Развитие лазерных методов ионизации в масс-спектрометрии органических соединений Пенто Андрей Владимирович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Литературный обзор 9

1.1 Методы ионизации с использованием лазерного излучения 9

1.1.1 Селективная фотоионизация 9

1.1.2 Ионизация лазерной плазмой на поверхности образца (LAMMA) 10

1.1.3 «Мягкая» лазерная десорбция-ионизация (Soft LDI) 11

1.1.4 Лазерная десорбция-ионизация, активированная матрицей (MALDI) 12

1.1.5 Поверхностно-активированная лазерная десорбция-ионизация (Surface Assisted Laser Desorption Ionization, SALDI) 18

1.2 Исследование режима лазерной десорбции 28

1.2.1 Рефлектрон как энергетический селектор 29

1.2.2 Метод дрейфа в бесполевом промежутке (FFDM) 29

1.2.3 Задержанная экстракция DEM (delayed extraction method)

1.3 Режим десорбции в SALDI 33

1.4 SALDI масс-спектрометр для анализа растворов 35

1.5 Методы масс-спектрометрического анализа биологических образцов при атмосферном давлении.

1.5.1 Однофотонная ионизация 40

1.5.2 УФ ионизация органических соединений при атмосферном давлении 41

1.6 Заключение. 45

Глава 2. Исследование процесса десорбции ионов в SALDI методом задержанной экстракции 47

2.1 Экспериментальная установка 47

2.1.1. Масс-анализатор с блоком задержанной экстракции и система сбора данных 48

2.1.2 Лазерная система 50

2.1.3 Исследованные химические соединения 52

2.1.4 Методика обработки экспериментальных данных

2.2. Разработка методики формирования SALDI-активного слоя на поверхности подложки для получения отрицательных ионов 56

2.3. Оценка параметров энергетического распределения десорбированных ионов 2.3 Определение вероятности ионизации в режиме регистрации отрицательных ионов в методе SALDI 70

2.4 Выводы 75

Глава 3. SALDI масс-спектрометр для анализа жидких проб 76

3.1 Устройство SALDI масс-спектрометра

3.1.1 Масс-анализатор 77

3.1.2 Лазерная система 78

3.1.3 Интерфейс ввода пробы

3.2. Исследованные химические соединения 82

3.3. Анализ растворов лекарственных препаратов

3.3.1. Оптимизация параметров лазерного излучения 83

3.3.2. Оптимизация параметров нанесения пробы

3.3.3 SALDI масс-спектры лекарственных соединений 87

3.3.4 Воспроизводимость результатов анализа 90

3.3.5. Чувствительность анализа 93

3.4. Выводы 94

Глава 4. Применение лазерной плазмы в качестве ионизатора органических соединений при атмосферном давлении 96

4.2. Описание экспериментальной установки. 97

4.3. Изучение механизмов ионизации аналитических соединений 100

4.3.1 Характерные особенности образования ионов при анализе газофазных образцов 100

4.3.2. Исследование механизмов ионизации летучих органических соединений 103

4.4 Определение порогов обнаружения 106

4.4.1 Порог обнаружения в газообразных соединений 106

4.4.2 Порог обнаружения при абляции твердых образцов . 108

4.5 Оценка пространственного разрешения 110

4.5.1 Оценка разрешения с использованием третьей гармоники Nd:YAG 110

4.5.2 Оценка разрешения с использованием CO2 лазера. 111

4.6 Получение масс-спектрометрических изображений 114

4.6.1 Масс-спектрометрическое изображение модельного объекта 114

4.6.2 Масс-спектрометрическое изображение биотканей 115

4.7 Выводы 116

Заключение 118

Использованная литература

• Ионизация лазерной плазмой на поверхности образца (LAMMA)
• Масс-анализатор с блоком задержанной экстракции и система сбора данных
• Исследованные химические соединения
• Порог обнаружения при абляции твердых образцов

Введение к работе

Актуальность темы

Масс-спектрометрия органических соединений чрезвычайно интенсивно развивается в течение последних десятилетий, поскольку это один из основных источников получения информации о сложных биологических объектах. Для масс-спектрометрического анализа необходимо получить с максимальной эффективностью ионы вещества исследуемого объекта в газовой фазе, при этом их фрагментация должна быть минимальной.

Весьма перспективным и высокочувствительным методом анализа органических соединений с молекулярной массой до 1000 а.е.м. является метод SALDI (Surface Assisted Laser Desorption Ionization). В этом методе молекулы исследуемых соединений адсорбируются из раствора или газовой фазы на специально приготовленную наноструктурированную поверхность кремния, затем импульсным лазерным излучением десорбируются уже в виде ионов и анализируются времяпролёт-ным масс-анализатором. По ряду соединений порог обнаружения может достигать 20 молекул в см³ [А1].

