Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Литературный обзор 15
1.1 Полупроводниковые квантовые точки как донор энергии в комплексах с тетрапиррольными молекулами для фотодинамической терапии 15
1.1.1 Полупроводниковые квантовые точки. Спектральные и фотофизические свойства 15
1.1.1 Тетрапиррольные соединения. Спектральные и фотофизические свойства 17
1.2 Типы связывания комплексов КТ-тетрапиррольные молекулы 20
1.2.1 Ковалентное связывание 21
1.2.2 Электростатическое взаимодействие 21
1.2.3 Координационное связывание 23
1.3 Спектрально-люминесцентные проявления комплексообразования между КТ и ТМ 24
1.3.1 Влияние комплексообразования на спектры поглощения и фотолюминесценции квантовых точек и тетрапиррольных молекул 25
1.3.2 Тушение фотолюминесценции КТ в комплексах с тетрапиррольными молекулами: концентрационная зависимость и механизмы тушения 26
1.4 Физические механизмы тушение фотолюминесценции КТ в комплексах с
тетрапиррольными молекулами 29
1.4.1 FRET. Эффективность передачи энергии. Основные доказательства передачи энергии: сенсибилизированная фотолюминесценция, генерация синглетного кислорода 30
1.4.2 Фотоперенос электрона 35
1.4.3 Формирование центров рекомбинации в местах присоединения молекул к КТ 36
1.4.4 Тушение фотолюминесценции молекул в комплексах с КТ 36 1.4.4 Агрегация ТМ в комплексе с КТ 37
1.4.5 Агрегация КТ в комплексе с ТМ 38
1.5 Биологическое применение КТ и комплексов КТ/ТМ для ФДТ 40
1.5.1 Применение КТ в качестве фотосенсибилизаторов в ФДТ 40
1.5.2 Основные требования к комплексам КТ/ТМ как фотосенсибилизаторам для ФДТ 42
1.5.3 Комплексы КТ/ТМ для ФДТ 44
ГЛАВА 2 Методическая часть 47
2.1 Материалы и методы исследования 47
2.1.1 Материалы 47
2.1.2 Методы модификации КТ и ТМ 48
2.1.3 Методы спектрально-люминесцентного и микроскопического анализа комплексов в растворах 49
2.1.4 Характеристики полупроводниковых квантовых точек 51
2.1.5 Характеристики тетрапиррольных молекул 53
2.2 Формирование комплексов на основе квантовых точек и тетрапиррольных молекул 55
2.2.1 Формирование комплексов в результате электростатического взаимодействия в растворах 55
2.2.2 Формирование комплексов в результате координационного связывания в растворах 56
2.3 Методы исследования комплексов в биологических средах 57
2.3.1 Методы спектрально-люминесцентного исследования комплексов в плазме крови человека 57
2.3.2 Методы исследования фотоиндуцированной цитотоксичности комплексов в клетках Асцитной Карциномы Эрлиха 58
ГЛАВА 3 Оптические свойства и эффективность переноса энергии в комплексах молекул Al(OH)-сульфофталоцианина и полупроводниковых квантовых точек 64
3.1 Влияние агрегации молекул Al(OH)-сульфофталоцианина в комплексах с CdSe/ZnS квантовыми точками на люминесцентные свойства комплексов 65
3.1.1 Спектрально-люминесцентные свойства смесей катионных CdSe/ZnS КТ и ФЦ 67
3.1.2 Анализ тушения фотолюминесценции катионных CdSe/ZnS КТ в смеси с ФЦ 69
3.1.3 Анализ фотолюминесценции ФЦ в смеси с катионными CdSe/ZnS КТ 72
3.1.4 Эффективность переноса энергии в комплексах катионных CdSe/ZnS КТ/ФЦ 74
3.1.5 Спектральные проявления агрегации молекул ФЦ в комплексах с катионными CdSe/ZnS КТ 75
3.1.6 Физическая модель образования гетерогенной системы комплексов квантовая точка/органическая молекула 78
3.1.7 Влияние степени сульфирования ФЦ на агрегацию молекул в комплексах с катионными CdSe/ZnS КТ 89
3.2 Влияние типа связывания компонентов комплексов на агрегацию молекул Al(OH)-сульфофталоцианина в комплексах с CdTe квантовыми точками 92
3.2.1 Спектрально-люминесцентные свойства смесей анионных CdTe КТ и ФЦ 93
3.2.2 Анализ тушения фотолюминесценции анионных CdTe КТ в смеси с ФЦ 98
3.2.3 Определение константы комплексообразования комплексов анионных CdTe КТ/ФЦ в щелочном растворе
3.2.5 Эффективность переноса энергии в комплексах анионных CdTe КТ/ФЦ 109
3.2.6 Временная устойчивость комплексов CdTe КТ/ФЦ в щелочной среде 110
3.3 Выводы по главе 111
ГЛАВА 4 Оптические свойства и эффективность переноса энергии в комплексах молекул хлорина е6 и полупроводниковых квантовых точек 114
4.1 Люминесцентные свойства комплексов CdSe/ZnS и ZnSe/ZnS квантовых точек с хлорином е6 114
4.1.1 Спектрально-люминесцентные свойства смесей катионных CdSe/ZnS и ZnSe/ZnS КТ с Хл е6 116
4.1.2 Анализ спектров поглощения Хл е6 в смесях с катионными CdSe/ZnS и ZnSe/ZnS КТ 118
