Лазерно-индуцированная флуорисценция биологических тканей при импульсном ультрафиолетовом возбуждении Маслов Николай Анатольевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 23

1.1 Флуоресцентная диагностика 23

1.2. Влияние оптических свойств ткани на спектры ЛИФ 26

1.3. ЛИФ биологических тканей и веществ при УФ возбуждении 29

1.4. Изменение свойств ЛИФ биологических тканей под воздействием лазерного излучения 37

1.5. Заключение 40

Глава 2. Методы исследования 43

2.1. Многоканальная система регистрации спектров ЛИФ, возбуждаемой импульсными газоразрядными лазерами 43

2.2. Анализ спектров ЛИФ методом главных компонент 47

2.3. Система визуализации ЛИФ, возбуждаемой импульсными газоразрядными лазерами 53

2.4. Многоканальная система регистрации спектров ЛИФ с возможностью сканирования длины волны облучения в диапазоне 220-350 нм 56

2.5. Заключение 63

Глава 3. Спектральные особенности матриц возбуждения-эмиссии лазерно-индуцированной флуоресценции различных биологических веществ и тканей при УФ возбуждении 67

3.1. Введение 67

3.2. Особенности флуоресценции органических структур и биологических тканей при импульсном лазерном возбуждении 69

3.2.1. Исследование линейности флуоресценции и фотовыцветания бумаги при импульсном лазерном возбуждении 69

3.2.2. Исследование линейности флуоресценции и фотовыцветания триптофана при импульсном лазерном возбуждении 80

3.2.3. Исследование линейности флуоресценции и фотовыцветания тканей крысы при импульсном лазерном возбуждении 82

3.2.4. Исследование линейности флуоресценции бумаги и тканей крысы при возбуждении KRF эксимерным лазером 90

3.2.4. Обсуждение 92

3.3. Влияние облучения азотным и эксимерным KrF лазером на культуры клеток 97

3.4. Влияние лазерного облучения в области длин волн 210-350 нм на перевиваемые опухоли мышей и крыс 100

3.5. Влияние лазерного облучения на уровне органов 109

3.6. Особенностей матриц возбуждения-эмиссии флуоресценции биологических тканей 110

3.7. Особенности матриц возбуждения-эмиссии ЛИФ тканей глаза человека. 119

3.8. Заключение 126

Глава 4. Лазерная флуоресцентная спектроскопия минерализованных биологических тканей 129

4.1. Введение 129

4.2. Имеющийся задел 132

4.3. Поверхностное распределение интенсивности ЛИФ минерализованных тканей сердечно-сосудистой системы 139

4.4. Матрицы возбуждения-эмиссии ЛИФ костных тканей 142

4.4.1. Материалы и методы 142

4.4.2. Результаты и обсуждение 142

4.5. ЛИФ-спектроскопия твердых тканей зуба 150

4.4.1. Материалы и методы 150

4.4.2. Результаты и обсуждение 151

4.6. Заключение 155

Глава 5. Лазерная флуоресцентная спектроскопия ткани миокарда различной жизнеспособности 157

5.1. Введение 157

5.2. Имеющийся задел 159

5.3. ЛИФ-спектроскопия культур клеток различной жизнеспособности 170

5.3.1. Материалы 170

5.3.2 Методы 171

5.3.3. Результаты и обсуждение. 172

5.4. ЛИФ-спектроскопия донорского миокарда различной жизнеспособности 180

5.2.1. Материалы 180

5.2.2. Исследование ЛИФ погружённых в холодный физиологический раствор отдельных фрагментов миокарда свиньи в процессе хранения 181

5.2.3. Исследование ЛИФ отдельных фрагментов миокарда свиньи в процессе хранения в холодном физиологическом растворе с отмыванием 193

5.2.4. Исследование ЛИФ фрагментов миокарда свиньи после хранения целого сердца в холодном физиологическом растворе 202

5.2.5. Исследование изображений ЛИФ фрагментов миокарда крыс после хранения целого сердца в холодном физиологическом растворе 204

5.2.6. Обсуждение 206

5.5. Выводы 209

Глава 6. Лазерная флуоресцентная спектроскопия трансплантата аорты на различных биотехнологических этапах 210

6.1.Введение 210

6.2. Имеющийся задел 213

6.3. Динамика ЛИФ аорты человека в процессе хранения в холодном физиологическом растворе 217

6.3.1. Материалы и методы 217

6.3.2. Результаты и обсуждение 218

6.4. Исследование однородности ЛИФ аорты человека 220

6.4.1. Материалы и методы 220

6.4.2. Зависимость спектра ЛИФ аорты человека от ориентации образца 220

6.4.3. Зависимость спектра ЛИФ аорты человека от расстояния до фиброзного кольца 221

6.5. ЛИФ-спектроскопия аорты кролика на этапах получения ацеллюлярного гомографта 226

6.5.1. Материалы и методы 226

6.5.2. Зависимость спектра ЛИФ аорты кролика от расстояния до фиброзного кольца 229

6.5.3. Зависимость спектра ЛИФ аорты кролика от времени хранения образца в холодном физиологическом растворе 231

6.5.4. Влияние криосохранения на спектры ЛИФ ткани аорты кролика 234

6.5.5. Исследование графтов аорты кролика в процессе децеллюляризации 239

6.5.6. Обсуждение 243

6.6. ЛИФ-спектроскопия аорты человека на этапах получения ацеллюлярного гомографта 244

6.6.1. Материалы и методы 244

6.6.2. Результаты 246

6.6.3. Обсуждение 257

6.7. Выводы 259

Глава 7. Матрицы возбуждения-эмиссии лазерно-индуцированной флуоресценции нормальных и опухолевых клеток и тканей 260

7.1. Введение 260

7.2. ЛИФ здоровых и поражённых опухолями тканей лёгкого мыши 261

7.3. ЛИФ суспензии здоровых клеток селезёнки мыши и клеток опухоли 266

7.4. ЛИФ злокачественных глиом головного мозга человека 272

7.5. Аппаратный комплекс для интраоперационной диагностики границ злокачественной опухоли 279

7.6. Выводы 289

Заключение 290

Список литературы 295

• ЛИФ биологических тканей и веществ при УФ возбуждении
• Особенностей матриц возбуждения-эмиссии флуоресценции биологических тканей
• Исследование ЛИФ отдельных фрагментов миокарда свиньи в процессе хранения в холодном физиологическом растворе с отмыванием
• ЛИФ злокачественных глиом головного мозга человека

Введение к работе

Актуальность темы исследования

Сегодня многие перспективные исследования ведутся на стыке наук. В частности, создание новых методов медицинской диагностики происходит благодаря взаимодействию физики, химии, биологии и медицины. Многие процессы, происходящие в живом организме, физиологические или патологические, приводят к изменениям физико-химических свойств тканей, вариациям агрегатного состояния некоторых ее компонент, механическим превращениям. Регистрация подобных изменений физическими методами способна дать информацию о происходящих процессах, что, в частности, может использоваться и для медицинской диагностики. Примеры широко известны: магнитно-резонансная томография, рентгенография, ультразвуковые исследования.

В наши дни активно развиваются оптические методы медицинской диагностики, основное достоинство которых – возможность определять состояние тканей в реальном времени. Для этого могут использоваться рассеяние и поглощение света (спектральные измерения, оптическая когерентная томография, усиленное обратное рассеяние). Широко применяются флуоресцентные красители для исследований invitro и все активнее их применяют для интраопераци-онной диагностики. Например, мировое признание получил метод микрохирургического удаления злокачественных опухолей головного мозга,использующий для диагностики флуоресценцию метаболитов 5-аминолевулиновой кислоты (5-ALA), вводимой пациенту перед операцией.Продукты химических реакций, происходящих в организме с участием 5-ALA,с высокой избирательностью накапливаются в клетках злокачественных глиом и позволяют визуально определить границу опухоли. Однако обычно наблюдается флуоресценция низкой интенсивности, это приводит к необходимости проводить диагностику в темноте, что осложняет работу хирурга. Кроме того, не все опухоли активно метаболи-зируют 5-ALA и, соответственно, флуоресцируют. Поэтому поиск новых подходов в области интраоперационной оптической диагностики никогда не перестает быть актуальным.