Хотя основное понимание механизмов формирования ионов в SALDI сложилось к настоящему моменту [1], некоторые вопросы, имеющие ключевое практическое значение при проектировании и создании масс-спектрометрического оборудования с источником ионов SALDI, оставались невыясненными: неизвестно влияние напряжённости внешнего электростатического поля на эффективность десорбции ионов в SALDI, неизвестен также вид энергетического распределения десорбиро-ванных ионов в SALDI и влияние на него плотности энергии десорбирующего лазерного излучения.

Другой чрезвычайно актуальной задачей в настоящее время является масс-спектрометрический экспресс-анализ органических объектов при атмосферном давлении в состоянии «как они есть», т.е. без процедуры предварительной подготовки пробы. Это позволяет сохранить исходный химический состав анализируемого объекта без изменений и сокращает время анализа. Поскольку метод SALDI ориентирован, в первую очередь, на анализ в газовой фазе или анализ растворов, а формирование ионов происходит в вакууме, решение этой задачи в рамках SALDI, таким образом, не представляется возможным. Предложенный в этой работе способ ионизации молекул органических веществ излучением лазерной плазмы позволяет проводить масс-спектрометрический анализ без предварительной пробоподго-3

товки и получать масс-спектрометрические изображения биологических объектов при атмосферном давлении.

Цель и задачи работы

Целью диссертационной работы явилось развитие двух лазерных методов ионизации в масс-спектрометрии органических соединений. Это метод SALDI с использованием наноструктурированных кремниевых материалов в качестве эмиттеров ионов, а также новый метод ионизации излучением лазерной плазмы при атмосферном давлении. Для достижения поставленных целей требовалось решить следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную установку для изучения десорбции ионов в SALDI с использованием задержанной экстракции.

2. Изучить влияние внешнего электростатического поля на эффективность десорбции ионов в процессе SALDI и получить вид распределений кинетических энергий десорбированных ионов. Исследовать влияние плотности энергии десор-бирующего лазерного излучения на вид этих распределений.

3. Разработать и создать интерфейс сопряжения масс-анализатора типа QTOF (времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов через газонаполненный транспортный квадруполь, Quadrupole-Time-Of-Flight) и узла транспорта подложек из области атмосферного давления в камеру масс-спектрометра на основе вращающегося шара для анализа растворов методом SALDI. Определить чувствительность метода SALDI при анализе растворов химических соединений на примере лекарственных препаратов.

4. Создать установку для масс-спектрометрического анализа органических объектов при атмосферном давлении на основе масс-анализатора с вводом ионов из области атмосферного давления и ионизацией излучением лазерной плазмы.

5. Разработать метод анализа твёрдых органических объектов при атмосферном давлении без предварительной подготовки пробы в режиме реального времени с использованием лазерной абляции и ионизации продуктов абляции излучением лазерной плазмы. Определить пороги обнаружения этого метода анализа. Получить масс-спектрометрические изображения реальных биологических объектов, определить пространственное разрешение такого метода анализа.

Научная новизна

1. Показано, что эффективность десорбции ионов в процессе SALDI не зависит от напряжённости внешнего электростатического поля. Методом задержанной экстракции определён вид энергетических распределений десорбированных ионов в

процессе SALDI. Показано, что при плотности энергии лазерного излучения, превышающей порог десорбции ионов, её изменение не оказывает влияния на энергетическое распределение десорбированных ионов.

2. Разработан интерфейс сопряжения масс-анализатора типа QTOF и узла ввода SALDI-подложек с нанесённой жидкой пробой. С использованием прибора QTOF, оборудованного таким интерфейсом, определены чувствительности анализа растворов лекарственных препаратов методом SALDI.

3. Предложен способ ионизации органических соединений излучением лазерной плазмы при атмосферном давлении. Исследован механизм образования ионов в этом способе ионизации. Показано, что основным механизмом ионизации молекул органических соединений является протонирование, а источником протона являются присутствующие в атмосферном воздухе молекулы воды.

4. Предложен масс-спектрометрический способ анализа химического состава вещества при атмосферном давлении, включающий лазерную абляцию и ионизацию продуктов абляции исследуемых образцов излучением лазерной плазмы. При анализе этим способом определены пороги обнаружения как летучих соединений, находящихся в следовых концентрациях в атмосферном воздухе, так и нелетучих соединений, поток которых создавался лазерной абляцией анализируемых образцов. Научная новизна способа анализа подтверждена патентом РФ № 2539740.

Практическая значимость

Полученные данные о режимах десорбции ионов в процессе SALDI и влиянии напряжённости внешнего электростатического поля и плотности энергии десорби-рующего излучения на вид энергетических распределений ионов необходимы при проектировании масс-спектрометров с ионными источниками на основе SALDI.

Показана возможность количественного анализа лекарственных препаратов в жидких пробах методом SALDI с использованием масс-анализатора типа QTOF с системой ввода проб из области атмосферного давления. Полученные результаты могут быть использованы для высокочувствительного экспресс-анализа биологических жидкостей.