4.1.3 Анализ тушения фотолюминесценции катионных CdSe/ZnS и ZnSe/ZnS КТ в смесях с Хл е6 119
4.1.4 Эффективность переноса энергии в комплексах катионных CdSe/ZnS и ZnSe/ZnS КТ/Хл е6 121
4.2 Выводы по главе 126
ГЛАВА 5 Комплексы полупроводниковых квантовых точек и тетрапиррольных молекул в биологических средах 128
5.1 Оптические свойства и эффективность переноса энергии в комплексах одноименно заряженных молекул Al(OH)-сульфофталоцианина и полупроводниковых квантовых точек в плазме крови человека 129
5.1.1 Люминесцентные свойства комплексов анионных CdTe КТ и ФЦ в плазме крови человека 130
5.1.2 Эффективность переноса энергии в комплексах анионных CdTe КТ и ФЦ в плазме крови человека 133
5.2 In-vitro исследование фотоиндуцированной цитотоксичности комплексов ZnSe/ZnS КТ/Хл е6 135
5.2.1 Исследование внутриклеточного проникновения комплексов ZnSe/ZnS КТ/Хл е6 138
5.2.2 Исследование переноса энергии фотовозбуждения от ZnSe/ZnS КТ к Хл е6 в клетках АКЭ 141
5.3 Выводы по главе 145
Заключение 146
Список сокращений 148
Список литературы
- Полупроводниковые квантовые точки. Спектральные и фотофизические свойства
- Методы спектрально-люминесцентного и микроскопического анализа комплексов в растворах
- Спектральные проявления агрегации молекул ФЦ в комплексах с катионными CdSe/ZnS КТ
- Анализ тушения фотолюминесценции катионных CdSe/ZnS и ZnSe/ZnS КТ в смесях с Хл е6
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время большой научный интерес представляет создание
и исследование гибридных структур с уникальными характеристиками,
возникающими в результате комбинирования свойств полупроводниковых
наночастиц и органических молекул. В частности, в последнее десятилетие
интенсивно ведутся работы по созданию и исследованию свойств
комплексов коллоидных полупроводниковых квантовых точек (КТ) c
органическими соединениями. Благодаря своим уникальным оптическим
свойствам, таким как: высокая поглощательная способность, высокий
квантовый выход фотолюминесценции (ФЛ), КТ могут выступать в
качестве высокоэффективного донора энергии в комплексах с
органическими молекулами. Тетрапиррольные молекулы (ТМ) занимают
особое место среди органических молекул, поскольку в них сочетается
способность эффективно генерировать синглетный кислород и
концентрироваться в пораженных тканях. Соединения тетрапиррольного ряда широко используются в диагностике и терапии онкологических заболеваний.
Использование КТ в качестве донора энергии в комплексах с
тетрапиррольными молекулами кардинально расширяет спектральный
диапазон возбуждающего излучения молекул, а эффективный
внутрикомплексный перенос энергии фотовозбуждения по механизму Ферстеровского резонансного переноса (FRET) от КТ к молекулам позволяет значительно увеличить эффективность генерации синглетного кислорода. Кроме того, КТ потенциально могут выступать в качестве агентов доставки, увеличивая внутриклеточное проникновение молекул фотосенсибилизаторов. Данная работа посвящена исследованию условий формирования комплексов коллоидных водорастворимых квантовых точек полупроводников группы А2В6 с молекулами тетрапиррольного ряда и физических процессов в них в водных и биологических средах.
Несмотря на интенсивное изучение комплексов КТ и ТМ, до сих пор остаются неясными многие вопросы, связанные как с процессами внутрикомплексной миграции энергии фотовозбуждения, так и с аспектами функционирования подобных комплексов в биологических средах.
Очевидно, что установление основных физических закономерностей формирования и функционирования подобных комплексов как в водных растворах, так и в биологических средах, является необходимым для их практического применения.
Целью работы является установление закономерностей
формирования комплексов водорастворимых коллоидных квантовых точек
полупроводников группы А2В6 с соединениями тетрапиррольного ряда и фотофизических процессов в них.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Исследовать условия формирования комплексов молекул Al(OH)-сульфофталоцианина (ФЦ) и хлорина е6 (Хл е6) c полупроводниковыми квантовыми точками в водных растворах.
-
Исследовать оптические свойства и экспериментальные проявления переноса энергии в комплексах молекул Al(OH)-сульфофталоцианина и хлорина е6 с полупроводниковыми квантовыми точками в водных растворах.
