 2 мл Н2О и обрабатывали как в предыдущих опытах. Получили от 23 до 71 мг (96-97%, С 4-5%) 1с, 3с и 5с.