Однако диагностические данные можно получать и без использования красителей, привнесенных извне, так как некоторые вещества, составляющие биологические ткани, имеют свойство флуоресцировать под воздействием излучения. По спектрам флуоресценции могут быть зарегистрированы любые превращения в тканях, сопровождающиеся разрушением или появлением флуоро-форов, изменением их физико-химического окружения, агрегатного состояния. Использование лазеров в качестве источников возбуждающего излучения, благодаря направленности и монохроматичности, позволяет производить измерения флуоресценции с высокой эффективностью и избирательностью.

Как правило, для исследования лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ) стараются применять видимое и ближнее инфракрасное излучение как наименее вредное и глубоко проникающее в ткань.В работах, основанных на-

ультрафиолетовом (УФ) излучении, в основном используют источники A-диапазона (315-400 нм), в единичных работах было использовано излучениеВ-диапазона (280-315 нм), излучение С-диапазона (менее 280 нм) практически не применяется.С использованием различных лазеров с длинами волн 337 нм и выше изучались пораженные раком ткани желудкаи пищевода (OsawaH.etal, JichiMedicalUniversity, Tochigi, Japan, 2014), толстой кишки (CodaS., Imperial-College, London, UK, 2014), матки (AlvarezL. etal, ColumbiaUniversity, NewYork, USA, 2007), груди (XyH. etal, UniversityofPennsylvania, Pennsylvania, USA, 2016),дыхательныхпутейилегких(WangM. еtal, ShanghaiEngineeringResearchCen-terofUltra-PrecisionOpticalManufacturing, Shanghai, China, 2017), мочевогопузыря (AboumarzoukO. etal, NinewellsHospitalandMedicalSchool, Dundee, UK, 2015), полостирта (YuvarajM. etal, AnnaUniversity, Chennai, India, 2014), головногомоз-га (ButteP.etal, Cedars-SinaiMedicalCenter, LosAngeles, USA, 2011), кожи (Draka-kiE. etal,NationalTechnicalUniversity, Athens, Greece, 2015). Существуютпубли-кации,посвящнныеЛИФдиагностикеатеросклерозасосудов (UghiG., Harvard-MedicalSchoolandMassachusettsGeneralHospital, Boston, USA, 2016).

Таким образом, метод обладает большими перспективами и в то же время существует множество актуальных нерешенных задач.В частности, возникает вопрос о возможности применения УФ излучения B и Cдиапазонов, поскольку-использование коротковолновых источников света за счет большей энергии кванта излучения потенциально позволяет наблюдать флуоресценцию от большего числа компонент, что может иметь значение для эффективности диагностики. В то же времяфлуоресценция, индуцированная излучением с длиной волны в пределах 200-330 нм, изучена мало и только для ограниченного круга задач, и ее применение может открыть новые перспективы в разработке методов диагностики патологических состояний организма. Для этого необходимо исследовать особенности использования данного диапазона длин волн для возбуждения флуоресценции биологических тканей: найти характерные для различных состояний спектральные полосы возбуждения и излучения, изучить-возможное повреждающее влияние возбуждающего лазерного излучения на исследуемые ткани.В качестве источника возбуждающего излучения могут быть использованы эксимерные лазеры: ArF (193 нм),KrCl (222 нм), KrF (248 нм), XeBr (282 нм), XeCl (308 нм), XeF (353 нм). Использование Nd:YAG лазера с умножителями частоты также позволяет работать в указанном диапазоне, а с помощью оптопараметрических преобразователей удается добиваться плавной перестройки длины волны в диапазоне 200-350 нм. При этом возникает возможность исследовать ЛИФ гораздо более детально с помощью матрицвозбуж-дения-эмиссии – зависимости спектра флуоресценции от длины волны возбуждающего излучения. Импульсный режим работы этих лазеров, с одной стороны, является преимуществом, поскольку позволяет получать высокое соотношение сигнал/шум даже в условиях сильной фоновой освещенности, а с другой – обуславливает необходимость новых исследований, поскольку известно, что на импульсное излучение живые клетки и ткани реагируют иначе, чем на непрерывное.

Также следует отметить, что при УФ возбуждении анализ спектров ЛИФ биологических тканей может представлять определенную сложность:спектры сплошные,их динамика при различных процессах может быть достаточно сложной и внешне противоречивой, поскольку,благодаря короткой длине волны лазерного излучения,в их формировании участвует множество флуорофо-ров, и спектры некоторых из них сильно зависят от окружения и не могут быть стандартизованы, а принадлежность других каким-то конкретным веществам на текущий момент установить не удатся.Для анализа подобных спектров применяют различные методы факторизации, среди которых наиболее перспективным представляется метод главных компонент. Он позволяет находить спектральные полосы, отвечающие за наблюдаемые различия спектров. Однако главные компоненты по построению представляют собой знакопеременные функции и их сложно сопоставлять со спектрами реальных флуорофоров, поэтому для более полноценного анализа спектров ЛИФ биологических тканей, в составе которых присутствуют неизвестные флуорофоры, метод нуждается в совершенствовании.

На основе знаний, полученных втакого рода исследованиях, возможно создание новых оптических методов, работающих в режиме реального времени, что, несомненно, является актуальной задачей в области медицинской диагно-стики.Эти методы могут найти применение в самых различных областях медицины.

Так, например, вофтальмологическойпрактикево время хирургического лечения катарактывозникает необходимость дифференцировки тканей по типу. Дело в том, что в капсульном мешке могут оставаться остатки эпителия капсулы хрусталика, регенерация которых приводит к помутнению стенки капсульного мешка и к развитию так называемой вторичной катаракты. Интраопераци-онное обнаружение с помощью ЛИФ оставшихся в капсульном мешке мелких фрагментов эпителия капсулы хрусталика может оказать существенную помощь в предотвращении рецидива болезни.

Поиск новых методов непрерывного мониторинга состояния тканей и органов, используемых для трансплантации, никогда не теряет свою актуальность. Кроме того, с развитием биотехнологий появился новый класс задач, связанный с контролем технологических этапов в процессе создания искусственных тканей и органов методами тканевой инженерии, например, для замещения поврежденных структур при хирургическом лечении дефектов крупных сосудов или приобретенных пороков клапанов сердца. Целью такого подхода является предотвращение гистонесовместимости имплантата и тканей реципиента, ведущей к отторжению имплантируемой структуры. Для этого донорская ткань децеллюляризируется, то есть из нее различными ферментами удаляются присутствующие в ней клетки. В результате остается только внеклеточный матрикс - строма, представленная эластичными волокнами. Параллельносозда-ются базовые клеточные линии из собственных клеток реципиента. Заселяя ими донорский внеклеточный матрикс, создается тканевая или органная конструкция, которая впоследствии может быть имплантированав организм пациента.

На каждом из этапов требуется вести контроль в режиме реального времени, и ЛИФ-диагностика может оказаться перспективной для решения этой задачи.

Метод регистрации и анализа спектров ЛИФ открывает возможность контроля состояния минерализованных тканей и перспективен для диагностики во время хирургических манипуляций на клапанном аппарате сердца, пораженного кальцинозом, а также для установления границы между интактной и пораженной кариесом зубной ткани. Возникает также вопрос о возможности ин-траоперационной диагностики остеопороза.

В сфере онкологии, несмотря на наличие множества публикаций по исследованию флуоресценции различных опухолей, проблема оптической диагностики новообразований далека от окончательного решения. Принятые в клиническую практику методы не всегда удобны и нуждаются в совершенствова-нии,и изучение возможности примененияУФ лазерного излучения для диагностики может быть использовано для поиска новых методов и подходов.