-
Исследовать фотофизические свойства комплексов полупроводниковых квантовых точек и тетрапиррольных молекул в биологических средах.
На публичную защиту выносятся следующие положения:
-
Молекулы Al(OH)-сульфофталоцианина в комплексах с катионными полупроводниковыми квантовыми точками могут образовывать нелюминесцирующие агрегаты, что приводит к уменьшению квантового выхода фотолюминесценции молекул и эффективности внутрикомплексного переноса энергии.
-
В комплексах анионных полупроводниковых квантовых точек агрегации молекул Al(OH)-сульфофталоцианина не происходит, поэтому квантовый выход фотолюминесценции Al(OH)-сульфофталоцианина не зависит от его концентрации, а эффективность внутрикомплексного переноса энергии близка к теоретическому значению.
-
В водных растворах катионные квантовые точки в комплексах с молекулами хлорина е6 образуют агрегаты, что приводит к уменьшению эффективности внутрикомплексного переноса энергии от квантовых точек к молекулам.
-
В плазме крови человека и в живых клетках асцитной карциномы Эрлиха, образование агрегатов в комплексах квантовых точек полупроводников А2В6 не происходит, что позволяет реализовать высокоэффективный перенос энергии фотовозбуждения от квантовых точек к молекулам Al(OH)-сульфофталоцианина и хлорина е6.
Научная новизна работы
1. Экспериментально установлено, что в комплексах катионных
коллоидных квантовых точек CdSe/ZnS с противоположно заряженными
молекулами Al(OH)-сульфофталоцианина могут образовываться
нелюминесцирующие агрегаты молекул. Показано, что увеличение
концентрации агрегатов молекул приводит к уменьшению квантового
выхода фотолюминесценции Al(OH)-сульфофталоцианина и
эффективности внутрикомплексного переноса энергии.
-
Предложена модель образования комплексов катионных квантовых точек с противоположно заряженными молекулами, описывающая зависимости квантового выхода фотолюминесценции молекул и эффективности внутрикомплексного переноса энергии от концентрации нелюминесцирующих агрегатов молекул.
-
В комплексах анионных CdTe квантовых точек с одноименно заряженными молекулами Al(OH)-сульфофталоцианина реализован перенос энергии фотовозбуждения от КТ к молекулам, эффективность которого близка к теоретически возможной для данной донорно-акцепторной пары, поскольку в этих комплексах не происходит образования нелюминесцирующих агрегатов молекул.
-
Предложена модель образования комплексов между одноименно заряженными КТ и молекулами, согласно которой молекулы образуют координационную связь с молекулами солюбилизатора на поверхности КТ, хорошо описывающая спектрально-люминесцентные свойства комплексов анионных CdTe квантовых точек с молекулами Al(OH)-сульфофталоцианина.
-
Показано, что в комплексах катионных квантовых точек CdSe/ZnS и ZnSe/ZnS с молекулами хлорина е6 в водных растворах происходит агрегация КТ, которая приводит к уменьшению эффективности переноса энергии от КТ к молекулам хлорина е6.
-
Показано, что в плазме крови человека комплексы анионных квантовых точек CdTe с молекулами Al(OH)-сульфофталоцианина стабильны и сохраняют свои фотолюминесцентные свойства.
-
Получено двукратное увеличение фотодинамического эффекта в живых клетках карциномы Эрлиха при использовании комплексов катионных ZnSe/ZnS квантовых точек с молекулами хлорина е6. Показано, что улучшение функциональности традиционного фотосенсибилизатора, хлорина е6, достигается за счет эффективного переноса энергии фотовозбуждения от квантовых точек к молекулам и увеличения эффективности внутриклеточного проникновения.
Основные методы исследования
Для решения поставленных задач в работе были исследованы стационарные и кинетические люминесцентные свойства комплексов коллоидных квантовых точек полупроводников группы А2В6 с соединениями тетрапиррольного ряда в водных растворах и плазме крови человека с использованием современных спектрально-люминесцентных стационарных и кинетических методов. In-vitro эксперименты по
исследованию кинетики накопления комплексов в живых клетках асцитной карциномы Эрлиха проводились с использованием методов конфокальной люминесцентной спектроскопии. In-vitro-эксперименты по исследованию фотоиндуцированных и темновых процессов, вызванных в клетках комплексами, были проведены методом оценки выживаемости клеток по степени окрашивания красителем трипановым синим.
Практическая ценность диссертационной работы определяется тем,
что разработка новых наноматериалов и систем, которые могли бы
значительно усилить воздействие органических молекул, традиционно
применяемых в биомедицине в качестве лекарственных средств, является
важнейшей задачей современной физики наноструктур. Это обусловлено
тем, что получение фундаментальных знаний о физических механизмах,
отвечающих за эффективность функционирования данных комплексов в
качестве фотосенсибилизаторов, позволит вывести в будущем
эффективность диагностики и терапии онкологических заболеваний на принципиально новый уровень.