Предложен новый метод масс-спектрометрического анализа твёрдых органических образцов в состоянии «как они есть» в режиме реального времени при атмосферном давлении на основе лазерной абляции и ионизации продуктов абляции излучением лазерной плазмы. Этот способ может быть применён при анализе пищевых продуктов, в криминалистике, в системах обеспечения безопасности, при анализе и идентификации реальных биологических тканей, в т.ч. онкологических.

Достоверность работы

Достоверность и обоснованность полученных результатов подтверждается результатами лабораторных исследований, систематическим характером проведённых исследований, использованием современного оборудования и методик обработки экспериментальных данных. Полученные результаты согласуются с результатами других исследований.

Защищаемые положения

1. Внешнее электростатическое поле не оказывает влияния на эффективность десорбции ионов в процессе SALDI.

2. При плотности энергии лазерного излучения, превышающей порог десорбции ионов, её изменение не оказывает влияния на энергетическое распределение десор-бированных ионов в SALDI.

3. Использование интерфейса сопряжения узла ввода SALDI-подложек с нанесённой жидкой пробой с масс-анализатором QTOF обеспечивает детектирование ана-литов в растворах на уровне единиц фемтомоль вещества, введенного в прибор.

4. При ионизации органических молекул при атмосферном давлении излучением лазерной плазмы основным каналом передачи заряда является протонирование, а источником протона являются присутствующие в атмосфере молекулы воды.

5. Способ ионизации органических молекул при атмосферном давлении излучением лазерной плазмы обеспечивает протонирование соединений с низкой энергией сродства к протону, что существенно расширяет классы анализируемых соединений по сравнению с SALDI.

6. Способ ионизации излучением лазерной плазмы в сочетании с лазерной абляцией позволяет производить масс-спектрометрический анализ твёрдых органических объектов при атмосферном давлении и получать их масс-спектрометрические изображения с разрешением на уровне 30 мкм.

Личный вклад автора

В диссертации представлены результаты исследований, выполненные автором лично или при его непосредственном участии. Личный вклад автора в работу состоит в разработке и создании экспериментальных установок, в проведении экспериментов по изучению лазерной десорбции ионов в SALDI, процессов ионизации при атмосферном давлении излучением лазерной плазмы, разработке методик обработки экспериментальных данных и интерпретации полученных результатов, написании статей.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на всероссийских и международных конференциях: IV Всерос. конф. с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» памяти В.Л. Тальрозе (10-14 октября 2010 г., г. Звенигород); Пятый съезд ВМСО - IV Все-рос. конф. с межд. участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы») (05-09 сентября 2011 г., г. Москва, пос. Московский); VIII Всерос. конф. по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2011» (26 июня – 2 июля 2011 г., г. Архангельск); 60th ASMS Conf. on Mass Spectrom. and Allied Topics (May 20 - 24, 2012 Vancouver, Canada); The Conf. on Innovations in Mass Spectrom. Instrumentation INN MASS SPEC 2013 (St. Petersburg, Russia, 14–18 July 2013); IX Всерос. конф. «Экоаналитика-2014» (г. Светлогорск, 23 – 28 июня 2014 года).

Публикации

Основные результаты работы опубликованы в 7 статьях в отечественных журналах из списка ВАК и 1 зарубежном журнале, получен 1 патент на изобретение.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения и списка цитируемой литературы из 150 наименований. Диссертация изложена на 127 страницах, содержит 55 рисунков и 6 таблиц.

Ионизация лазерной плазмой на поверхности образца (LAMMA)

Практически одновременно с работой Танаки была опубликована работа Караса и Хилленкампа применили подход с использованием поглощающей лазерное излучение органической матрицы к ионизации биоорганических макромолекул. В работе [4] в качестве матрицы использовалась никотиновая кислота. Раствор анализируемого вещества смешивался с раствором никотиновой кислоты, капля получившегося раствора наносилась на металлическую подложку и высушивалась. Концентрация матрицы при этом на несколько порядков превосходила концентрацию аналита. Затем металлическая подложка с каплей вводилась в вакуумную камеру времяпролётного масс-анализатора эффективной длины 2,5м и подвергалась импульсному воздействию 4й гармоники лазера Nd:YAG, длина волны излучения - 266 нм, длительность импульса - 10 нс.

Авторам удалось зарегистрировать ионы молекулярной массы более 110000 а.е.м., этот метод анализа авторы назвали «matrix-UVLDI» , matrix ultraviolet laser desorption-ionization[4]. Впоследствии метод получил название MALDI – matrix assisted laser desorption-ionization, или лазерная десорбция ионизация, активированная матрицей. Метод MALDI впоследствии получил широкое распространение, поскольку оказался более эффективен в ионизации тяжёлых органических молекул, чем метод, предложенный Танакой.

Дальнейшие усилия по развитию метода MALDI были направлены на поиски различных веществ для использования в качестве матриц и подбора оптимальных параметров лазерного воздействия для десорбции и ионизации [20-26]. В качестве матрицы использовались, в основном органические кислоты. Применялись различные типы лазеров: TEA CO2 лазер, Er:YAG лазер, 3я и 4я гармоники Nd:YAG лазера, азотный лазер и др.