Цели и задачи исследования

Целью работы является разработка метода диагностикибиологических тканей с помощью измерения спектров ЛИФ, возбуждаемойУФ лазернымизлу-чениемв диапазоне длин волн 210-350 нм, и последующего анализа их флуоро-форного состава. Для ее достижения были поставлены следующие задачи.

1. Изучить общие особенности измерения ЛИФ различных биологических тканей при импульсномУФ возбуждении в диапазоне длин волн 210-350 нм: определить характерные спектры возбуждения и флуоресценции, повторяемость результатов, влияние импульсногоУФ лазерного излучения, используемого для измерений ЛИФ, непосредственно на динамику спектров ЛИФ исследуемых живых клеток и биологических тканей, а также их жизнеспособность, чтобы определить потенциальный вред и безопасные дозы облучения.

2. На основе полученных данных разработать методику анализа сплошных спектров ЛИФ биологических тканей.

Второй целью данной работы является изучение возможности применения разработанного метода для конкретных диагностических задач. Для ее достижения были поставлены следующие задачи.

3. Исследовать спектры ЛИФ капсульного мешка хрусталика глаза человека и эпителия капсулы хрусталика, чтобы определить возможность различать эти ткани по ходу операции и вовремя обнаруживать и удалять фрагменты эпителия, которые могут вызвать послеоперационные осложнения.

4. Проследить изменения ЛИФ аорты в процессе децеллюляризации, то есть удаления клеток, – первого биотехнологического этапа создания искусственной ткани, не обладающей антигенными свойствами в организме реципиента.

5. Оценить возможности применения ЛИФ вконтроле состояния минерализованных тканей: для диагностики во время хирургических манипуляций на клапанном аппарате сердца, пораженного кальцинозом; для установления

границы между интактной и пораженной кариесом зубной ткани; для ин-траоперационной диагностики остеопороза.

4. Изучить изменения ЛИФ, происходящие в процессе хранения донорских тканей сердца, используемых для пересадки реципиенту.

5. Исследовать возможности использования аутофлуоресценции, возбуждаемой УФ лазерным излучением, для определения здоровых и опухолевых клеток и тканей в эксперименте ив ходе нейрохирургических операций.

6. Разработать оптический прибор, позволяющий проводить интраоперацион-ную визуализацию микрохирургической картины и одновременную диагностику опухолевых тканей и клеток мозга по флуоресценции протопорфири-на IX.

Методы исследования

Для исследований ЛИФ в качестве источников возбуждающего излучения были использованы следующие типы лазеров, работающие в указанном выше перспективном для исследований ЛИФ диапазоне:

1. KrF эксимерный лазер с длиной волны излучения 248 нм, который эффективно возбуждает флуоресценцию белков;

2. азотный лазер, с длиной волны 337 нм для сравнения с ЛИФ, возбуждаемой излучением с большей длиной волны;

3. Nd:YAG лазер с оптопараметрическим преобразованием длины волны в диапазоне 210–350 нм, с его помощью исследовали матрицы возбуждения-эмиссии.

Регистрацию спектров ЛИФ осуществляли спектрометрами с дифракционной решткой и электронно-оптическим преобразователем или матричным прибором с зарядовой связью с разрешением 0,5 нм в диапазоне 280–700 нм.Полученные сплошные спектры сравнивали по форме путм нормировки на максимум. Также на основе естественных различий спектров различных образцов итеративным частичным методом наименьших квадратов вычисляли главные компоненты спектров. Из них составляли методом перебора линейные комбинации, соответствующие наименьшей ширине пика, и анализировали их вклады в спектр. Для сравнения групп образцов использовали дисперсионный анализ, при этом состояние биологических материалов определяли стандартными гистологическими и клиническими биохимическими методами и электронной микроскопией. Поверхностное распределение ЛИФ осуществляливи-деокамерами с интерференционными фильтрами.

Положения, выносимые на защиту

1. При импульсном ультрафиолетовом возбуждении лазерным излучением с длинами волн в диапазоне 210–300 нм, длительностью импульса менее 5 нс, плотностью энергии импульса до 10 мДж/см² интенсивность лазерно-индуцированной флуоресценции оптически протяжнных образцов биологических тканей зависит от энергии импульса нелинейно вследствие поглощения возбуждающего излучения нефлуоресцирующими соединениями, ог-

раничивающими глубину проникновения излучения в ткань и, соответственно, количество возбуждаемых флуорофоров.

2. Главные компоненты сплошных спектров лазерно-индуцированной флуоресценции биологических тканей, вычисленные нелинейным итеративным частичным методом наименьших квадратов на основе статистических различий спектров, при отсутствии реабсорбции флуоресценциисводимы приближнно к спектрам отдельных флуоресцирующих веществ составлением из них линейных комбинаций, соответствующих наибольшему отношению максимума спектра к его интегралу по всему измеряемому диапазону длин волн (пики минимальной возможной ширины).

3. Спектры ЛИФ тканей капсулы хрусталика, е эпителия и ядра хрусталика глаза человека в диапазоне длин волн возбуждения 210-290 нм содержат три основные спектральные полосы (пики минимальной возможной ширины по положению 2) с максимумами на длинах волн 303, 320 и 420 нм. Наибольшим образом спектры тканей различаются для длины волны возбуждения 210 нм, когда в спектре эпителия максимальный вклад дат первая компонента, в спектре ядра - вторая, капсулы - третья.

4. Спектры ЛИФ минерализованных тканей (кальцинированных сосудов и клапанов сердца, зубных тканей, губчатого вещества кости) при использовании лазерного излучения с длиной волны 248 нм содержат три основные спектральные полосы (пики минимальной возможной ширины по положению 2) с длинами волн максимумов 330, 380 и 460 нм, соответствующих белковой, эластичной и минеральной составляющим. Поражение кальцино-зом тканей сосудов и клапанов сердца приводит к появлению в спектре вклада минеральной компоненты; поражение кариесом зубной ткани сопровождается уменьшением вклада эластичной составляющей.

5. Спектры ЛИФ тканей и органов, используемых для трансплантации, при возбуждении излучением с длиной волны 248 нм обнаруживают следующую динамику:

в процессе хранения ткани миокарда свиньи в физиологическом растворе относительная интенсивность спектральной полосы 400-500 нм, уменьшается (в среднем на 30%),причм неоднородно (интерквартильный размах до 33%) внутри тканей сердца вследствие их неравномерной деградации;

у криосохраннных трансплантатов аорты кролика в спектре ЛИФ появляется полоса реабсорбции флуоресценции в области 380-450 нм вследствие пропитывания ткани кровью из сосудов неиссечнных участков адвентиции (внешней оболочки);

в биотехнологическом процессе децеллюляризации трансплантата аорты человека происходит уменьшение интенсивности спектральной полосы (пика минимальной возможной ширины по положению 2) с максимумом на длине волны 470 нм, по сравнению с пиком с максимумом на длине волны 375 нм (в среднем в 2,7 раза)

6. При использовании длин волн возбуждения 210–290 нм спектры ЛИФ ин-тактной и поражнной опухолью Льюиса ткани легкого мыши, интактной и поражнной метастазами опухоли Эрлиха селезнки мыши, здоровой и по-ражнной злокачественной глиомой ткани мозга человека отличаются в спектральной полосе 350–370 нм: у поражнных тканей в нормированных на максимум спектрах интенсивность в среднем выше (на 5–10% при использовании оптимального для выявления различий диапазона длин волн возбуждения 230–260 нм).

Степень достоверности

Достоверность первого защищаемого положения гарантируется совпадением в пределах экспериментального разброса (10%) измеренных кривых насыщения для различных типов биологических тканей с преимущественно трип-тофановой флуоресценцией, и аппроксимированных, исходя из двухкомпо-нентной модели. Применимость модели также подтверждает переход к линейному режиму у фотообесцвеченных образцов, изменение характера насыщения при уменьшении толщины образцов.