Результаты диссертационной работы использованы и используются в
Университете ИТМО при выполнении проектов в рамках государственных
контрактов, грантов РФФИ и Правительства Санкт-Петербурга,
аналитических ведомственных программ Министерства образования и науки РФ.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры оптической физики и современного естествознания Университета ИТМО при подготовке студентов по двум профилям 200700 «Оптика Наноструктур» и «Физика наноструктур».
Публикации и апробация работы
Основные результаты работы докладывались и обсуждались на семинарах Университета ИТМО, а также на международных и всероссийских конференциях:
-
ANM 2015, Авейру, Португалия;
-
ICNFA 2015, Барселона, Испания, 2015;
-
SPIE Biomedical Optics 2015, Мюнхен, Германия, 2015;
-
IV Всероссийский конгресс молодых ученых, Санкт-Петербург, Россия, 2015;
-
III конференция молодых ученых и специалистов «Будущее оптики-2015», Санкт-Петербург, Россия, 2015;
-
NANOCON 2015, Брно, Чехия, 2014;
-
VIII международная конференция «Фундаментальные проблемы оптики-2014», Санкт-Петербург, Россия, 2014;
-
iNOW International Nano-Optoelectronics Workshop, Санкт-Петербург, Россия, 2014;
-
SPIE Photonics Europe, Брюссель, Бельгия, 2014;
-
III Всероссийский конгресс молодых ученых Университета ИТМО, Санкт-Петербург, Россия, 2014;
-
VII Международная конференция «Оптика-2013», Санкт-Петербург, Россия, 2013;
-
ANBRE13, Сеул, Южная Корея, 2013;
-
II Всероссийский конгресс молодых ученых Университета ИТМО, Санкт-Петербург, Россия, 2013;
-
ХLI научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО, Санкт- Петербург, Россия, 2013;
-
3-rd International Symposium "Molecular Photonics", Репино, Санкт-Петербург, Россия, 2012.
По результатам конференций были опубликованы 18 научных трудов в сборниках тезисов докладов.
Основные результаты по теме диссертации изложены в 28 печатных изданиях, 10 из которых изданы в журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад
Содержание диссертации и основные положения, выносимые на
защиту, отражают персональный вклад автора в опубликованные работы.
Вклад автора заключался в непосредственном выполнении основной части
экспериментальных и теоретических исследований, написании и
редактировании статей и тезисов докладов. Обсуждение результатов и подготовка к публикации полученных результатов проводилась совместно с соавторами, причем вклад диссертанта был определяющим. Общая постановка целей и задач исследования в рамках диссертационной работы проведена совместно с научным руководителем работы А.О. Орловой.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, пяти глав и заключения. Полный объем диссертации 168 страниц текста с 49 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 148 наименований.
Полупроводниковые квантовые точки. Спектральные и фотофизические свойства
Тип связывания определяет трудоемкость процесса получения и стабильность комплексов, и разнообразие молекул, которые могут быть связаны в комплекс с КТ. С другой стороны, механизм связывания определяет физико-химические свойства и влияет на спектрально-люминесцентные свойства комплексов, которые будут рассмотрены в следующем разделе.
Для комплексов КТ-тетрапиррольные молекулы можно рассмотреть три основных механизма связывания, а именно: ковалентная связь, связь, обусловленная электростатическим взаимодействием между КТ и молекулами, и координационная связь того или иного типа. Существуют некоторые другие виды связи, например, гидрофобное взаимодействие, водородная связь или биоконь-югация, описанная в работах [13; 14] но в рамках данной работы эти типы связывания рассмотрены не будут. . Ниже обсуждаются три основных типа связывания компонентов комплексов наряду с особенностями их синтеза и стабильности. 1.2.1 Ковалентное связывание
Комплексы с ковалентным типом связывания являются наиболее устойчивыми, но одновременно и наиболее трудозатратными в получении. Одним из первых примеров образования комплексов КТ-тетрапиррол методом ковалент-ной связи был описан в работе [15]. В этой работе CdTe КТ, солюбилизирован-ные тиопропионовой кислотой (TPA) или тиогликолевой кислотой (TGA) были ковалентно сшиты с цинк- или индий- производными тетрааминофталоциани-нона с использованием N-этил-N (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в качестве молекул-линковщиков. Было отмечено, что ковалентная связь приводит к незначительному смещению спектра поглощения фталоцианина (около 2 нм). По интерпретации авторов работы, что этот факт является общей особенностью данного вида связи и вызывается наличием большой длины цепи линкера между КТ и фталоцианином. В работе [16] CdSe/CdS/ZnS КТ, солюбилизированные пептидами, были также ковалентно связаны с молекулами красителей хлорином е6 (Хл е6) или с бенгальским розовым (RB) через молекулы пептидов.
