Исследование фотофизических свойств димегина как фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики Дадеко Антонина Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 8

1.1 Фотодинамическая терапия как перспективный метод борьбы с патогенами и злокачественными образованиями 8

1.2 Фотофизические и фотохимические свойства фотосенсибилизаторов 15

1.2.1 Фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики 15

1.2.2 Фотосенсибилизированная генерация синглетного кислорода и флуоресценция фотосенсибилизаторов 28

1.2.3 Фотостабильность фотосенсибилизаторов 34

1.2.4 Квантовый выход генерации синглетного кислорода и флуоресценции фотосенсибилизаторов 35

1.2.5 Влияние транспортных добавок на фотофизические свойства фотосенсибилизаторов 39

1.3 Фотофизические исследования фотосенсибилизаторов на клеточных культурах 41

1.4 Выводы по литературному обзору 44

Глава 2. Материалы, методика и техника эксперимента 45

2.1 Материалы исследования 46

2.2 Методики измерений и техника эксперимента 47

Глава 3. Фотофизические свойства фотосенсибилизаторов димегина, фотодитазина и радахлорина 54

3.1 Сравнительное исследование фотофизических характеристик димегина, фотодитазина и радахлорина (эффективность генерации синглетного кислорода, интенсивность флуоресценции и фотостабильность фотосенсибилизаторов) 55

3.2 Измерение квантовых выходов генерации синглетного кислорода, флуоресценции и коэффициента фоторазрушения димегина 79

3.3 Изучение влияния транспортных добавок (альбумин, плюроник F-127) на фотофизические свойства димегина и фотодитазина (эффективность генерации синглетного кислорода, флуоресценция, фотостабильность) 86

Глава 4. Фотодинамические и флуоресцентные свойства димегина 92

4.1 Фотодинамическое влияние димегина на культуры клеток как модель процесса ФДТ 92

4.1.1 Сравнительное исследование димегина и фотодитазина на клеточных культурах нормальных и опухолевых клеток 95

4.1.2 Исследования фотоцитотоксичности димегина на малигнизированных (неопластических) клетках крыс и человека 103

4.2 Изучение флуоресцентных свойств димегина и определение сайтов его накопления в клетке и, как следствие, механизма разрушения опухоли 107

Заключение 110

Список сокращений и условных обозначений 112

Список литературы 113

• Фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики
• Сравнительное исследование фотофизических характеристик димегина, фотодитазина и радахлорина (эффективность генерации синглетного кислорода, интенсивность флуоресценции и фотостабильность фотосенсибилизаторов)
• Изучение влияния транспортных добавок (альбумин, плюроник F-127) на фотофизические свойства димегина и фотодитазина (эффективность генерации синглетного кислорода, флуоресценция, фотостабильность)
• Изучение флуоресцентных свойств димегина и определение сайтов его накопления в клетке и, как следствие, механизма разрушения опухоли

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Актуальным на сегодняшний день является поиск и изучение лекарственных препаратов и методов их применения, обеспечивающих избирательность воздействия, минимизацию хирургического вмешательства и хороший косметический эффект при лечении онкологических заболеваний разной степени тяжести, а также различных инфекционных заболеваний. Все эти характеристики присущи фотодинамической терапии – методу лечения, основанного на окислительном стрессе патологических клеток под действием активных форм кислорода, образующихся при взаимодействии с введенным в организм фотосенсибилизатором, активируемым светом определенной длины волны.

Хотя возможность применения фотодинамической терапии как способа
борьбы с онкологическими заболеваниями известна уже давно, на сегодняшний
день данная терапия все еще не получила широкого распространения и зачастую
является побочным методом лечения, применяемым либо для подготовки к
хирургическому лечению, либо после него в виде поддерживающей процедуры.
Одним из основных препятствий, сдерживающих широкое распространение
фотодинамической терапии, является недостаточная эффективность и высокая
стоимость используемых в ней лекарственных препаратов –

фотосенсибилизаторов, сложное химическое производство которых не только ведет к повышению себестоимости, но также и влияет на токсичность, степень связывания с неопластическими клетками и простоту выведения из организма. Сегодня количество запатентованных фотосенсибилизаторов измеряется десятками, но лишь единицы введены в медицинскую практику. Данный феномен объясняется высокой стоимостью проведения доклинических и клинических испытаний фотосенсибилизаторов, большинство из которых оказывается не готовыми к внедрению в медицинскую практику. Именно поэтому представляется крайне важным проводить исследования и отбраковку фотосенсибилизаторов до этапа испытаний на животных, что поможет не только снизить итоговую стоимость препарата, но и использовать меньшее число животных в испытаниях. Для создания наиболее полной картины об эффективности конкретного фотосенсибилизатора необходимо проведение фотофизических исследований, стоимость которых в сотни раз ниже исследований на животных, однако результаты могут выявить наиболее перспективные и конкурентоспособные фотосенсибилизаторы.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в
изучении фотофизических свойств фотосенсибилизатора порфириновой
природы димегина (динатриевая соль 2,4-ди (-метоксиэтил)-