Достоверность второго защищаемого положения обеспечивается совпадением в модельном эксперименте спектров флуорофоров, измеренных непосредственно, и расчтных пиков минимальной возможной ширины со среднеквадратичным отклонением менее 6%. Для всех измеренных спектров биологических тканей аппроксимация пиками минимальной возможной ширины дает среднеквадратичное отклонение не более 2%.

Достоверность защищаемых положений 3–6 обеспечивается контролем стандартными гистологическими и клиническими биохимическими методами и электронной микроскопией. Обнаруженные различия между группами образцов подтверждены статистическим анализом (p< 0,05). В спектрах ЛИФ присутствуют компоненты, соответствующие известным флуорофорам: триптофану, тирозину, NADH, поперечным связям в коллагене. Характер спектров ЛИФ сосудов с учтом разницы длин волн возбуждения аналогичен данным, полученным при изучении атеросклероза с использованием лазеров с большими длин а-ми волн излучения (например, J. Baragaetal, 1990; L. Marcuetal, 2005).

Новизна полученных результатов

Впервые исследованы спектральные особенности матриц возбуждения-эмиссии ЛИФ различных типов биологических тканей для импульсного лазерного возбуждения УФ диапазона 210–350 нм и установлены общие закономерности формирования спектров и условия, необходимые для корректного их измерения.

Новизна первого защищаемого положения состоит в том, что выявлен, теоретически описан с помощью двухкомпонентной модели и экспериментально подтверждн механизм проявления нелинейных эффектов при возбуждении ЛИФ оптически протяжнных (толщина образцов 1–5 мм при характерной глубине поглощения излучения 50–100 мкм) биологических тканей низкоэнергети-

ческого (<10 мДж/см²) импульсного лазерного излучения в диапазоне длин волн 210–300 нм. В уже имевшихся исследованиях биологических тканей либо использовалось непрерывное излучение, либо при применении импульсных лазеров внимание уделялось только суммарной дозе поглощнного излучения для контроля возможных повреждений образца. Характер насыщения при этом отличается от результатов, известных для протяжнных газообразных сред, где применима однокомпонентная модель.

Новизна второго защищаемого положения состоит в том, что известный метод главных компонент впервые был адаптирован и экспериментально обоснован для представления спектров ЛИФ в виде суммы пиков минимальной возможной ширины: линейных комбинаций небольшого числа (2–4) главных компонент.

Новизна положений 3–6 и связанных с ними результатов исследований
обусловлена применением импульсных эксимерного KrFлазера с длиной волны
248 нм и тврдотельного лазера с длиной волны, перестраиваемой в диапазоне
210–300 нм, для измерения спектров ЛИФ тканей миокарда в процессе хране
ния, аорт в процессе криосохранения и децеллюляризации, структур глаза, ми
нерализованных тканей, здоровых и пораженных глиомой тканей мозга. Для
всех вышеперечисленных задач аутофлуоресценция ранее не изучалась, или для
возбуждения ЛИФ использовали лазеры с большей длиной волны. Получены
патенты на лазерные способы диагностики минерализации кости (№2244292,
11.02.2003), этапов биотехнологии децеллюляризации-

целлюляризациитканевых конструкций (№ 2343481, 09.08.2006).

На основе использованных в данной работе технологий разработаны: система с импульсно-периодической регистрацией флуоресценции протопорфири-на IX (патент № 2574793, 01.08.2013; №142307, 24.07.2013) для визуализации границ злокачественных опухолей в условиях стандартного освещения операционной; способ измерения полей температуры с помощью флуоресцирующих покрытий (патент №2607225, 23.03.2015).

Научная ценность полученных результатов

Ценность первого защищаемого положения заключается в том, что оно, во-первых, показывает и обосновывает необходимость контролировать линейность отклика в зависимости от энергии импульса при измерениях спектров ЛИФ с использованием импульсного лазерного излучения и, во-вторых, указывает значения параметров лазерного излучения, гарантирующих линейность отклика: для диапазона длин волн возбуждения 210–300 нм и длительностей импульса менее 5 нс плотность энергии не должна превышать 200 мкДж/см².

Как известно, спектры ЛИФ биологических тканей при отсутствии реаб-сорбции флуоресценции представляют собой линейные комбинации спектров присутствующих в образце флуорофоров, которые при УФ возбуждении могут сильно перекрываться, превращаясь в широкие полосы без явно выраженных особенностей. Проблема в том, что линейная регрессия к известным спектрам флуорофоров не всегда дат адекватный результат – при выполнении новых ис-

следований в образцах могут присутствовать неустановленные вещества, некоторые флуорофоры меняют свой спектр в зависимости от окружения. Разработанный по второму защищаемому положению метод представления спектров ЛИФ в виде линейных комбинаций главных компонент – пиков минимальной возможной ширины– существенно упрощает анализ спектров, так как для него не требуется заранее знать все флуоресцирующие в ткани вещества. Исходные главные компоненты, которые также используются и для анализа ЛИФ (например, F.Stelzleetal, 2013; L. Sordillo, 2013), представляют собой абстрактные функции, знакопеременные, дающие как положительный, так и отрицательный вклад в спектр, что невозможно для реальных флуорофоров.Существуют различные методы факторизации с неотрицательными спектрами, однако они могут также давать отрицательные вклады для компонент (C.Gobinet, 2004) или неоднозначный результат разложения, например, в зависимости от начальных условий при итерационном расчте (R. Neher, 2009). Вычисленные согласно второму защищаемому положению линейные комбинации главных компонент во всех проведнных экспериментах с точностью аппроксимации однозначны и вносят положительный вклад в спектры, а также имеют физический смысл – приближнно описывают сплошные спектры флуорофоров, присутствующих в образце.

Сформулированные в положениях 3–6 результаты получены при использовании длин волн возбуждения 210–300 нм и дают информацию о флуорофорах, не возбуждающихся излучением с большей длиной волны. При этом, несмотря на фототоксичность данного излучения, применнные в этой работе условия для измерений ЛИФ могут быть безопасно использованы. При дозах импульсного УФ лазерногооблучения менее 100 мДж/см² не выявлено повреждающего действия на биологический материал (на жизнеспособность, функционирование и спектральные свойства клеток и биологических тканей). Для получения информативных спектров на текущем техническом уровне достаточны дозы, меньшие на четыре порядка.

Практическая значимость полученных результатов

Относящиеся к третьему защищаемому положению различия спектров ЛИФ тканей глаза позволяют осуществлять интраоперационное обнаружение оставшихся в капсульном мешке мелких фрагментов эпителия капсулы хрусталика, которое сейчас не ведтся. Удаление фрагментов эпителия снижает риск развития вторичной катаракты.

Относящиеся к четвртому защищаемому положению результаты позволяют проводить ЛИФ диагностику фрагментов минерализованных тканей во время хирургических манипуляций на клапанном аппарате сердца, пораженном кальцинозом, осуществлять обратную связь во время лазерного удаления пора-жнных участков тканей. Сейчас единственным методом диагностики является ультразвуковое исследование, проводимое до операции. ЛИФ диагностика позволяет определять объм резекции тканей зуба и характер его лечения, сейчас для установления границы между здоровой и поражнной кариесом тканями

зуба существует набор традиционных методов, таких как электроодонтодиаг-ностика, дентальная рентгенография и т.д., однако они далеки от совершенства и/или не могут использоваться в процессе механической обработки ткани.