Стандартная схема анализа с использованием MALDI выглядит следующим образом. Жидкий раствор изучаемого вещества и матрицы наносится на специальную металлическую подложку и высушивается. Изучаемое вещество должно быть сокристаллизовано с матрицей. Как правило, вещества матрицы на несколько порядков больше, чем изучаемого вещества. Затем подложка вводится в вакуумную камеру времяпролётного масс-анализатора. Как правило, это – рефлектрон. На поверхность подложки с пробой воздействуют лазерным импульсом. Матрица должна эффективно поглощать десорбирующее лазерное излучение. Под действием лазерного излучения происходит электронное, как в случае использования ультрафиолетовых лазеров, или колебательное возбуждение матрицы в случае использования ИК лазеров.

Поглощение лазерного излучения приводит к взрывному испарению и перевода матрицы и анализируемого вещества в газовую фазу с формированием области локально высокого давления, называемой «факелом» или «плюмом». На рис.1.2 приведено изображение факела, полученное методом LIF (laser induced fluorescence) [27]. Рис. 1.2. Изображение эволюции во времени факела MALDI, полученное методом LIF (laser induced fluorescence) в работе [27].

Хотя характерное время лазерного воздействия составляет величину несколько нс, время существования плотного столкновительного факела может быть значительно больше, по разным оценкам, порядка мкс [28, 29]. Факел играет ключевую роль в MALDI, поскольку различные процессы, протекающие там, в конечном счёте, приводят к передаче заряда молекуле исследуемого соединения [28, 30]. Физика процессов, протекающих в факеле чрезвычайно сложна и по настоящий момент остаётся предметом изысканий. Хотя однозначного понимания процессов, приводящих к передаче заряда, не сложилось, был выделен ряд характерных черт, присущих ионизации методом MALDI: матрица должна поглощать десорбирующее лазерное излучение и быть эффектривным донором протона, обеспечивая протонирование анализируемых соединений в плотном факеле. Изучению процессов, проходящих в факеле и передачи заряда молекулам исследуемого соединения посвящено большое количество работ, как экспериментальных, так и теоретических, в том числе обзоров[28, 30, 31]. В настоящее время MALDI является основным методом анализа высокомолекулярных биоорганических соединений.

Конструктивные особенности MALDI масс-спектрометров Процесс образования ионов в MALDI обладает рядом особенностей, которые необходимо учитывать при построении масс-спектрометров с источником ионов этого типа. В первую очередь, MALDI является импульсным источником ионов, по этой причине оптимальным решением является использование времяпролётного масс-анализатора в сочетании с этим источником ионов.

Одним из основных параметров любого масс-спектрометра является его разрешающая способность. Среди ключевых факторов, ограничивающих разрешение времяпролётного прибора – начальный разброс скоростей и пространственных положений ионов в ускоряющем промежутке. Полностью устранить влияние этих факторов невозможно в силу особенностей процесса образования ионов, однако это влияние можно частично компенсировать. Ряд технических решений, позволяющих это осуществить, стал неотъемлемой частью всех современных MALDI приборов.

Задержанная экстракция и двухсеточный источник Для улучшения разрешения времяпролётного масс-анализатора с импульсной ионизацией электронным ударом в 1955 Вили и МакЛареном [32] была предложена схема с применением задержанной экстракции. Подход подразумевает подачу напряжения на электроды ускоряющего промежутка спустя некоторое время после образования там ионов. Схематично конструкция прибора приведена на рис.1.3. В участке (1) электрическое поле напряжённостью Es создаётся между сплошным электродом (2) и первой сеткой. На расстоянии s до неё образуются ионы, отмечено звёздочками на рисунке. После вылета из промежутка (1) ионы затем дополнительно ускоряются в промежутке (3) с напряжённостью поля Ed, затем попадают в промежуток свободного пролёта(4) с нулевой напряжённостью электрического поля и дают сигнал на коллекторе (5). В качестве коллектора может выступать вторичный электронный умножитель.

Масс-анализатор с блоком задержанной экстракции и система сбора данных

В экспериментах использовался линейный времяпролётного масс-анализатор с длиной свободного пролёта 650 мм и ускоряющим промежутком 14 мм. Камера масс-спектрометра (1) откачивалась турбомолекулярным насосом (VarianTurbo-V250), что обеспечивало остаточное давление в камере на уровне 10-7 Торр. В качестве детектора ионов (2) была использована сборка двух микроканальных пластин (МКП, F9892-11, Hamamatsu) с длительностью одноионного импульса менее 1 нс и диаметром активной поверхности 40 мм. Сигнал с детектора ионов обрабатывался высокоскоростным суммирующим АЦП (AgilentU1081A, AcqirisAP100) с частотой дискретизации 1 ГГц и полосой 500 МГц, установленным в компьютере (3). Используемый АЦП предоставляет возможность аппаратного суммирования сигналов, что позволяет усреднять масс-спектры, следующие с частотой до 174 Гц при частоте обмена с компьютером 1 Гц. Система регистрации обеспечивает надёжное обнаружение сигнала единичного иона амплитудой 2 мВ, что соответствует 5 битам АЦП. Дальнейшая аппаратная обработка сигнала состояла в накоплении разовых сигналов во внутренней памяти платы сбора данных, передаче накопленного сигнала в персональный компьютер с частотой 1 Гц и последующей его обработке специальной программой [135]. Аппаратное накопление позволяет существенно снизить нагрузку на интерфейс передачи данных.