дейтеропорфирина-IX) и сравнении их со свойствами фотодитазина (N-метил-D-глюкаминовая соль хлорина е6) и радахлорина (тринатриевая соль хлорина е6) – фотосенсибилизаторов, уже применяемых в медицинской практике, а также в проведении фотоцитотоксических испытаний димегина для определения его эффективности in vitro.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное исследование эффективности генерации
синглетного кислорода, интенсивности флуоресценции и фотостабильности
димегина, фотодитазина и радахлорина;

2. Измерить квантовые выходы генерации синглетного кислорода и
константы тушения синглетного кислорода для димегина и фотодитазина;

3. Определить квантовый выход флуоресценции, а также коэффициент
фоторазрушения (фотообесцвечивания) фотосенсибилизатора димегина;

4. Исследовать эффективность генерации синглетного кислорода,
флуоресценцию и фотостабильность димегина и фотодитазина в составе
комплексов с альбумином и плюроником F-127;

5. Провести сравнительное исследование димегина и фотодитазина при
моделировании процесса фотодинамической терапии на культурах опухолевых
клеток;

6. Выполнить анализ темновой токсичности и фотоцитотоксичности
димегина на раковых клетках животных и человека;

7. Изучить флуоресцентные свойства димегина и определить сайты его
накопления в опухолевых клетках для определения механизма разрушения
опухоли.

Научная новизна

1. Проведен анализ эффективности генерации синглетного кислорода,
флуоресценции и фотостабильности димегина в сравнении с фотодитазином и
радахлорином;

2. Показано, что облучение димегина светом с длиной волны 395-405 нм
(пик Соре) обеспечивает долговременную эффективную генерацию синглетного
кислорода, активно разрушающего патологические клетки;

1. Определены квантовые выходы генерации синглетного кислорода и константы тушения синглетного кислорода для димегина и фотодитазина, а также определен квантовый выход флуоресценции и коэффициент фотообесцвечивания димегина;

2. На основе полученных экспериментальных данных по измерению спектров поглощения и флуоресценции растворов димегина представлена схема его энергетических уровней;

3. Установлено, что комплексообразование димегина и фотодитазина с белком крови альбумином и поверхностно-активным веществом плюроником F-127 незначительно влияет на эффективность генерации синглетного кислорода и флуоресценцию фотосенсибилизаторов, но образование комплекса с альбумином заметно ухудшает фотостабильность фотосенсибилизаторов;

6. Выполнено исследование темновой токсичности и
фотоцитотоксичности димегина на культурах опухолевых клеток, а также
проведено изучение цитостатичности и цитотоксичности димегина в сравнении
с фотодитазином на клетках нормальных фибробластов кожи и опухолевых
клетках человека;

7. Методами флуоресцентной микроскопии определены сайты накопления димегина в опухолевых клетках, что позволило сделать выводы о доминирующем механизме разрушения патологических образований с применением этого фотосенсибилизатора.

Практическая значимость работы

Практической значимостью данной работы является получение новых сведений о фотофизических характеристиках фотосенсибилизатора порфириновой природы димегина, в том числе, в сравнении с характеристиками других фотосенсибилизаторов, также изученных в рамках данного исследования. Результаты фотоцитотоксического исследования димегина можно рассматривать в качестве основы для проведения доклинических исследований изучаемого фотосенсибилизатора.

Поскольку в рамках проведенного исследования было показано значительное преимущество димегина над фотосенсибилизаторами, применяемыми в настоящее время (фотодитазином и радахлорином), можно полагать, что результаты, полученные в диссертации, будут способствовать внедрению димегина в медицинскую практику.

Методология и методы исследования

Эффективность генерации синглетного кислорода определялась методом «химических ловушек» и методом прямой регистрации люминесценции синглетного кислорода на длине волны 1270 нм. Данные методы также применялись при определении квантового выхода генерации синглетного кислорода. Все квантовые выходы были определены относительно известных фотосенсибилизаторов, выступающих в качестве образцов сравнения.

Для изучения фотофизических свойств фотосенсибилизаторов в данной работе применялись флуоресцентный и спектрофотометрический методы. Источниками облучения служили светодиодные матрицы с различными длинами волн излучения. Измерение времени жизни и констант тушения синглетного кислорода фотосенсибилизаторами выполнялось с применением импульсных источников возбуждения.

