Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Разработка спектрально-флуоресцентных методов измерения и лазерно-спскгроскопического оборудования 19
1.1. Измерение спекгров лазерно-нндуцированной флуоресценции биологических тканей 19
1.2. Измерение спектров рассеяния биологических тканей 24
1.3 Разработка методов регистрации флуоресцентных изображений 28
1.4. Оценка глубины фотодинамического эффекта при воздействии лазерною излучения на биоткань 32
Глава 2. Создание методов регистрации фотосенсибилнзаторов и биологических тканях 33
2.1. Методика приготовления стандартных образцов биологических сред содержащих фотосенсибилизаторы 33
2.2. Исследование распространения света с различной длиной волны в биологических тканях 35
2 3. Распространение лазерного излучения в тонких слоях биологических тканей 39
2.4. Результаты математического моделирования распространения света в биоткани для используемого волоконно-оптического катетера 42
2.5. Некоторые технические решения по оптимизации методик измерения спектровфлуоресценции 45
Глава 3. Разработка метода оценки эффективности фотосенсибилизаторов 48
3 1. Метод оценки эффективности фотосенсибилизаторов с применением элементов крова 48
3.2. Метод оценки эффективности фотосенсибилнзаторов в клеточных суспензиях 50
3.3. Метод оценки эффективности фотосенсибилнзаторов в биологических тканях in vivo (51
Глава 4. Особенности исследованиялазерно-индуцировааной флуоресценциипатологических тканей различных органов 53
4.1. Разработка оптоволоконного интраскопа для флуоресцентной диагностики поверхностных и приповерхностных патологических образований кожи 53
4.2. Лазерная avгофлуоресцентная спектроскопия человека 57
4.3. Лазерная флуоресцентная спектроскопия человека с применением фотосенсибилизаторов 59
4.4. Лазерная флуоресцентная спекгроскопия как метод контроля эффективности фотодинамической терапии человека 63
Выводы 63
Литература 65
- Измерение спектров рассеяния биологических тканей
- Исследование распространения света с различной длиной волны в биологических тканях
- Метод оценки эффективности фотосенсибилизаторов с применением элементов крова
- Лазерная флуоресцентная спектроскопия человека с применением фотосенсибилизаторов
Измерение спектров рассеяния биологических тканей
Основным преимуществом методов спектраіьшго анализа тканей іл vivo яііля-стсч их неиввазивность. Это позволяет получать информацию о состоянии тканей, не влияя на динамику различных биологических процессов. Такое вмешательство может зачастую оказаться нежелательным или даже опасным- Так, например, взя-іис провід ткани 1 бнопсик из мсяадомы может привести к генерализации аиуко-левого процесса.
Другим преимуществом оптического анализа тканей является возможность обработка данных в реальном масштабе времени н корректировки параметров терапевтического процесса в соответствии с полученной информацией. Так, например, анализ концентрации и химического состояния фотосеисибилизаторов в процессе фотодинам и ческой терапии дает возможность скорректировать интенсивность лазерного облучения.
Следует тжкб отметить, что благодаря прогрессу в области оптоэлектроники и Микропроцессорной техники систему для спектрального анализа тканей можно сделать компактной и переносной.
Несмотря на неоспоримые достоинства спектрально -флуоресцентных методов исследования биологических тканей in vivo, в медицинской практике их применение весьма, ограничено, и используется оки только б крупных медицинских центрах» имеющих Б своем составе физические группы. Причин здесь несколько. Главная m икх — это то, что н ереяж еяектров флуоресценции или рассеяния Живого объекта является само по себе сложной задачей, но еще более сложной является задача получения количественной информации, характеризующей состояние той или иной биологической ткани.