Очевидными преимуществами этого способа связи являются высокая стабильность комплексов, отсутствие каких-либо процессов диссоциации при стандартных условиях и фиксированное расстоянии от КТ до тетрапиррольных молекул. К недостаткам можно отнести достаточно сложные протоколы связывания, требования к наличию карбоксильных или аминогрупп на поверхности КТ и у молекул, что достаточно сильно ограничивает выбор молекул, и относительно большие расстояния между КТ и молекулами, что ограничивает эффективность всех видов взаимодействия между ними, в том числе, передачи энергии фотовозбуждения.
Электростатическое взаимодействие как механизм связывания является самым простым и легким способом образования комплексов, который заключа 22 ется в том, что противоположно заряженные компоненты в растворе притягиваются друг к другу с помощью кулоновских сил. Его можно осуществить для разноименно заряженных КТ и молекул тетрапиррола. Он достаточно просто реализуется, но, как показывают существующие исследования [17], при электростатическом взаимодействии могут возникать различные изменения спектральных форм тетрапиррола, что осложняет анализ. Возможность формирования стабильных комплексов между разноименно заряженными КТ различных размеров, а также между разноименно заряженными КТ и нанокристаллами золота благодаря электростатическому взаимодействию была продемонстрирована в работе [18]. В работе [19] были сформированы комплексы между CdTe квантовыми точками с диаметром до 3.4 нм, солюбилизированных 2-аминоэтантиолом, и дигидрохлоридом мезо-тетра (4-сульфонатофенил)-порфина (TSPP) в качестве органического красителя. В данной работе наблюдался сдвиг первой полосы поглощения красителя при комплексообразовании с КТ. При сенсибилизированном фотовозбуждении красителя длиной волны 355 нм была детектирована генерация синглетного кислорода с квантовым выходом генерации 43%.
Изменение спектров поглощения красителя при связывании в комплекс с КТ были описаны в работе [20], где было показано образование комплексов в результате электростатического взаимодействия между КТ CdTe/TGA (отрицательно заряженных) и безметалльного мезо-тетра (п-триметиламинофенил) порфина (TAPP, положительно заряженный). При связывании компонентов в комплекс были выявлены до четырех различных форм TAPP в комплексах с КТ, отличающихся по спектрам фотолюминесценции, поглощения или возбуждения люминесценции от спектров свободных молекул.
В работе [21] комплексы CdSe/CdS/ZnS КТ, солюбилизированные производными дигидролипоевой кислоты, содержащей амины, были электростатически связаны с Al(OH)-тетрасульфофталлоцианином (ФЦ4). В полученных ком 23 плексах наблюдался внутрикомплексный перенос энергии, а также они были устойчивы в водных растворах и в биологической среде.
Методы спектрально-люминесцентного и микроскопического анализа комплексов в растворах
Для исследований в плазме крови человека были сформированы комплексы ФЦ и CdTe КТ (3.4 нм), в результате координации центрального атома ФЦ на карбоксильные группы гидрофильных солюбилизаторов TGA КТ, описанным в разделе 2.2.3 (Рисунок 2.4).
Для исследования свойств комплексов квантовых точек с молекулами фта-лоцианина в плазме крови человека комплексы были созданы в результате смешивания высоко концентрированных водных растворов КТ Сd 5x10 4 моль/л) и ФЦ, относительная концентрация которого n = C /Cd варьировалась от 1 до 30. Затем высококонцентрированные водные растворы комплексов КТ/ФЦ вводились в плазму крови человека: 10 мкл водного раствора комплексов на 10 мл плазмы крови.
Для исключения эффектов, связанных с высокими оптическими плотностями растворов, все измерения образцов в плазме крови человека проводились в тонких кюветах с длиной оптического пути 2 мм. 2.3.2 Методы исследования фотоиндуцированной цитотоксичности комплексов в клетках Асцитной Карциномы Эрлиха
Для исследования использовались комплексы ZnSe/ZnS (3.5 нм), солюбили-зированные СА, и хлорина е6, созданные в результате электростатического взаимодействия. Схема образования комплексов приведена на Рисунке 2.3б.
Комплексы были созданы в результате смешивания высококонцентрированных водных растворов КТ и Хл е6 с различной относительной концентрацией акцептора (Сd 5x10 моль/л, п варьировалось от 0.5 до 10). Затем высококонцентрированные водные растворы комплексов КТ/Хл е6 вводились в клеточную суспензию: 10 мкл водного раствора комплексов на 3 мл клеточной суспензии.