Определение цитотоксического действия фотосенсибилизаторов было реализовано двумя методами: с применением МТТ-теста и с использованием индикатора выживаемости клеток PrestoBlue.

Прижизненное наблюдение за клетками, содержащими

фотосенсибилизатор, осуществлялось с применением методов флуоресцентной микроскопии.

Положения, выносимые на защиту

1. Показано, что димегин, обладающий высоким квантовым выходом генерации синглетного кислорода (0.65±0.06) и флуоресценции (0.11+0.01), низким коэффициентом фоторазрушения и относительно низкой константой тушения синглетного кислорода, является эффективным фотосенсибилизатором для применения в фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностике;

2. Установлена прямая зависимость фотостабильности димегина от его концентрации, на базе чего сделано предположение о том, что более высокий показатель фотостабильности димегина по сравнению с фотодитазином и радахлорином обусловлен наличием в растворе высокой концентрации агрегатов, способствующих восстановлению исходной концентрации молекул фотосенсибилизатора в процессе его облучения;

3. Показано, что образование комплексов димегина и фотодитазина с основным белком крови – альбумином и транспортной добавкой плюроником F-127 несущественно влияет на эффективность генерации синглетного кислорода и на интенсивность флуоресценции, при этом отмечено ухудшение фотостабильности фотосенсибилизаторов в комплексе с альбумином вследствие эффективной разагрегации препаратов;

4. Доказана низкая темновая токсичность и высокая фотоцитотоксичность димегина по отношению к применяемым в исследовании опухолевым клеткам;

5. Методами флуоресцентной микроскопии определено, что в опухолевых клетках димегин накапливается преимущественно в митохондриях, определяя тем самым основной механизм разрушения опухолевых клеток при фотодинамической терапии.

Степень достоверности и апробация результатов

Основные результаты диссертации докладывались на конференциях Университета ИТМО, научно-технических советах и конференциях «АО ГОИ им. С.И. Вавилова» и на следующих международных конференциях:

1. XXV Международная конференция «Лазеры в науке, технике,
медицине», 2014 (Россия, п. Небуг Туапсинского р-на);

2. Международная медико-биологическая научная конференция молодых
ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XVIII
Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»), 2015 (Россия, Санкт –
Петербург);

3. IV Всероссийская конференция «Фотодинамическая терапия и
фотодиагностика» (с международным участием), 2015 (РФ, Санкт – Петербург);

6. PIERS-2015 (Progress In Electromagnetics Research Symposium) (Чехия, Прага);

7. Laser Optics 2016 и 2018 (Россия, Санкт – Петербург).

Материалы диссертации опубликованы в 6 печатных работах, из них 4 статьи в журналах, индексируемых Scopus и Web of Science и 2 публикации тезисов (Scopus, Web of Science) в сборниках трудов конференций.

Личный вклад соискателя

Постановка задач и поиск путей их решения осуществлялась автором совместно с научным руководителем. Все эксперименты и расчеты, проведенные в рамках данной работы, выполнялись при активном участии автора работы. Исследование фотофизических свойств фотосенсибилизаторов осуществлялось на оборудовании АО «ГОИ им. С.И. Вавилова», а также на базе Института цитологии РАН и в Университете Торонто в Канаде. Подготовка к публикации

результатов исследований проводилась автором лично, при активном участии в обсуждении полученных результатов с соавторами публикаций.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка условных обозначений и терминов и списка литературы. Диссертация изложена на 135 страницах, включая 65 рисунков, 5 таблиц и список литературы из 232 наименований.

Фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики

Большинство используемых фотосенсибилизаторов, как клинических, так и экспериментальных, обладают гетероциклической кольцевой структурой и получены из тетрапирольного ароматического кольца, содержащегося во множестве пигментов натурального происхождения, таких как гемм, определяющий красный цвет крови, хлорофилл, отвечающий за зеленый цвет растений, водорослей и некоторых бактерий, и бактериохролофилл, синтезирующийся различными фототрофными бактериями, осуществляющими фотосинтез без выделения кислорода, и обладающий цветовой гаммой от пурпурного до зеленого цвета в зависимости от типа штамма [61]. Эти пигменты, а также известный витамин B12 и кофермент F430, входящие в группу тетрапироллов, обычно имеют сравнительно большой пик поглощения в области 395-405 нм, известный как пик Соре и набор из постепенно снижающихся пиков поглощения при продвижении в красную область длин волн, известных как Q-полосы (рисунок 2).

Реакции с возбужденными тетрапиролловыми фотосенсибилизаторами (за исключением бактериохлоринов) идут в основном по второму типу реакций, т.е. с образованием синглетного кислорода, в то время как у фотосенсибилизаторов с другими структурами превалирует механизм первого типа с образованием активных форм кислорода (таких, как гидроксильные радикалы). Число существующих фотосенсибилизаторов с тетрапиролловой структурой слишком велико, поэтому в данной работе упомянуты лишь самые распространенные в настоящее время и появившиеся недавно ФС.