Аппаратурное обеспечение ФД и ФДГ должно отвечать следующим требованиям, Скорость обновления измеряемого спектра или флуоресцентного изображения Не должна превышать 0,5-1 сек- В наших исследованиях обычно используется ЇООмс. Этого хватает, чтобы избежать погрешности, связанной с сердечными импульсами, перистальтикой» дыханием или нервными импульсами. Скорость обработки результатов измерений осущесоляется ц режиме реального времеш, что даст возможность оценивал, концентрацию фотосенсибилизатора или стелень оксигенэдии гешгдобкна в исследуемых тканях, я $перат\тано иршишать тъ или иное решение. Суммарно отнедемное время на флуоресцентную диагностику желудка, легкого или иного полого органа не превышает 1-2 мин. Время, отделенное на ФДТ, составляет 10-] 5 мин для полых органов идо одного часа для кожного покрова. Исходя из этого, подбираются соответствующие плотности мощности облучения.
Точность биологических исследований обычно не очень высока и разброс по концентрациям фотосенсибилизатора при одной и той же вводимой дозе разным пациентам может отличаться в полтора-два раза для одной и той же биологической ткани. Поэтому точность определения концентрации допускает разброс 20-30 %. Точность же определения степени оксигенании должна быть не хуже 8-10%. Во время терапии равномерность светового пятна но интенсивности не должна превышать 15-20%. Точности определении световой дозы, поглощенной биологической тканью, не хуже 20-30%.
Концептрация фотосенсибилизвторов, которая реализуется во чремя ФД и ФДТ, в среднем составляет от 0.1 до 10 мг на один килограмм веса пациента. В наших исследованиях высокой чувствительности мы добиваемся за счет специального волоконно-оптического устройсгэа. По центральному волокну подается лазерное излучение с иЕггенсишюстыо 10 мВт, Так как диаметр волокна составляй 200 мкм, то плотность мощности получается достаточно высокой (30 Вт на 1 смг). Таким образом, плотность диагностического излучения меняется в зависимости от диаметра волокна от нескольких ватт на квадратный сантиметр до пятидесяти. Несмотря на гакую высокую ллошость мощности, каких-либо бо еаых ощущений при контакте с тканью не возникает, Эта мощность рассеивается в основном в объеме 1-2 мм1 биологической ткани. Соответственно информация о концентрации фотосенсиби-лнзатора в биологической ткани определяется из того же объема. Для определения степени оксигенации высокая чувсгвителъность достигается за счет увеличения расстояния между точками нхода света в биологическую ткань и выхода света из биологической ткани. Таким образом, увеличивается количество центров, участвующих в поглощении рассеянного внутри ткани света, Обычно нами используем расстояние между передающим и лриннмаюидом волокнами от 1 до Ї0 мм в зави-снмосги от кроне наполнен и ост и исследуемого органа. Другое решение згой проблемы заключайся в нспользонании широкою пучка света. В качестве источника спета для получения спектра обратного рассеяния ламп использую іся галогеновые лампы накаливания с эллиптическим отражателем в миниатюрном исполнении мощностью 10-20 Вт, При эндоскопических исследованиях в качестве источника света нами использовался стандартный осветитель эндоскопа, а роль волоконно-оптического катетера выполнял оптический канал эндоскопа.
В данном кратком обзоре остановимся только ка некоторых физических аспектах этого направления, где наши разработки методов и аппаратуры оказались наиболее эффективны, и приведен ссылки на работы тех исследователей и руководимых ими групп, которые внесли, по мнению автора, наиболее важный вклад [f-36] (курсивом помечены ссылки на публикации без участия автора) в развитие методов флуоресцентной диагностики и терапии, а также внесли большой вклад в понимание процессов и механизмов, происходящих при взаимодействии света с биологическими объектами, содеряаидими чувствительные к световому воздействию вещества.
Лечебные свойства солнечного света использовались еще в Древнем Египте, Индии, Кнтае и Древней Греции для лечения различных кожных заболеваний, таких как псориаз, рак. Основным преимуществом ФД по сравнению с компьютерной томографией и эдерБо-иагяйтным резонансом является то, что она лает возможность уандеть невидимые глазом клеточные образования, т.е. позволяет распознать злокачественною ткань на самой ранней Сталин развития.