Для нижеперечисленных задач контроль может осуществляться гистохимическими методами, для которых требуется забор биопсийного материала и время: от десятков минут до нескольких часов. ЛИФ диагностика же дат информацию в режиме реального времени. Контроль процесса децеллюляризации с помощью ЛИФ при создании искусственных тканей и органов методами тканевой инженерии позволит получить из ткани донора оптимальный для заселения клетками реципиента внеклеточный матрикс. Для предварительного контроля жизнеспособности используемых для трансплантации органов существует оптический метод диагностики по флуоресценции NADH, однако, он дат информацию только о тканевом дыхании, которое не является определяющим фактором. Найденные в данной работе спектральные закономерности при хранении тканей коррелируют с результатами гистохимических исследований и являются дополнительным параметром для контроля исходного состояния донорских тканей.

Для интраоперационной диагностики злокачественных глиом головного мозга сейчас используется флуоресценция протопорфирина IX, однако в существующих системах наблюдать е приходится в темноте вследствие е слабой интенсивности. Разработанное устройство с импульсно-периодической системой регистрации и вычитанием фона позволяет производить визуализацию границ злокачественных опухолей при естественном освещении операционной и одновременно представляет микрохирургическую картину, что значительно повышает удобство диагностического метода, безопасность хирургического вмешательства и радикальность удаления опухоли в пределах здоровой ткани. Однако не все опухоли накапливают протопорфирин IX, и спектры аутофлуорес-ценции возбуждаемой УФ лазерным излучением являются дополнительным параметром для интраоперационного определения их границ и последующего удаления.

Апробациярезультатов

Основныерезультатыданнойработыбылипредставленыв 30

докладахнароссийскихимеждународныхконференциях (XXIX Congress of the ESCRS 2011;.ICMAR 2004, 2007, 2010; AMPL 2007, 2009; EORTC, EANO, ESMO Conference 2013; The 5th Russian-Japanese neurosurgical symposium 2016; New Technology in Integrative Medicine and Biology 2005, 2006; Taiwan-Russia Symposium on Methods of Mechanics for Physiology and Cell Biology 2013; Taiwan-Russia Bilateral Symposium on Mechanical Engineering 2011; Taiwan-Russia Symposium on Numerical and Experimental Modeling of Microprocesses and Its Application in Continuum Mechanics 2006; Laser Applications in Life Sciences 2007;.The Fifth international symposium Modren Problems of Laser Physics 2008; Advances in optics for biotechnology, medicine and surgery 2005; CLAPT 2009, 2015; Проблемымеханики: теория, экспериментиновыетехнологии 2009, 2012;

Теорияичисленныеметодырешенияобратныхинекорректныхзадач 2016; Высо-киетехнологии,

фундаментальныеиприкладныеисследованиявфизиологииимедицине 2010; Биотехнология 2003.).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 22 статьи в рецензируемых научных журналах (из них 15 в международных изданиях). По результатам работы получены 5 патентов. Прочие публикации – глава в монографии.

Внедрение результатов и предложения поих дальнейшему использованию

Полученные результаты были использованы для создания новых биотехнологических методов в ФГБУ “Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна” Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также для создания прибора для интраопе-рационной диагностики злокачественных новообразований в мозге человека в ЗАО “Новосибирский институт нейронаук” и используются в АО «Европейский медицинский центр» (Москва). Копии актов внедрения включены в Приложение к диссертации.

Личный вклад

Диссертация является обобщением исследований по развитию методов лазерной флуоресцентной диагностики, выполненных автором в ФГБУН «Институт теоретической и прикладной механики им. С.А. Христиановича Сибирского отделения Российской академии наук». Личный вклад автора состоит в разработке приведенных в диссертационной работе измерительных систем, алгоритмов и программного обеспечения. Автор лично проводил измерения спектров ЛИФ, обработку и анализ результатов. Подготовку образцов, контроль биологических и медицинских аспектов измерений выполняли коллективы ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л.Цивьяна» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ФГБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»», ФГБУН «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук».

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения и списка литературы. Диссертация занимает 327 страниц, содержит 224 иллюстрации и список из 275 литературных источников.

ЛИФ биологических тканей и веществ при УФ возбуждении

Как правило, для исследования ЛИФ используют видимое [52, 157, 216] или ближнее (315-380 нм) УФ [36, 43, 69, 126, 196, 200, 210, 213] излучение. Спектры ЛИФ биологических веществ, возбуждаемой излучением с длиной волны менее 310 нм, изучены мало. По имеющимся литературным данным у них можно выделить несколько характерных признаков. Так, флуоресценция биологических веществ обеспечивается в первую очередь за счет флуоресценции белков, содержащих аминокислоты триптофан и тирозин [238, 240, 243, 275]. Триптофан даже при невысоком содержании в белке в значительной степени определяет характер его спектра [51].

Флуоресценция триптофана возбуждается излучением с длиной волны в диапазоне 200-310нм и обусловлена электронными pp переходами в сопряженном индольном кольце. При этом наблюдается широкая бесструктурная полоса флуоресценции с максимумом шириной 60нм. Благодаря сильному взаимодействию возбуждаемого флуорофора со средой положение максимума полосы очень сильно зависит от его окружения. В зависимости от типа белковой молекулы, в которой находятся триптофановые остатки, от свойств окружающей её среды, например pH, спектр флуоресценции триптофана может сильно меняться, его максимум может находиться на длинах волн от 320 до 360 нм. При этом в белках могут одновременно присутствовать триптофановые остатки с различным положением максимума. На Рис. 1.2 представлен спектр кристаллического триптофана, полученный с помощью KrF эксимерного лазера, длина волны возбуждения 248 нм, максимум спектра флуоресценции приходится на 340 нм [252].

Тирозин возбуждается излучением в области 200-290нм и имеет довольно узкую полосу флуоресценции (34нм) с максимумом при 303-304нм (Рис. 1.2), определяющуюся pp переходом в бензольном кольце [238, 240]. С изменением pH спектр практически не меняется.

Фенилаланин также может флуоресцировать, однако имеет очень низкий молярный коэффициент поглощения, поэтому даже при сравнительно невысоком содержании триптофана и тирозина фенилаланиновая компонента в общем спектре белка обнаруживается лишь в редких случаях [238].

И действительно, существуют некоторые субстанции и ткани (Рис. 1.2), например, белок куриного яйца и мышечная ткань сердца свиньи, спектр которых, по-видимому, обусловлен флуоресценцией только триптофана и тирозина [252]. Причем тирозин ответственен за коротковолновую часть спектра (300-325нм), а триптофан – за длинноволновую часть (320-450нм). Отметим, что несмотря на подобие спектров белка яйца и мышечной ткани сердца (Рис. 1.2), интенсивность ЛИФ отличается примерно в два раза, что обусловлено различиями оптических свойств ткани, кроме того триптофан в белке не унифицирован по локализации и свойствам окружения, что в каждом конкретном случае создает свой набор физико-химических условий, которые оказывают влияние на его флуоресценцию [238].

Однако в общем случае флуоресценция биологических веществ гораздо богаче. Можно выделить группу спектров, например, у мышечной ткани и мышечной фасции коровы, аорты свиньи (Рис. 1.3), у которых также присутствует полоса с максимумом вблизи 330 нм, однако кроме ЛИФ аминокислот имеется и заметно более интенсивная, чем в предыдущем случае, флуоресценция в области 370-400нм. Кроме того, присутствует длинноволновая полоса 430-550 нм. Подобное поведение спектра, по-видимому, обусловлено в основном наличием в этих тканях волокнистых белковых структур, коллагена и эластина.