Амплитуда одноионного импульса МКП зависит от напряжения на пластинах детектора. Обычно в экспериментах среднее количество ионов в измеряемом пике находится в диапазоне 0.1 -10 ионов за один лазерный импульс. Поэтому напряжение на пластинах выбиралось так, чтобы среднее значение одноионного импульса составляло не менее 5 отсчетов АЦП.

В режиме регистрации положительных ионов в камеру масс-спектрометра подавали пары воды. С это целью использовался резервуар с водой, соединённый с вакуумной камерой через капилляр с натекателем (13). Давление паров воды регулировали в диапазоне 10-7-10-6 Торр.

Для установки подложки – эмиттера ионов в ионном источнике масс-анализатора использовался специальный шлюзовой узел (15). Телевизионная камера, установленная перед одним из окон вакуумной камеры масс-спектрометра, позволяла контролировать установку подложки и правильность позиционирования пятна лазерного излучения на её поверхности.

Использование генератора высоковольтных импульсов с блоком задержки (11) позволяло производить десорбцию ионов в режиме задержанной экстракции. В экспериментах использован генератор высоковольтных импульсов (ООО «Палс Лаб», Москва) с амплитудой импульса 4 кВ, неравномерностью вершины импульса +/-2,5%, временем нарастания импульса 10 нс и регулируемым временем задержки в диапазоне 0.045 2,5 мкс относительно задающего оптического синхроимпульса. Оптический синхроимпульс формировался генератором (12) на основе быстродействующего лавинного фотодиода с временным разрешением менее 1 нс под воздействием импульса лазерного излучения. Такая система позволяла подавать ускоряющее напряжение с регулируемым временем задержки относительно десорбирующего импульса лазерного излучения. При этом запуск АЦП был синхронизован с фронтом импульса ускоряющего напряжения. 2.1.2 Лазерная система

Для лазерной десорбции-ионизации использовалась 3 гармоника излучения Nd:YAG лазера (4) с диодной накачкой (РЛ-02.355 производства ЭЛС-94, Москва) с длиной волны 355 нм, длительностью импульса 0.37 нс и частотой следования импульсов 300 Гц Максимальная энергия лазерного импульса составляла 30 мкДж и регулировалась в широком диапазоне с помощью аттенюатора (5), представляющим собой многослойное диэлектрическое зеркало, установленное на поворотном столике. Энергия лазерного импульса после аттенюатора контролировалась измерителем на основе фотодиода ФД-7 (6). Линзой (7) с фокусным расстоянием 36 см излучение фокусировалось на активную поверхность эмиттера ионов (8). Поскольку в методе SALDIмолекулы анализируемых соединений накапливаются на подложке-эмиттере ионов, сорбируясь из газовой фазы, количество десорбированных ионов пропорционально облучаемой площади. Для увеличения облучаемой площади использовано двузеркальное электромеханическое устройство сканирования (9) (УСЛ-03, ИМКЭС СО РАН), разворачивающее луч в прямоугольный кадр без самопересечений размером 1.750,6 мм2на поверхности подложки. Схема движения луча в кадре приведена на рисунке 2.2.

Размер кадра определялся при помощи фотобумаги. Длительность одного цикла сканирования составляла 1.7 с, что при частоте следования лазерных импульсов 174 Гц обеспечивало увеличение облучаемой площади примерно в 300 раз.

Для определения пространственного распределенияплотности энергии пятна лазерного излучения на поверхности подложки на пути луча между линзой и окном вакуумной камеры устанавливался расщепитель – плоскопараллельная пластинка из кварцевого стекла. Отражённый от одной грани расщепителя луч падал на чувствительный элемент ПЗС-матрицы Genteс WinCamD (10), размер пиксела 44 мкм, разрешение 10241200. Положение матрицы выбиралось таким образом, чтобы размер кадра на ней совпадал с размером кадра на подложке, чтобы обеспечить совпадение распределений плотности энергии пятна на матрице и на подложке. Пространственное распределение пятна лазерного излучения на поверхности подложки-эмиттера ионов, полученное при помощи матрицы, приведено на рисунке 2.3.Площадь пятна оценивалась по уровню 1/e, как площадь эллипса WaWb и составила 1,210-4 см2.Плотность энергии лазерного излучения на поверхности при этом могла достигать 300 мДж/см2.