Исследование распространения света с различной длиной волны в биологических тканях
Этот параметр имеет важное значение для ФДТ, так как он отражает, с одной стороны, скорость потребления кислорода а тканях и, следовательно, интенсивность фотодинамических реакции, а с другой стороны — степень разрушения капиллярного русла & лроцессе ФДТ,
В процессе лазерного облучения во время ФДТ скорость потребления кислорода может существенно возрасти из-за его взаимодействия с возбужденными молекулами ФС, перехода в синглетное состояние и последующего окисления компонентов гнани. Этот дополнительный раскод кислорода может существенно подавить степень оксигенацин кревл в микроциркуляторном русле. Пример изменения степени оксигенации гемоглобина в зависимости от плотности мощности лазерного облучения приведен на Риге. 1.8, 1. Впервые разработан метод измерения степени оксигевдции гемоглобина в живых биологических тканях, используя спектры обратного рассеяния, регистрируемые во время эндоскопического обследования пациентов, [р, 1,26] 2. Предложены новые спектроскопические методы количественной оценки концентрации нефлуоресцируюших ФС и степени окешеяации гемоглобина в биоло ітіческик тканях непосредственно во аремя облучения биологической ткаїш in vivo, [p. 1, 23] 3. Разработана оригинальная конструкция универсального волоконно-оптического спектрометра, позволяющего измерять одновременно спектры рассеяния и флуоресценции при лазерном облучении исследуемого биологического объекта [р, 12]г Одной ю проблем, возникающих при создании анализаторов изображений во флуоресцентпом свете, является проблема равномерного освещения биологической ткани. Освещение поверхности параллельным пучком лазерного света имеет тот недостаток, что поверхности органов или ксжи имеют неровности и участки с высоким коэффициентом отражения, что приводит к появлений теней н пятен блеска. Учитывая то, что некоторое количество возбуждающего света попадает в систему регистрации, на картине флуоресцентного изображения появляются темные и светлые участки, идентифицировать которые представляется весьма сложной задачей. С учетом этого нами была разработана конфокальная система освещения с концентрацией света на поверхности объекта, что позволило избавиться от теней и в большой степени от бликов. Другая немаловажная проблема это наличие у лазерных источников спекловой картины, что также затрудняет обработку изображений. Поэтому для анализа изображений поверхностных органов нами были выбрани в качестве источников света светодиоды с концентрацией светового потока. Прибор, который может применяться не только для диагностики, но и дня терапии, был нами разработан и активно используется в клиниках, для инграоперацион-ных ФД и ФДГ, а также дня лечения различных кожных заболеваний (Рис. 1 Устройство представляет собой мощный источник света (1000 мВт), который может обеспечить плотность энергии оптического излучения до 40 мВт/см3, Длина волны излучения источника может быть 630 или 675 нм. Прибор состоит из большого количества светодиодов, расположенных концентрическими кольцами на сферической поверхности так, что свет фокусируется в пятно диаметром около 8 см, В центре этой поверхности располагаются ПЗС-камера и дополнительные светодиоды ИК- и/или УФ-подсветкы_ При попадании красного света на ткань в месте накопления фотосенсибилтатора происходит его возбуждение, и он начинает светиться на длине ьошты флуоресценции. Далее изображение фильтруется системой светофильтров и формируется объективом на Ti3L "камере. ТЙС-кшера гджадает гнеоЬходимїт"чувствит льностїйї (0,05 люкс) ддя регистрации флуоресцентного света и получения флуоресцентного изображения биологической ткани. Это изображение может быть выведено на экран обычного телевизора и записано на видео. По флуоресцентной картине можно онре Рис. 1.9. . Устройство светодиодное видеофлуоресценгное УФФ-630/675-О1-БИОСПЕК; 1 Биологическая ткань. 2. Светоизпучаюшие диоды. 3-ПЗС-камера с системой фильтров. 4. Блок питаний и управления. 5. Изображение биологической ткани. 6. Персональный компьютер или монитор. 7. Корпус. делить места с наибольшей концентрацией фотосенснбилиэатора и, следовательно, выявить местоположение опухоли и определить зоны возможного метастазирования. Также возможен и вариант подключения устройства к компьютеру через соответствующую интерфейсную плату, что позволяет оцифровывать изображения и производить их математический анализ. Устройство может использоваться не только для диагностики, но и для проведения терапии, так как оно обладает достаточной интенсивностью света для возбуждения фотохимических реакций. К преимуществам устройства относится еш относительно невысокая стоимость, так как в нем не применяются дорогостоящие лазерные источники и сложные оптоволоконные системы. Применение светодиодов также существенно упрощает систему электропитания и систему охлаждения прибора и повышает его надежность.