Коллаген — основной компонент соединительной ткани и самый распространённый белок у млекопитающих, составляющий от 25 % до 35 % белков во всём теле [46]. Название "коллаген" объединяет семейство близкородственных фибриллярных белков. Они составляют большую часть органической массы кожи, сухожилий, кровеносных сосудов, костей, надкостницы, зубов, роговицы и стекловидного тела глаз. Коллаген - ярко выраженный полиморфный белок. В настоящее время известно 19 типов коллагена, которые отличаются друг от друга по первичной структуре пептидных цепей, функциям и локализации в организме [270]. Коллаген синтезируется клетками соединительной ткани фибробластами и выделяется в межклеточное пространство, где он полимеризуется, образуя прочный долгоживущий материал. Мономеры коллагена представляют собой трехнитевые «тяжи», которые, связываясь друг с другом поперечными связями, образуют коллаген [173]. Флуоресценция коллагена и другого, сходного с ним, но более эластичного, широко распространенного в организме структурного белка эластина обусловлена именно поперечными связями между мономерами [173]. В коллагене известно два типа поперечных молекулярных групп – лизил пиридинолин и гидроксилизил пиридинолин. Оба соединения флуоресцируют, и максимум поглощения приходится приблизительно на 325 нм, а излучения - на 390 нм. Флуоресценция эластина объясняется наличием в нем триамино-трикарбоксильных производных пиридина с максимумом поглощения около 325 нм и флуоресценции - 405нм. Структуры коллагена и эластина сильно зависят от типа ткани. По всей видимости, помимо вышеперечисленных хромофоров в данных структурных белках присутствуют и другие, тканеспецифичные хромофоры, природа которых еще не изучена [173].

Таким образом, у спектров на Рис. 1.3 к триптофановой полосе с максимумом 330 нм добавляется полоса коллагена и эластина с максимумом 380 нм, простирающаяся в видимую область. Можно предположить, что спектральной полосе 450-550 нм соответствует ещё одна отдельная компонента. Однако исследования оптически тонкого (10mм) образца ткани аорты человека [13] показали, что в данном случае не существует отдельного флуорофора, отвечающего за максимум в длинноволновой области спектра. Оказалось, что существование пика обусловлено реабсорбцией флуоресценции с максимумом вблизи 418нм, связанным с поглощением в оксигемоглобине (Рис. 1.4), и, как следствие, провалом в этой области спектра. Это приводит к появлению отдельной полосы в районе 450 нм, тем не менее, связанной с полосой 380 нм [13, 12, 170, 171].

Особенностей матриц возбуждения-эмиссии флуоресценции биологических тканей

Как уже упоминалось ранее, как правило, для разработки лазерных флуоресцентных методов диагностики применяется видимое и ближнее инфракрасное излучение как наименее вредное и глубоко проникающее в ткань. Гораздо реже используется ультрафиолетовое излучение, при этом в большинстве опубликованных работ для возбуждения флуоресценции применяли лазеры с длиной волны больше 280 нм. Флуоресценция, индуцированная излучением с меньшей длиной волны, изучена мало, хотя использование коротковолновых источников света потенциально позволяет наблюдать флуоресценцию от большего числа компонентов. Проводили исследования с использованием эксимерных KrF лазеров (248 нм) [108, 142], Nd:YAG с генератором 4-й гармоники (266 нм) [115, 125, 164]. В более длинноволновом диапазоне обычно использовали эксимерные XeCl лазеры (308 нм) [107, 143, 228], или азотные лазеры (337 нм) [52, 65, 126]. Для получения матриц возбуждения флуоресценции, как правило, использовали спектрофлуориметры, в которых в качестве источника света используется Xe лампа и монохроматор, пропускающий достаточно широкую спектральную полосу [71, 110, 235].

В данном исследовании для выявления особенностей лазерно-индуцированной флуоресценции при использовании OPO лазера в диапазоне длин волны излучения 210-350 нм изучали спектры ЛИФ различных тканей мышей: мозга, сердца, печени, почек, скелетных мышц (бедро), лёгких, селезёнки и различных опухолей. Животных забивали мгновенной декапитацией, органы или ткани извлекали и помещали в физиологический раствор при температуре 4С. Измерения проводили в течение 2 часов. Образец ткани помещали на предметный столик (рис. 2.11). Сканируя длину волны возбуждения в пределах 210-350 нм с шагом 10 нм, измеряли спектры флуоресценции. Перед входной щелью спектрометра устанавливали фильтр, не пропускающий лазерное излучение во избежание повреждения детектора. В диапазоне 210-290 нм использовали бесцветный фильтр с УФ границей в 300 нм, в диапазоне 300-350 нм с границей в 390 нм. Во время одного измерения затвор спектрометра открывали на 2 с, включали лазер в импульсно-периодическом режиме. За время накопления сигнала лазер производил 7-8 импульсов. Энергия каждого импульса автоматически поддерживалась в пределах 200 мкДж. Каждый спектр сначала нормировали на чувствительность спектрометра, затем либо на полную энергию лазерного облучения за время выдержки, либо на максимум, для сравнения форм отдельных спектров, полученных при использовании одной и той же длины волны возбуждающего излучения. Измерения повторяли 5 раз, при этом в режиме реального времени с помощью созданного программного обеспечения контролировали линейность амплитуды флуоресценции в зависимости от полученной дозы излучения. Среднеквадратичное отклонение нормированных на дозу амплитуд не превышало 3%.

Типичная матрица возбуждения-излучения флуоресценции представлена на Рис. 3.41 в виде каскадной диаграммы: по оси абсцисс отложена длина волны флуоресценции, по оси ординат – относительная интенсивность флуоресценции, зависимость от длины волны возбуждения отражена сдвигом спектра по диагонали – каждый спектр соответствует своей длине волны возбуждения, от 210 до 350 нм с шагом 10 нм. В биологических тканях, состоящих из сложных органических молекул, благодаря большому числу перекрывающихся уровней, множеству процессов переноса энергии между хромофорами, в спектре флуоресценции невозможно различить отдельные колебательные линии, и спектры ЛИФ биологических веществ являются сплошными, то есть отдельные спектральные линии, характерные для определенных веществ, сливаются в спектральные полосы. При этом для каждого из флуорофоров (флуоресцирующих молекул или молекулярных групп) характерен свой спектр флуоресценции, который из-за быстрой колебательной релаксации возбуждённого состояния не зависит от длины волны возбуждения. В то же время квантовый выход флуоресценции зависит от длины волны лазерного излучения и каждый флуорофор имеет свою спектральную полосу возбуждения.

Из приведенного графика (Рис. 3.41) видно, что спектр ЛИФ биологической ткани зависит от длины волны возбуждения как по амплитуде, так и по форме. Это означает, что флуоресценция данной ткани определяется вкладами нескольких различных флуорофоров.

В спектрах ЛИФ, полученных при использовании диапазона длин волн возбуждения 210-290 нм, можно выделить три спектральных интервала, наиболее репрезентативной для этого является длина волны лазерного излучения в 250 нм (Рис. 3.42). Спектры нормированы на максимум, чтобы иметь возможность сравнивать их формы. В спектрах всех тканей доминирует пик с максимумом на длине волны 325 нм. В зависимости от типа ткани интенсивность плеча в диапазоне длин волн 350-370 нм может варьировать в диапазоне от 0,5 до 0,6 величины максимума, при этом как оставаясь постоянной для разных длин волн возбуждения (мозг), так и меняясь (лёгкое). Также можно идентифицировать различие спектральных полос в диапазонах 400-450 нм и 450-600 нм.

Для диапазона 300-310 нм характерны переходные спектры: главный максимум перестаёт возбуждаться. При дальнейшем увеличении длины волны возбуждения спектры перестают меняться по форме. Наиболее характерные спектры получаются для длины волны возбуждения 330 нм (Рис. 3.43). У большинства тканей спектры флуоресценции имеют выраженный максимум на длине волны 465 нм. У спектров лёгкого и печени максимум флуоресценции находится на длине волны 500 нм. У некоторых тканей (мышца бедра) присутствует выраженный пик на длине волны короче 400 нм, но его нельзя точно зафиксировать из-за применяемого защитного фильтра, отрезающего длины волн излучения менее 400 нм. В спектре лёгкого также имеется локальный максимум на длине волны 600 нм. Интенсивность ЛИФ селезенки была настолько мала, что для длин волн более 580 нм влияние рассеянного излучения из OPO системы было достаточно велико, поэтому на графике данный спектральный диапазон не представлен.