Пространственное распределение пятна на поверхности подложки, полученное при помощи ПЗС-матрицы (слева), сечения пространственного распределения вдоль направленийосей эллиптичности пятна (справа) обозначены чёрной линией, аппроксимации сечений гауссовой функцией обозначены тонкой красной линией. Значения полуширин аппроксимаций Wa = 51.3 мкм и Wb = 80.4 мкм по уровню 1/e.

На рисунке 2.4 приведено изображение кадра сканирования, полученного с помощью ПЗС-матрицы. Измеренные в специализированной программе обработки изображений с матрицы расстояния между пятнами соседних лазерных импульсов и расстояние между дорожками в кадре приведены на рисунке. Эти величины составили, соответственно, 65 и 80 мкм. Геометрический размер кадра составил 1800600 мкм.

В соответствие с полученными данными, плотность заполнения кадра сканирования была достаточной для того, чтобы обеспечить десорбцию адсорбированных веществ со всей площади кадра.

Исследованные химические соединения

Масс спектр для каждого из исследованных соединений регистрировался как в режиме задержанной экстракции, так и в режиме постоянно поданного ускоряющего напряжения. Масс-спектры, полученные в режиме задержанной экстракции с минимальной задержкой 50 нс и с постоянно поданным ускоряющим напряжением практически идентичны, как это хорошо видно на рисунке 2.6, лишь незначительно отличается форма пиков. При переходе между двумя режимами, ионный ток по каждому из пиков в масс-спектре не изменялся. Такое поведение характерно для всех исследованных соединений.

При увеличении длительности задержки между десорбирующим лазерным импульсом и подачей ускоряющего напряжения наблюдается уширение пиков и уменьшению их амплитуды[А2, А3]. На рис. 2.11 приведена эволюция хронограммы пика протонированной молекулы кофеина в положительной моде (рис. 2.11а) и депротонированной молекулы тринитрофенола (рис. 2.11б) в режиме регистрации отрицательных ионов с увеличением задержки. Все пики в масс-спектре имеют ярко выраженную несимметричную форму. Полный ионный ток и ток ионов аналитов во всём диапазоне задержек не изменялся. На рис. 2.12 это показано на примере тринитрофенола в режиме регистрации отрицательных ионов и кофеина в режиме регистрации положительных ионов. Точке с нулевой абсциссой соответствует режим с постоянно включенным ускоряющим напряжением. Рис.2.11. Эволюция хронограммы пика протонированной молекулы кофеина в режиме регистрации положительных ионов (а) и депротонированной молекулы тринитрофенола в режиме регистрации отрицательных ионов (б) при увеличении длительности задержки.

Зависимость ионного сигнала от длительности задержки: 1 - полного (интеграл по всему спектру) в режиме регистрации положительных ионов, 2 - полного в режиме регистрации отрицательных ионов, 3 - положительных ионов кофеина, 4 - отрицательных ионов (депротонированных молекул) тринитрофенола

Идентичность масс-спектров, полученных в режиме задержанной экстракции с минимальной задержкой и в режиме с постоянно включенным ускоряющим напряжением, говорит о том, напряжённость внешнего электростатического поля не оказывает влияния на эффективность десорбции ионов в SALDI [А2, А3]. Этот результат был экспериментально подтверждён на другой установке в диапазоне напряжённостей внешнего электростатического поля 0-25 кВ/см. Этот факт имеет принципиальное значение для разработки ионного источника SALDI [А1].

Важным результатом является также то, что на отрезке времени между десорбцией ионов и подачей ускоряющего напряжения процессы релаксации ионов не приводят к значительным потерям десорбированных ионов, о чем свидетельствуют зависимости на рис.2.12.

Эти обстоятельства дают основания для анализа пролётных распределений. Для анализа разлёта ионного облака в режиме задержанной экстракции применяется подход, основанный на связи времени пролёта с начальным положением ионов в ускоряющем промежутке и широко применяется для анализа режима десорбции ионов в MALDI (например, [93, 94]). Приборы, преимущественно использованные в экспериментах, имеют двухсеточный ускоряющий промежуток Вили-МакЛарена. В экспериментальной конфигурации, использованной в диссертационной работе, ускоряющий промежуток имеет одну сетку, что упрощает анализ экспериментальных данных.

Энергия, которую приобретает ион в ускоряющем промежутке, пропорциональна расстоянию от его положения до выходной сетки ускоряющего промежутка. Таким образом, по экспериментальному времени пролёта иона можно определить его стартовое положение в ускоряющем промежутке на момент включения ускоряющего электрического поля [93, 94].