Прибор имеет характеристики, позволяющие его использование при фотодинамической терапии с препаратом Фотосенс. Модификация с длиной волны излучения 630 нм используется для препаратов на основе производных гематопорфирина и 5-ALA (Аласенс).
Диагностика заболеваний обычно проводится в Несколько этапов: сначала врач проводит осмотр при естественном освещении (диагностика в естественном свете), чаще всего с помощью осветителя, затем осветитель выключается и включается устройство флуоресцентной диагностики. На данном этане врач может наблюдать только флуоресцентную картину. Для осмотра в естественном свете выявленных с помощью флуоресцентного метода патологий необходимо вновь включать осветитель и выкшочать диашостическое устройство, что создает дополнительные неудобства при работе.
Если патология расположена под верхним слоем исследуемой ткани, или находится на ранней стадии развития, она может бьчь не выражена на поверхности. Выявление такой патолотии возможно при проведении флуоресцентной диагностики. В этом случае врач, переключаясь на естественное освещение, сможет определить только примерное расположение патологического участка.
Метод оценки эффективности фотосенсибилизаторов с применением элементов крова
Разработана методика цифрового анализа изображений распространения света и флуоресценции, индуцированной этим светом в рассеивающих средах, эмулирующих реальные биологические ткани,
Установлено, что эффективная глубина проникновения излучения в модельный раствор свегодиодоа и мегаллогалоидного источника с длиной волны 405 нм составляет около 4,7 мм, с длиной волны 635 нм — 5,3 мм. При добавлении в раствор интралигтида ПП ГХ в концентрации 4 мг/л, за с ет эффекта поглощения глубина проникновения излучения уменьшается до 1,2 мм и 3,4 мм соответственно.
Эффективная глубина проникновения флуоресцентного света, как видно из графиков, ниже, чем глубина проникновения вызвавшего э1У флуоресценцию света, проходящего через раствор без протон орфирина. Добавление в раствор интралигтида протопорфирина приводит к уменьшению глубины проникновения света, при этом чем больше относительное перекрывание спектров поглощения растворов и спектров испускания источников света, тем меньше глубина проникновения падающего на образец света.
Одной ИЗ важнейшей задачей современной медицины является диагностика раннего рака и предраковых состоянии. Чаще всего опухолевый процесс начинается со слизистой оболочки какого-либо органа. Толшина пораженного слоя при раннем раке может составлять от нескольких микрометров до миллиметра, й ни оди / самый чувствительный прибор не может распознать заболевание. Поэтому задача определения концентрации опухолетропного фогосенсибилизагора в тонких слоя\ слизистой является весьма актуальной. Основной проблемой в определении концентрации ФС в тонких слоя является то обстоятельство, что зондирующее излучение, выходящее из оптического волокна, проходит слишком малый яуть (Рис. 2.6.) по исследуемой части пораженной ткани, прежде чем флуоресценция,. индуцированная этим излучением, достигнет приемных оптических волокон. Соответственно полезный сигнал часто бывает слишком мал для надежной постановки диагноза. Для выяснения этого вопроса была разработана экспериментальная схема, представлеиная на Рис.2,6, и были проведены соответствующие исследования для наиболее часто встречающихся в экспериментальной и клинической практике случаев. Ниже приводится один из характерных примеров исследования.
Мышечную ткань оборачивали в прозрачную тонкую пленку, помещали на нее тонкую (]б0 мкм) салфетку из нефлусресцирующей бумаги, и затем наливали раствор из Инграшгпцда с Фотосенсом. Таким образом, создавались тонкие слои от 160 до 800 микрометров.
На Рис. 2,7. показаны зависимости интенсивности флуоресценции, интенсивности рассеянного назад лазерною света и нормированной интенсивности флуоресценции от числа слоев дня разных расстояний от катетера до поверхности для угла 0 градусов. Из трафика А аадно, что интенсивность флуоресценции начинает расти при толщине 320 мкм (2 слоя) и достигает максимума при 800 мкм. При этом с увеличением суммарной толщины слоя увеличивается разница в значениях интенсивности в зависимости от расстояния до поверхности.