Исследование ЛИФ отдельных фрагментов миокарда свиньи в процессе хранения в холодном физиологическом растворе с отмыванием

Так как постоянное присутствие физраствора влияет на результаты измерений, в последующем перед каждым измерением раствор удаляли. Образец по-прежнему хранили в физиологическом растворе при температуре 4С в кювете из нержавеющей стали. При этом образец фиксировали на одном и том же месте, с помощью приспособлений, вмонтированных в кювету. Для проведения измерения спектра ЛИФ: физиологический раствор сливали, ополаскивали образец чистой порцией физраствора, измеряли спектр, после измерения заливали новой порцией физраствора.

На Рис. 5.34 – Рис. 5.45 представлены результаты ЛИФ спектроскопии двух из пяти образцов миокарда со стороны эпикарда и эндокарда. На Рис. 5.34, Рис. 5.37, Рис. 5.40 и Рис. 5.43 показаны спектры ЛИФ образцов в начале, в середине и в конце эксперимента, указано время хранения после забоя. Спектры нормированы на интенсивность флуоресценции с длиной волны 330 нм.

Для анализа спектров был применен метод главных компонент. Во всех экспериментах, все измеренные спектры хорошо описываются суммой двух или трёх компонент, представленных на Рис. 5.35, Рис. 5.38, Рис. 5.41 и Рис. 5.44 для каждой серии измерений соответственно. Относительные изменения вкладов главных компонент представлены на Рис. 5.36, Рис. 5.39, Рис. 5.42 и Рис. 5.45. Первая главная компонента описывает средний спектр для всех измерений соответствующей серии, а вторая и третья – различия между ними. Во всех измерениях вторая главная компонента обладает характерным пиком на длине волны 380 нм, что соответствует максимуму флуоресценции коллагена и эластина. Изменения спектра, измеренного со стороны эндокарда, достаточно малы, и при этом в различных экспериментах демонстрируют противоречивую динамику (Рис. 5.36 и Рис. 5.39).

Измерения спектра со стороны эпикарда более заметны, но также общей достоверной динамики не показали (Рис. 5.42 и Рис. 5.45). При этом исходные различия спектров существенно больше, чем изменения, возникающие в процессе хранения. Следовательно, регистрация ЛИФ со стороны наружной или внутренней оболочек сердца не может быть основой для надежного метода диагностики.

Достоверные изменения спектра ЛИФ были обнаружены при измерениях со среза миокарда (Рис. 5.46 – Рис. 5.51). На Рис. 5.46 и Рис. 5.49 показаны спектры ЛИФ образцов в начале, в середине и в конце эксперимента, указано время хранения после забоя. Спектры нормированы на интенсивность флуоресценции с длиной волны 330 нм. Также, как и в случае хранения погружённого в физиологический раствор образца, спектры состоят из двух полос и хорошо описываются суммой двух компонент, представленных на Рис. 5.47 и Рис. 5.50 для каждой серии измерений соответственно. Таким образом, наблюдаемые изменения спектра оптимально описывать с помощью интенсивности флуоресценции на длине волны максимума интенсивности второй главной компоненты, нормированной на максимум спектра (Рис. 5.48 и Рис. 5.51). У всех образцов характер изменений одинаков – интенсивность ЛИФ в полосе 400-500 нм с течением времени снижается. Однако, несмотря на то, что интенсивность этой полосы относительно максимума 330 нм сильно варьирует от образца к образцу, по мере снижения жизнеспособности она приходит к одной величине, равной 0,02 от главного максимума.

Поскольку у среза миокарда изменения в процессе хранения происходят в низкоинтенсивном длинноволновом плече, их достаточно сложно фиксировать. Для увеличения соотношения сигнал-шум интенсивность основного пика была понижена с помощью фильтра НС7, установленного перед входной щелью спектрометра и отрезающего коротковолновую часть спектра.

Аналогично измерениям без фильтра на Рис. 5.52 представлены спектры ЛИФ образцов в начале, в середине и в конце эксперимента. Спектры нормированы на интенсивность флуоресценции с длиной волны 420 нм. На Рис. 5.52а для сравнения приведён единичный спектр, измеренный без фильтра: в области выше 380 нм он совпадает с последовательно измеренным с применением фильтра спектром. На Рис. 5.52б приведён увеличенный фрагмент длинноволновой области спектра. Спектры описываются суммой двух компонент, представленных на Рис. 5.53. Поскольку у 2-й главной компоненты выраженный максимум в районе 450 нм, форму спектра можно также оценивать с помощью интенсивности излучения на длине волны 450 нм (Рис. 5.54), которая с течением времени падает.

Таким образом, суммируя представленные данные, можно утверждать, что для отдельных образцов миокарда при измерении спектра ЛИФ со стороны эндокарда и эпикарда в процессе хранения достоверная динамика не выявлена. При измерении со стороны среза в течение первых нескольких часов интенсивность флуоресценции в интервале длин волн 400-500 нм, нормированных на максимум спектров, снижается, а затем остается постоянной. Для различных образцов начальная интенсивность и скорость изменения спектра варьировали, однако динамика снижения интенсивности флуоресценции была сходной.

Чтобы оценить вариабельность и достоверность наблюдаемых изменений спектров ЛИФ при хранении целого сердца были проведены статистические исследования интенсивности полосы флуоресценции 450 нм в зависимости от сроков хранения. После заданного периода хранения миокард левого желудочка разделяли примерно на 40 фрагментов 10х10 мм, начиная от боковой стенки до межжелудочковой перегородки. У каждого фрагмента измеряли спектр ЛИФ возбуждаемой излучением эксимерного KrF лазера с длиной волны 248 нм. На Рис. 5.55 приведена диаграмма размаха для интенсивности полосы флуоресценции 450 нм в зависимости от времени хранения. На диаграмме квадратами представлены средние значения; ящиками представлены медиана, нижний и верхний квартили; усами – минимальное и максимальное значение выборки, крестами – выбросы.

В исходном состоянии существуют образцы, с любой интенсивностью полосы 400-500 нм в диапазоне 0,02-0,06. Однако с течением времени хранения максимум распределения смещается в сторону уменьшения интенсивности. Дисперсионный анализ (ANOVA) показал, что в среднем результат измерения через 0,5ч достоверно отличается от измерения через 4ч (F = 23,34, P = 0,0004) и через 5ч (F = 14,39, P = 1,0510-5). Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе хранения целого сердца для каждого из его фрагментов интенсивность данной полосы снижается. Однако в каждом сердце изначально присутствует неоднородность спектров, которая может быть связана с неоднородностью структуры ткани и с различной скоростью потери жизнеспособности. Например, в образце, хранившемся 0,5 часа, могут присутствовать уже омертвевшие участки, но их меньше, чем в образце, хранившемся 5 часов. И, наоборот, в образце, хранившемся длительное время, могут оставаться в небольшом количестве относительно жизнеспособные участки. Таким образом, деградация ткани происходит неравномерно, а по значению интенсивности полосы 400-500 нм можно судить о жизнеспособности различных участков миокарда.

ЛИФ злокачественных глиом головного мозга человека

Одной из основных причин смертности в экономически развитых странах являются онкологические заболевания. При этом лидирующее место в структуре нейроонкологической заболеваемости занимают злокачественные глиомы головного мозга (ЗГГМ), уступая только метастатическим опухолям. Заболеваемость ЗГГМ не имеет тенденций к снижению и продолжает расти. Несмотря на развитие и внедрение высокотехнологичных методов лечения этой патологии за последние 30 лет средняя продолжительность жизни больных с глиобластомой возросла всего лишь на 2 мес.! [204]

В современной нейроонкологической практике стандартом лечения ЗГГМ является комплексный мультидисциплинарный подход, включающий хирургическое удаление опухоли с последующим применением дополнительных методов лучевого и химиотерапевтического воздействия на опухоль. Показано, что радикальное удаление ЗГГМ приводит к лучшему восстановлению функций мозга [175, 174, 191] и увеличивает продолжительность жизни после операции и лечения [96] Неполное удаление опухолей, как правило, выливается в рецидивы. Сложность определения границы распространения злокачественных опухолей во время операции связана с особенностями их инвазивного роста, со способностью мигрировать и давать начало новой опухоли. Это часто приводит к неполному удалению новообразования, существенно снижая качество и продолжительность жизни пациентов. Определение границ распространения опухоли позволяет достичь наиболее полного ее удаления и снизить риск фатальных осложнений, которые могут возникать в ходе операции от механических повреждений сосудов и окружающей опухоль здоровой ткани.