Допустим, начальная скорость иона после десорбции составляла v0 в направлении, перпендикулярном подложке. Тогда за время в отсутствие ускоряющего электрического поля ион сместится на расстояние x = v0 от подложки. Кинетическая энергия, приобретённая ионом массы m после включения ускоряющего поля пропорциональна полной длине ускоряющего промежутка за вычетом этого смещения, поэтому: Еъ = и скорость иона vout на выходе ускоряющего промежутка составит

Можно предположить, что температура десорбируемой молекулы и ее тепловая скорость определяются температурой поверхности в момент десорбции. Температура поверхности, как это показано выше, не превышает в экспериментах температуры плавления кремния 1683К, поэтому тепловая скорость десорбированных ионов много меньше скорости, приобретаемой им на выходе ускоряющего промежутка (более 3500 эВ). Вследствие этого можно считать, что полное время пролёта связано только с положением иона в ускоряющем промежутке на момент включения поля. Как показывают численные оценки [1], температура поверхности подложки-эмиттера ионов при значениях плотности лазерной энергии, используемых в эксперименте, составляет величину около 1500-2000 К. Разумно предположить, что начальная кинетическая энергия десорбированных ионов и нейтральных молекул определяется этой величиной, то есть vout не зависит от vo.

Полное время пролёта иона с учётом сказанного выше, можно записать как функцию, зависящую только от положения в ускоряющем промежутке на момент подачи ускоряющего напряжения:

Масс-спектрометрический пик ионов заданной массы, представленный во временной шкале, т.е., хронограмма, будет являться их пролётным распределением fit). При этом, остальные пики в масс-спектре игнорируются. Зная это распределение и вид зависимости tofix) времени пролёта от положения в ускоряющем промежутке на момент включения поля можно перейти к пространственному распределению g(x) ионов данной массы на момент включения ускоряющего электрического поля: d Результат этой операции представлен на рисунке 2.14 на примере преобразования пролётных распределений (хронограмм) протонированных молекул кофеина, m/z 195 (а), и депротонированных молекул тринитрофенола, m/z 228 (б), в пространственные распределения для некоторых задержек. Распределения нормированы по высоте.

Нормированные пространственные распределения протонированных молекул кофеина в режиме регистрации положительных ионов (а) и депротонированных молекул тринитрофенола в режиме регистрации отрицательных ионов (б) при различных длительностях задержки. Величины задержки указаны на диаграмме.

Зная пространственные распределения можно получить такие параметры распределения, как положение центра масс распределения, положение переднего и заднего фронтов. А по виду зависимостей этих параметров от величины задержки судить о режиме разлёта облака десорбированных лазерным излучением ионов и нейтральных молекул. Для каждой величины задержки были получены эти параметры. Характерный вид зависимостей параметров от задержки приведен на рисунке рис. 2.15. Видно, что значения параметров линейно возрастают с увеличением задержки, т.е. скорости десорбированных частиц со временем не изменяются. Как было отмечено в главе 1, это характерно для такого режима разлёта, когда взаимодействия в облаке ионов прекратились. Полученный результат позволяет говорить о том, что разлёт облака десорбированных лазерным импульсом ионов и нейтральных молекул в диапазоне длительностей задержки 50-500 нс идёт в бесстолкновительном режиме, причем другие возможные факторы влияния на разлёт не оказывают.

Порог обнаружения при абляции твердых образцов

Такой характер спектров существенно облегчает процедуру идентификации целевого соединения при анализе многокомпонентных проб, поскольку пик с максимальным значением m/z характеризует молекулярную массу соединения, а фрагментный пик дает информацию о структуре молекулы. Возможность одновременного наблюдения в масс-спектрах соединения небольшого числа пиков даёт методу SALDI преимущество перед другим масс-спектрометрическим методом – ионизацией электрораспылением, который наиболее часто используют для анализа растворов, содержащих лекарственные соединения. В качестве примера на рис.3.6 приведено сравнение двух масс-спектров верапамила, которые были получены в двух различных режимах работы прибора: с ионизацией электрораспылением и SALDI (см. рис. 3.3). Видно, что в масс-спектре электрораспыления доминирует пик протонированных молекул целевого соединения и практически отсутствуют характерные фрагменты, в то время как SALDI масс-спектр наряду с протонированным верапамилом содержит также два фрагментных пика с m/z 165 и m/z 303. Аналогичные результаты получены при определении других исследованных в работе аналитов.

Предполагаемая схема фрагментации протонированных молекул верапамила приведена на рис.3.6-а. Она полностью соответствует предложенным в работах [1, 110] основным схемам фрагментации аминов в процессе SALDI. Как показано в этих работах, фрагментация обусловлена разрывом химических связей, ближайших к атому азота, после присоединения протона к азоту. При этом схема фрагментация остается одной и той же и при анализе растворов, и при анализе соединений, находящихся в газовой фазе. В качестве примера на рис.3.7 приведены два масс-спектра лидокаина, полученных при нанесении раствора аналита в метаноле с использованием шарового интерфейса (рис.3.7-а) и при нанесении аналита из эффузионной ячейки Кнудсена с использованием линейного времяпролетного масс-спектрометра, описанного в главе 2. Плотность энергии лазерного излучения была одинаковой в обоих случаях. Видно, что полученные масс-спектры содержат один и тот же набор пиков, однако соотношение амплитуд пиков различно: интенсивность фрагментного пика при газофазном вводе пробы существенно выше, т.е. степень фрагментации при анализе растворов ниже. Этот факт можно объяснить различием давлений в ионном источнике. В случае с газофазным нанесением эта величина составляет 10-6 Торр, в то время как в интерфейсе транспортным квадруполем давление – 5 10-3 Торр. Вследствие большего числа столкновений после десорбции с поверхности протонированная молекула может более эффективно передавать избыток внутренней энергии молекулам спутного газа, присутствующим в источнике. В результате чего падает вероятность фрагментации. верапамил

Рис. 3.6. Масс-спектры верапамила, полученные: (а) – методом SALDI при анализе раствора и (б) – методом ионизации электрораспылением. На вставке приведена предполагаемая схема фрагментации протонированных молекул верапамила при ионизации методом SALDI.