Этот эффект связан со специфичными геометрическими размерами волоконно-оптического катетера. Еще более непредсказуемо, на первый взгляд, ведет себя іра-фик В интенсивносгей рассеянного лазерного излучения. Но после нормировки картина ннтенсивностей флуоресценции С уже не имеет столь существенного разброса в зависимости от расстояния, хотя зависимость от числа слоев остается существенно нелинейной. Это обстоятельство, с одной стороны, существенным образом препятствует определению концентрации фотосенсибилизатора в пересчете на мм3, с другой стороны, при комплексном подходе эти зависимости можно использовать для оценки толщины исследуемого слоя, что очень важно для решения многих задач ранней онкологической диагностики. Из рисунка видно, что кривые графиков А и В имеют существенное различие в своем поведении. Однако при нормировке (график С) разброс в значениях существенно уменьшился и кривые приобрели линейный характер. Подобные исследования были проведены для углов от 0-60 с градацией 10 и для расстояний от 0-5 мм с градацией \ мм.
Лазерная флуоресцентная спектроскопия человека с применением фотосенсибилизаторов
Аегором совместно с Харнаоэм С.С- и Стратонниковым АА, разработана оригинальная методика оценки эффективности фотосеиснбил и затора по генерации сниглстного кислорода в культурах клеток [р. 26], [44]. Суть метода заключается в следующем, В культуру клеток добавляются эритроциты крорн ит тестируемый фо-тосенсиоилнзатор, далее проводится облучение длиной волны, соответствующей красному краю спектра поглощения фотосенснБилнзатора, и но спектру обратного рассеяния определяется динамика изменения степени оксигенанед гемоглобина, -находящеюся в эритроцитах. Этим самым мы оцениваем количество единиц синглетного кислорода, генерируемого на одну молекулу фогосенснбилизатора н на единицу поглощенной мощности. Параллельно проводится расчет живых и погибших клеток, кроме того, оценивается характер их гибели (некроз, аноптоз, окьоз). Из двадцати исследованных фотосенсибилязаторов наиболее активным оказался сульфированный фтаїюцианин алюминия и сульфированный фталоцианин цинка. Подобные исследования были проведены и из экспериментальных животных с прививными опухолями, которые также подтвердили полученные ранее результаты на культурах ткани.
Разработан оригинальный эффективный метол опенки механизма действия фо-тосенсибилнзаторов, позволяющий быстро и точно оценить перспективность веществ для их возможного использования в качестве фогосенсйбклшагоров [р 26] 3.3- Метод оценки эффективности фотосен си бнлн заторов в биологических тканях in vivo Дли исследования фотодинамической активности препарата ПХЕ6Ї использовались мыши (самиы) с привитой карциномой Эрлнха на одной из задних лап. Вес мышей составлял 25-23 г. Дозы введения составляли 20 мг/кг веса. Препараты вводились в хвостовую вену. Для оценки накопления измерялись спектры флуоресценции н поглощения препаратов в опухолевой и нормальной ткани животного. В качестве нормальной ткани не пользовалась другая лапа жнветноп). Измерения, проведенные через 1 час после ввеления препаратов, показали накопление ПХЕ61 в опухоли в концентрации 4,9 мгЛт, в нормальной ткани 1,3 мг/л, величина контраста накопления между олухолевой и нормальной тканью составила 3,8. Для ПХЕ62 величины накопления составили для опухоли 2,9 мг/л, для нормальной ткани Ї.1 мг/л, контраст 2,5. Облучение опухоли проводилось через 4 часа после введения препаратов. Для облучения использовался лазер с длиной волны А=670 им. Плотность мощности составляла 150 мВт/см", время облучения 10 мин. Плотность дозы саета, доставляе мой к опухоли, составляла 90 ДЇК/СМ2. Диаметр СІіетоиото пятна на поверхности кожи животного был равен 2,0 см, в то время как диаметры опухолей находились в диапазоне 1,0-1,5 см. Измерения, проведенные перед облучением (4 чзса после введении ГЇХЕ6Ї л ПХЕ62), показали накопление ГОСЕ61 в опуколи в