Задачей данной работы было исследование возможности применения лазерных технологий для интраоперационной диагностики во время хирургического удаления ЗГГМ с использованием лазерно-индуцированной аутофлуоресценции клеток опухолей.

Материал для исследования был взят во время хирургических операций по удалению нейроглиомы, проводимых в ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина». Ткань удаленного фрагмента с визуально обнаруживаемым свечением протопорфирина-9, накапливающимся в опухолевых клетках под влиянием 5-аминолевулиновой кислоты, вводимой пациенту, рассматривали как опухоль. Периферические участки удаленного фрагмента без свечения протопорфирина-9, считали контролем.

Для исследования ЛИФ образцов тканей мозга человека использовали спектроскопический измерительный стенд с импульсно-периодическим лазером с оптопараметрическим преобразователем, позволяющим получать перестраиваемое лазерное излучение в диапазоне 210-355 нм (см. гл. 2). Спектры образцов регистрировали, устанавливая длину волны лазерного излучения в диапазоне 210-350 нм с шагом в 10 нм.

На Рис. 7.14 представлена типичная матрица возбуждения-эмиссии для образца ткани головного мозга человека, отражающая зависимость спектров флуоресценции от длины волны возбуждающего излучения. Спектры, полученные с использованием длин волн возбуждения 210-290 нм, представлены в спектральном диапазоне 300-580 нм (на входе в спектрометр мы использовали фильтр, отсекающий излучение с длиной волны короче 300 нм, чтобы избежать повреждения матрицы спектрометра рассеянным лазерным излучением; выше 580 нм наблюдается второй порядок дифракционной решётки). Спектры, полученные с использованием длин волн возбуждения 210-290 нм, представлены в спектральном диапазоне 400-800 нм (на входе в спектрометр мы использовали фильтр, отсекающий излучение с длиной волны короче 400 нм). Матрицы нормированы на максимальную интенсивность флуоресценции и представлены в виде каскадной диаграммы: по оси абсцисс отложена длина волны флуоресценции, по оси ординат – относительная интенсивность флуоресценции, зависимость от длины волны возбуждения отражена сдвигом спектра по диагонали. Каждый спектр соответствует своей длине волны возбуждения, от 210 до 350 нм с шагом 10 нм.

Как уже упоминалось ранее (см. гл. 3), без учёта реабсорбции флуоресценции в матрице возбуждения-излучения ЛИФ биологической ткани каждый спектр флуоресценции представляет собой сумму независящих от длины волны возбуждения спектров различных флуорофоров. Для любой длины волны лазерного излучения вклад каждого флуорофора в общий спектр определяется его концентрацией и спектром возбуждения. Соответственно, для анализа матрицы удобно находить пики, общие для спектров ЛИФ, возбуждаемой различным излучением, а, значит, принадлежащие конкретному флуорофору.

В диапазоне сканирования длин волн возбуждения 210-300 нм основной вклад в спектр флуоресценции образцов даёт пик с максимумом интенсивности на длине волны 320 нм, обусловленного флуоресценцией триптофана. Наибольшая интенсивность этого пика зарегистрирована у всех образцов при использовании лазерного излучения с длиной волны 290 нм. Абсолютные измерения интенсивности не проводили, потому что геометрия сбора излучения с различных образцов трудно контролируема. Все матрицы возбуждения-эмиссии нормировали на величину данного пика – для удобства сравнения эффективности возбуждения флуоресценции излучением с различными длинами волн.

У различных образцов длинноволновое плечо основного пика в области длин волн 320-400 нм может различаться по интенсивности (Рис. 7.15). Максимальным образом у различных образцов интенсивность различается на длине волны флуоресценции 350 нм. Это может быть связано, как с особенностями флуоресценции триптофана, поскольку его спектр зависит от его молекулярного окружения, так и с наличием неизвестного дополнительного флуорофора, максимум интенсивности флуоресценции которого находится около 350 нм.

Также наблюдается наличие независимой полосы флуоресценции в области 420-580 нм (Рис. 7.16), с максимальным различием между образцами на длине волны 430 нм. Из известных флуорофоров в данном диапазоне спектра (420-580 нм) флуоресцирует NADH, однако, максимум интенсивности его флуоресценции приходится на 470 нм, а, значит, он не может полностью отвечать за наблюдаемые спектральные различия.

В диапазоне сканирования длин волн возбуждения 310-350 нм наблюдается флуоресценция, по крайней мере, трех независимых компонент, с максимумами излучения на длинах волн 440 и 465 нм, широкой полосой 500-600 нм (Рис. 7.17 и Рис. 7.18). Наличие второго пика (465 нм), скорее всего, связано с наличием в ткани NADH. Природа остальных пиков требует дополнительного изучения.

Описанные выше спектральные особенности наблюдаются как у поражённых опухолями, так и у контрольных образцов. Поскольку опухоли имели разную локализацию в мозге, возможно, что для различных отделов мозга характерна своя спектральная картина. К тому же, скорее всего, контрольные образцы нельзя считать полностью интактными, поскольку они брались на периферии опухоли, которую, как предполагается, удаляли в пределах здоровой ткани. В пользу такого допущения также говорит тот факт, что у некоторых контрольных образцов имела место флуоресценция протопорфирина IX, который накапливается в опухолевых клетках под воздействием 5-аминолевулиновой кислоты, вводимой пациенту для визуализации опухоли. Таким образом, только сравнивая «контрольный» и поражённый опухолью образцы, полученные от одного пациента и пространственно расположенные близко друг к другу, можно утверждать, что «контрольный образец» претерпел меньшие изменения.

Всего было исследовано 15 пар образцов. Из всей совокупности данных можно выделить следующие независимые закономерности, в которых различия контрольных и опухолевых образцов проявляются наиболее сильно. Для оценки достоверности наблюдаемых изменений использовали t-критерий Стьюдента для зависимых выборок.

1. При возбуждении лазерным излучением с длиной волны 260 нм и нормировке спектра на максимум, у опухолевых образцов интенсивность на длине волны 350 нм в среднем выше (p=0,009), чем у контрольных образцов (Рис. 7.15).

2. При возбуждении лазерным излучением с длиной волны 260 нм, при нормировке спектра на максимум, у опухолевых образцов интенсивность на длине волны 450 нм в среднем выше (p=0,028), чем у контрольных образцов (Рис. 7.16).

3. У нормированных матриц возбуждения-эмиссии при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 320 нм у опухолевых образцов интенсивность флуоресценции на длине волны 465 нм в среднем выше (p=0,038), чем у контрольных образцов (Рис. 7.17).

4. При возбуждении лазерным излучением с длиной волны 260 нм и нормировке спектра на максимум, у опухолевых образцов обнаружена тенденция (p=0,078) к снижению интенсивности флуоресценции на длине волны 575 нм (Рис. 7.18).

Первое отличие может быть связано с различным метаболическим воздействием среды на флуоресценцию триптофана или с изменением вклада неизвестного флуорофора. Отличия 2-4 могут быть частично обусловлены ускоренным метаболизмом и соответственно с повышенным накоплением NADH в опухолевых клетках в результате гипоксии после резекции ткани. Однако наблюдаемая картина не может объясняться только этим одним фактором.