Для оценки воспроизводимости результатов анализа для каждого аналита было проведено пять последовательных анализов растворов. Используемый в экспериментах шприцевой насос позволял с высокой точностью устанавливать скорость подачи пробы, а длительность нанесения пробы и время сканирования поверхности лазерным излучением после введения подложки в камеру масс-анализатора фиксировалось с помощью соответствующей программы управления параметрами лазерного масс-спектрометра. В условиях эксперимента две подложки с SALDI-активным слоем устанавливались симметрично по диаметру шара. На одну из них наносилась проба, а вторая в это время обучалась лазером. Затем шар поворачивался на полоборота, и процесс повторялся.

На рис. 3.7а приведена зависимость ионного сигнала по протонированным молекулам и характерным фрагментам верапамила от времени при последовательном проведении нескольких циклов нанесения-анализа. Первые четыре цикла на рисунке соответствуют анализу пробы, не содержавшей аналит, а следующие девять циклов – анализу раствора верапамила. Видно, что максимум ионного сигнала соответствует первому лазерному импульсу, после чего сигнал быстро уменьшается, что соответствует десорбции нанесенного на подложку вещества. Более наглядную информацию, характеризующую воспроизводимость сигнала при анализе одной пробы, дает рис.3.7б, на котором представлены значения суммарного ионного сигнала верапамила для различных циклов нанесения-анализа в этом же эксперименте. Относительное стандартное отклонение зарегистрированного суммарного ионного сигнала составило 5%.

Очевидно, при анализе различных проб одного и того же аналита воспроизводимость результатов хуже, поскольку на результат анализа влияет ряд дополнительных факторов, например, погрешность приготовления пробы, погрешность способа формирования активной поверхности эмиттера ионов и ряд других. На основе полученных результатов можно сделать вывод, что относительное стандартное отклонение в этом случае для всех исследованных соединений не превышает 8% (для 5 анализов). Это свидетельствует о том, что разработанный интерфейс ввода проб, наряду с лазерным масс-спектрометром дают возможность проводить количественный анализ лекарственных соединений. 30000

Чувствительность является одним из наиболее важных аналитических характеристик метода анализа вещества. Для SALDI чувствительность можно определить как отношение ионного сигнала (суммарного количества ионов химического соединения с учетом фрагментных пиков), полученного за время сканирования к количеству соединения, нанесённого на поверхность подложки. Количество нанесённого вещества легко подсчитать, зная расход раствора, его концентрацию и длительность нанесения. Значения чувствительности при определении исследованных лекарственных соединений приведены в таблице 3.2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что метод SALDI обеспечивает детектирование аналитов в растворах на уровне фемтомоль (10-15 моль) вещества, введенного в прибор.

Для того чтобы более ясно представлять аналитические возможности SALDI, было проведено сравнение этого метода с методом ионизации электрораспылением. Как уже отмечено выше, электрораспыление является самым распространённым на сегодняшний день способов ионизации при анализе нелетучих лекарственных соединений. Ионизация происходит в факеле распыла при атмосферном давлении, поэтому приборы, использующие этот способ ионизации снабжены газодинамическим интрефейсом ввода ионов в масс-анализатор из области атмосферного давления. Прибор, описанный в этой главе, позволяет работать как в режиме ионизации SALDI с узлом ввода подложек на основе вращающегося шара, так и в режиме ионизации электрораспылением с газодинамическим вводом ионов из области атмосферного давления. Замена узлов ввода ионов не затрагивает конструкции транспортной и пролётной частей масс-анализатора, поэтому в данной ситуации можно провести корректное сравнение работы двух источников ионов на одном и том же приборе.

При определении чувствительности в режиме с ионизацией электрораспылением условия ввода пробы, а именно, концентрации вещества в растворах, скорость подачи раствора и длительность распыления, были такими же, как и при определении чувствительности SADLI. Единственное отличие заключалось в том, что в растворы дополнительно добавляли трихлоруксусную кислоту (концентрация в растворе 0.1%) в соответствии со стандартной процедурой электрораспыления. Чувствительность метода ионизации электрораспылением определялась как отношение суммарного количества зарегистрированных ионов аналита за время эксперимента к количеству вещества, введённого в прибор за время анализа с учётом расхода раствора и концентрации аналита в распыляемом растворе. Полученные результаты приведены в таблице 3.2.