концентрации 3,3 мг/л, в нормальной тканя 0,6 мг/л5 величина контраста накоги ення между опухолевой и нормальной тканью была равна 5,5. Для ПХЕ62 велич11-1 накопления составили для опухоли 353 мг/л, для нормальной ткани 0,7 мг/л, ко"1? Намерения, проведенные непосредственно после облучения, показали активное выгорание ГТХЕ6І и ЛХЕ62: концентрация ЇЇХЕ61 опухоли составляла 0,5 мг/л, а ПХЕ62- 0,6 мг/л. Результаты, полученные при анализе спектров флуоресценции, измеренных у Разработан оригинальный метод оценки эффект 18" " фотосенснбилизаторов, использующий комплекс слектральнык и спектра ЬН0 Л1ОМИНес1 ентнЬ1К методов исследования биотканей invivo[p23]. Точность метола позволяет использовать его до решения їдких тонких задач, как усовершенствование технологии синтеза фогоссцсибшшзаторов и контроля за их хранением. Глава 4. Особенности нссле/юяанин лагерно-инлуцнрованной флуоресценции патологических тканей различных органов Разработка оптоволоконной ннтроскопа для флуоресцентно» диагностики поверх постных и лриповерхностных патологических образований кожи Стандартная процедура ФД подразумевает облучите поверхности ткани и регистрацию флуоресценции с некоторого расстояния. Такой способ прост и легко осу верхности ткани, а в глубине, на некотором расстоянии от поверхностного слоя. В таком случае флуоресценция может быть зарегистрирована, но за счет эффекта рассеяния излучения в ткани флуоресцентное изображен це будет сильно «размыто» и на нем нельзя определить четкие границы поражения. Кроме того, если источник излучения будет находиться достаточно близко к поверхности ткани, возможно возникновение неравномерно облученной поверхности, что п свою очередь приведет к искажению реальной флуоресцентной каршны: флуоресценция интенсивнее там, где больше плотЕїость мощности излучения. До 70% падающего излучения может отражаться от исследуемой поверхности и попалать в устройство регистрации, что также затрудняет наблюдение флуоресценции.
Для устранения и уменьшения влияния на флуоресцентную картину данных факторов можно использовать другой принцип наблюдения флуоресценции. Можно экранировать поверхностно отраженное возбуждающее излучение от устройства регистрации, например проводить облучение вплетаю к ткани или разделить область возбуждения и область регистрации флуоресценции счетс-непроницаемой перегородкой. Это позволит удалить m области регистрации отраженное возбуждающее излучение высокой интенсивности Если области наблюдения и регистрации разнесены д пространстве, т.е. тиранены на разные площади поверхности, то наблюдается некоторая проекция вглубь ТКани3 глубина которой зависит от расстояния между областями наблюдения ц регистрации (Рис, 4.1).
Йнтраскоп предназначен для фотодишюическРЙ терапии и флуоресцентной диагностики злокачественных ново образований. Он включает в себя светодиодный и/или- лазерный источник света и модуль для контроля распределения интенсивности фи о сіадиит «a u of tt Aftb vvawapwwjcct кани. Данный модуль представляет собой два усеченных соосных конуса, вставленных с зазором друг в друга. В зазоре между конусами установлены источники света, а телевизионная камера со спекграпько-селектїівной оптической системой расположена в центре среднего конуса. В результате работы устройства излучение от источников света концентрируется на кольцевой поверхности ткани и за счет рассеяния проникает в глубину. Ка блВДение осуществляется на участке ткани, закрытой от попадания прямого падающего излучения, внутри среднего конуса.
Основным недостатком интраскопя является тоэ то даже при небольшом диаметре в вершине среднего конуса, а значит, и небольшой площади обследования, невозможно создать равномерную область освещения. Наибольшая плотность мощности излучения всегда будет находиться по краям внутреннего конуса.
В данной работе предлагается устройство, позволяющее решить задачи интра-скона, устранив присущие ему недостатки.