Для in-vitro исследований была использована клеточная линия асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ), культивированная в институте онкологии им. Н.Н.Петрова. Клеточную суспензию (0.5 мл) вводили подкожно восьминедельным белым лабораторным мышам обоих полов, имеющим средний вес около 20 г. Асциты выращивались в течение 8-9 дней. Клеточные суспензии были получены с помощью шприца и канюли из брюшной полости мыши с восьмого по десятый день после инъекции. Затем клеточная суспензия очищалась от эритроцитов в буфере для лизиса (0.01 моль HCl, 0.87% NH4Cl, рН = 7.4) в течение 5 минут. Затем суспензию промывали 2 раза сбалансированным солевым раствором Хенкса (СРХ) (центрифугировали в течение 5 минут на скорости 1500 оборотов в минуту). Осадок ресуспендировали в СРХ. 2.4.2.3. Исследование внутриклеточного проникновения комплексов КТ/Хл е6
Для изучения влияния КТ на внутриклеточное проникновение Хл е6, свежеприготовленные суспензии АКЭ клеток (1.5 106 клеток на 1 мл СРХ) были инкубированы со свободными КТ и молекулами Хл е6 и комплексами КТ/Хл е6 с различными начальными концентрациями Хл е6 в инкубационной среде (0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 и 5x10 6 моль/л) в стеклянных кюветах в течение двух часов. Концентрация КТ была одинаковой для каждого образца и была равна 0.5 х 10 6 моль/л. Затем клетки центрифугировали по методике, описанной выше. Количество Хл е6 в клетках определяли как разность между начальной концентрацией Хл е6 в СРХ и концентрацией Хл е6 в надосадочной жидкости после центрифугирования клеток. Для определения концентраций Хл е6 были зарегистрированы спектры поглощения надосадочных жидкостей, концентрации Хл е6 определялись по оптической плотности Хл е6 в полосе поглощения 405 нм после вычитания вклада поглощения КТ и СРХ на этой длине волны по формуле: среде СРХ до инкубации клеток и в надосадочной жидкости, соответственно; DБ Л, - суммарные оптические плотности КТ и СРХ на длине волны 405 нм, sС е4 - коэффициент молярной экстинкции хлорина е6 на длине волны 405 нм ( Го5б =1-3x105 моль_1см"2); l - длина оптического пути.
Для исследования зависимости внутриклеточного проникновения комплексов и их компонентов от времени инкубирования свежеприготовленные АКЭ клетки ресуспендировали в стеклянных кюветах (1.5106 клеток на 1 мл СРХ). Водные растворы свободного Хл е6 или комплексов КТ/Хл е6 с концентрацией Хл е6 0.5 х 10 6 моль/л были добавлены в каждую кювету. Клетки инкубировали в темноте при 37С в течение различных периодов времени (0.5, 1, 2, 4 и 7 часов). В течение всего эксперимента проводились исследования выживаемости клеток, и процент мертвых клеток не превышал 7%, что является допустимой величиной в подобных экспериментах. После инкубации клетки центрифугировали, и определялись концентрации Хл е6 в клетках, в соответствие с формулой (2.3). Для определения величин стандартных отклонений экспериментальных данных было проведено три независимых повтора каждого эксперимента. На Рисунке 2.5 в качестве примера приведены спектры поглощения Хл е6 в надосадочных жидкостях АКЭ клеток с различным временем инкубации, а также спектр поглощения Хл е6 в СРХ до инкубации клеток.
Спектральные проявления агрегации молекул ФЦ в комплексах с катионными CdSe/ZnS КТ
Согласно модели, молекулы акцептора в агрегированной форме не способны люминесцировать, поэтому в рамках данной модели вклад в регистрируемую интенсивность фотолюминесценции акцептора будут давать только те комплексы, в которых акцептор способен люминесцировать, т.е. находится в мономерной форме. Интенсивность фотолюминесценции акцептора, вызванной прямым фотовозбуждением, будет увеличиваться пропорционально увеличению концентрации мономеров по формуле:
Где Іп - интенсивность возбуждающего излучения, ф - квантовый вы-ход фотолюминесценции мономерной формы акцептора, который не зависит от концентрации мономеров в комплексах. См - концентрация мономеров акцеп тора (выражение (3.9)).
Величина Idirect ID из формулы (3.2), которая отражает квантовый вы ход фотолюминесценции, вызванной прямым фотовозбуждением акцептора direct , в случае гетерогенной системы является отношением интенсивности фо толюминесценции, вызванной прямым фотовозбуждения мономеров акцептора в смеси к оптической плотности мономеров и агрегатов в смеси: лгеа _jd,rect/j гетерогенной системе комплексов зависит от относи т а,п а / а,п тельной концентрации акцептора в смеси и и а: Таким образом, величина pct (п,а) пропорциональна отношению числа молекул акцептора в мономерной форме к общему числу молекул акцептора и зависит от отношения коэффициентов экстинкции акцептора в мономерной и агрегированной форме. Зависимости ф с от п для различных отношений коэффициентов экстинкций єл Ієм при а=1 представлены на Рисунке 3.П. Как видно из Рисунка 3.11в, отношение экстинкций єл Ієм на длине волны прямо 87 го фотовозбуждения акцептора значительно влияет на наклон кри вой : ,«)
Зависимость относительных значений pf ct от относительной концентрации акцептора (п) для различного отношения коэффициентов экстинкции агрегатов и мономеров ФЦ для в гетерогенной системе с параметром а = 1 (а) и а = 2 (б)
Интенсивность сенсибилизированной фотолюминесценции акцептора зависит от числа КТ, связанных с акцептором в мономерной форме, квантового выхода фотолюминесценции акцептора и эффективности переноса энергии.
В результате, полученные зависимости (3.13) и (3.15) демонстрируют, что в комплексах с низкими значениями параметра а увеличение п приводит к - direct экспоненциальному падению значений h, и m , как функции от и и а. При увеличении значений параметра а вклад нелюминесцирующих агрегатов в зависимости (3.13) и (3.15) будет заметен при больших значениях п.
Далее, в соответствие с предложенной моделью были промоделированы концентрационные зависимости двух независимо определяемых экспериментальных величин - эффективности переноса энергии (по формуле (3.15)) и относительного квантового выхода фотолюминесценции акцептора (по формуле (3.13)). Фиттинг двух независимых экспериментальных кривых модельными зависимостями, в которые одновременно входит параметр а, позволил оценить наличие агрегатов в составе комплексов.
Результаты представлены на Рисунке 3.12, где приведены экспериментальные зависимости эффективности переноса энергии и квантового выхода фотолюминесценции ФЦ, рассчитанные в соответствии с формулами (1.12) и (2.2) (красные и синие точки, соответственно), а также аппроксимации соответствующих экспериментальных данных модельными зависимостями Е (п,а) и
Относительная эффективность переноса энергии Eh (красные круги) и значений срd i rect (синие квадраты) в гетерогенной системе комплексов как функция от n: символы на графике являются экспериментальными результатами. Сплошные линии - зависимости E (красная линия) и af?ct (синяя линия), полученные из предложенной модели для а = 1 и отношения коэффициентов экстинкции акцепторов и мономеров ФЦ ЄP c/єPc = 1.20
Для фиттинга обеих экспериментальных зависимостей использовалось значение параметра а = 1, что означает, что в комплексах КТ/ФЦ агрегация молекул в комплексе с КТ происходит во всех комплексах, в которых в комплекс с КТ связано больше одной молекулы ФЦ. Следует отметить, что при полученном значении параметра а = 1, наилучшая аппроксимация экспериментальных данных (pfhect[n,a) была получена при значении отношения коэффициентов экстинкции єA ІєM = 1 20. Это хорошо согласуется с отношением экстинкций на длине волны прямого возбуждения фотолюминесценции ФЦ 640 нм Є /ЄТ = 115 ± 0.05, полученным из экспериментальных данных (расчет приведен в приложении 1).
Наиболее благоприятные условия для агрегации молекул фталоцианина в водном растворе реализуются в случае полной или частичной нейтрализации заряда молекулы фталоцианина [50]. Это может происходить при их связывании с положительно заряженными молекулами солюбилизатора на поверхности КТ. Предполагается, что молекулы фталоцианина с низким числом заряженных сульфогрупп (1 и 2) в первую очередь образуют нелюминесцирующие агрегаты в комплексах с КТ. Поэтому снижение процентного содержания таких молекул в смеси может приводить к снижению вероятности агрегации молекул фтало-цианина в комплексе с КТ.
Использование метода бумажной хроматографии позволило получить две хроматографические области, обогащенные тетрасульфо гидроксифталоцианина алюминия (ФЦ4) и дисульфо-гидроксифталоцианина алюминия (ФЦ2). В смесях ФЦ4 и ФЦ2 с квантовыми точками происходило образование комплексов в которых наблюдается эффективный перенос энергии, что подтверждалось тушением фотолюминесценции КТ и появлением сенсибилизированной фотолюминесценции ФЦ.
На Рисунке 3.13 приведены нормированные на максимальное значение ad,i hrect и Eh , вычисленные из экспериментальных данных с использованием формул (1.12) и (2.2)для комплексов КТ с ФЦ4 и ФЦ2 (красные круги и синие квадраты, соответственно). Кроме того, на Рисунке 3.13 демонстрируются для сравнения аналогичные зависимости, полученные для комплексов КТ с исходной смесью ФЦ (т.е. с Фотосенсом).
Анализ тушения фотолюминесценции катионных CdSe/ZnS и ZnSe/ZnS КТ в смесях с Хл е6
Как видно из Рисунка 4.5, в спектрах возбуждения Хл е6 в смеси с как CdSe/ZnS, так и с ZnSe/ZnS КТ есть вклад спектра поглощения КТ (область спектров, обозначенная квадратами на Рисунке 4.5), что свидетельствует о наличии эффективного переноса энергии от КТ к молекулам Хл е6.
При этом отчетливо видно, что при увеличении n в смесях уменьшается вклад спектра поглощения КТ в спектр возбуждения фотолюминесценции Хл е6 в комплексах с КТ обоих типов. Это свидетельствует об уменьшении эффективности переноса энергии от КТ к молекулам Хл е6 при увеличении концентрации Хл е6 в смеси.
Также из Рисунка 4.5 видно, что с увеличением концентрации Хл е6 в смесях ухудшается соотношение сигнал/шум, что свидетельствует о тушения фотолюминесценции Хл е6, что также видно из Рисунка 4.2, где при увеличении n в смеси выраженно уменьшалась интенсивность люминесценции Хл е6.
На Рисунке 4.6 приведены зависимости эффективности внутрикомплекс-ного переноса энергии от КТ к Хл е6 (Рисунок 4.6а) и квантового выхода фотолюминесценции Хл е6 (Рисунок 4.6б) от относительной концентрации Хл е6 в смешанном растворе. Эффективность внутрикомплексного переноса энергии в данном случае определялась по формуле (4.1). Для сравнения приведена концентрационная зависимости эффективности переноса энергии и квантового выхода фотолюминесценции ФЦ в комплексах КТ/ФЦ, созданных в результате электростатического взаимодействия.
Зависимость эффективности FRET (а) и квантового выхода фотолюминесценции Хл е6 (б) в комплексах Хл е6 с квантовыми точками СdSe/ZnS с размером ядра 2.5 нм (окружности) и ZnSe/ZnS с размером ядра 3.5 нм (круги), солюбилизированных CA, от относительной концентрации Хл е6 в смеси n. Также приведены подобные зависимости для комплексов квантовых точек СdSe/ZnS с размером ядра 5 нм, солюбилизированных DMAЕТ и молекул ФЦ (треугольники). Линии проведены для удобства восприятия
Установлено, что Как видно из Рисунка 4.6б, при небольших концентрациях Хл е6 в смешанном растворе его квантовый выход фотолюминесценции составляет 6.5% при квантовом выходе свободного Хл е6 8%. При увеличении концентрации Хл е6 в смеси его квантовый выход фотолюминесценции снижается по сравнению с квантовым выходом при низких концентрациях Хл е6 в комплексах наблюдается перенос энергии от КТ к Хл е6, эффективность которого достигает 50% в случае комплексов с CdSe/ZnS КТ и ZnSe/ZnS КТ. Однако при увеличении концентрации Хл е6 эффективность FRET стремительно снижается. фотолюминесценции свободного Хл е6.
При этом в комплексах Хл е6 с CdSe/ZnS КТ, в которых в среднем содержалось три КТ, наблюдались более резкие зависимость эффективности внутри-комплексного переноса энергии и квантового выхода люминесценции Хл е6 от n по сравнению с комплексами Хл е6 с ZnSe/ZnS КТ, в которых содержалось в среднем 2 КТ. Это свидетельствует о корреляции между степенью агрегации КТ в комплексах и фотофизическими свойствами комплексов.
Из Рисунка 4.6 видно, что зависимости эффективности переноса энергии и квантового выхода фотолюминесценции Хл е6 в комплексах с КТ имеют сходную зависимость с комплексами КТ/ФЦ, созданными в результате электростатического взаимодействия, что позволяет предположить образование нелю-минесцирующих агрегатов хлорина е6 в комплексах с катионными КТ. При этом в комплексах с КТ могут образовываться агрегаты хлорина более высоких порядков, которые, в отличие от димеров хлорина, не люминесцируют и имеют очень слабое поглощение. Однако анализ спектров поглощения образцов не выявил образования агрегатов хлорина е6 в комплексах с КТ в концентрации, которая была бы достаточна для объяснения наблюдаемых зависимостей E и .
Наблюдаемое уменьшение эффективности внутрикомплексного переноса может быть связано с тем, что при образовании комплексов Хл е6 с CdSe/ZnS и ZnSe/ZnS КТ происходит агрегация КТ, которая приводит к тому, что в комплексах в среднем находится более 1 КТ, о чем свидетельствуют зависимости интенсивности фотолюминесценции КТ в смесях от n представленные на Рисунке 4.4. В этом случае в комплексах возможно образование новых безызлуча-тельных каналов дезактивации возбужденного состояния КТ, которое согласно литературным данным способно эффективно конкурировать с фотолюминесценцией КТ [61], и, согласно теории FRET, должно приводить к уменьшению эффективности переноса энергии (см. формулы (1.6) и (1.9)).
Очевидно, что наблюдаемое уменьшение квантового выхода люминесценции Хл е6 не может быть объяснено образованием нелюминесцирующих агрегатов молекул в данных системах. Можно предположить, что образование агрегатов КТ в комплексах КТ/Хле6 приводит к образованию новых поверхностных состояний КТ, уровень энергии которых располагается в запрещенной зоне КТ и для которых выполняется условие резонанса с излучательным состоянием Хл е6, что может приводить к переносу энергии от хлорина е6 к КТ по механизму FRET. Следует отметить, что на сегодняшний день строгие экспериментальные подтверждения данного предположения отсутствуют, и для объяснения возникновения концентрационной зависимости квантового выхода люминесценции молекул в отсутствие их агрегации в комплексах с КТ необходимо проведение дальнейших исследований.