На основании опыта проведения сеансов ФДТ с применением различных ФС показано, что данные фотоактивные вещества должны обладать следующими свойствами:

1. простой и удобной лекарственной формой, подходящей под стандарты производства и контроля качества лекарственных веществ, с высокой воспроизводимостью компонентного состава, стабильностью при хранении и с низкой стоимостью [32];

2. низкой темновой токсичностью, высокой селективностью накопления в опухоли и скоростью выведения из нормальной ткани, оставаясь при этом в достаточной концентрации в патологических клетках, что снижает возможность возникновения нежелательных побочных эффектов [63-65];

3. интенсивным поглощением и флуоресценцией в красной и ближней ИК области спектра (600-800 нм), поскольку использование таких длин волн обеспечивает лучшее проникновение света в ткань, а фотоны с длинами волн за 800нм не имеют достаточно энергии, чтобы перевести ФС в возбужденное состояние [66];

4. необходимыми фотофизическими характеристиками, такими как высокий квантовый выход образования триплетного состояния (T 0.5), высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода ( 0.5) и его реактивных форм [67];

5. преимущественным накоплением в органеллах клетки, поскольку такая локализация ФС ведет к уничтожению клеток механизмом апоптоза (программируемой клеточной смерти), что не только ведет к запуску цепной реакции гибели злокачественных клеток организма, но также вызывает иммунный ответ, и, в отличие от некротической гибели клеток, не вызывает местного воспаления, что также снижает побочные эффекты лечения [68-70]; 6. высокой фотостабильностью, которая позволит рассчитывать точные дозы облучения и концентрации препарата, снижая тем самым токсичность процедуры [71,72];

7. растворимостью в биологических средах, что упростит введение препарата в организм пациента, а также снизит его стоимость.

Фотосенсибилизаторы первого поколения – порфирины Традиционными и наиболее изученными фотодинамическими агентами являются порфирины [73]. Порфирины натурального и синтетического происхождения существуют в виде тетрапиррольных соединений, образованных четырьмя пиррольными ядрами, соединенными четырьмя метиновыми группами. Характерная структурная формула для молекулы порфирина представлена на рисунке 3.

Еще в 20-е годы прошлого столетия было показано, что гематопорфирин, который естественным образом присутствует в живом организме, имеет повышенное сродство к раковым клеткам. Причина этого окончательно не выяснена, но есть данные о том, что порфирины связываются с сывороточными белками, в том числе с липопротеинами низкой плотности [75]. Опухолевые клетки содержат большое количество рецепторов, к которым прикрепляются липопротеины, поэтому ФС, образуя с ними комплексы, скапливаются на цитоплазматических мембранах опухолевых клеток и мембранах внутриклеточных органелл, например, митихондрий. Спектры поглощения и флуоресценции порфиринов хорошо изучены и считается, что наибольшую эффективность порфирины проявляют при облучении их светом с длиной волны 395-405 нм, т.е. в пике Соре. В то же время в клинике для фотодинамического облучения порфиринов используется пик поглощения в красной области вблизи 630 нм [76]. Для более специфических применений используется также зеленый, синий или белый свет. Спектр поглощения порфиринов приведен на рисунке 2. Соответствующая диаграмма энергетических уровней для ряда порфиринов (порфирина на свободной основе H2P, в регулярном металлопорфирине и в SAT металлопорфирине) показана на рисунке 4, где HOMO и LUMO – высшая занятая и наинизшая незаполненная молекулярные орбитали соответственно.

В качестве потенциальных агентов для ФДТ использовались гематопорфирин (НР), протопорфирин, уропорфирин, дигематопорфирин (НpD), фотофрин [77] и другие порфирины. К порфринам также относится АЛК – индуцированный (5 аминоливулиновая кислота) протопорфирин IX, который в настоящее время широко используется в дерматологии [78].

Недостатками ФС первого поколения являются: недостаточная избирательность накопления, длительное удерживание препаратов в здоровых тканях, сложный состав [79].

Фотосенсибилизаторы второго поколе ни я В отличие от ФС первого поколения, современные ФС активируются светом в длинноволновой красной области спектра (650-680 нм), который глубже проникает в ткани. Фотосенсибилизаторы второго поколения обладают химической однородностью, растворимостью, более избирательно накапливаются в опухолевой ткани и быстрее выводятся из организма [80, 81].

Такими ФС, в частности, являются синтетические порфирины, производные тетраазапорфиринов, прежде всего фталоцианинов и нафталоцианинов, а также производные хлоринов, пурпуринов, порфиценов и бактериохлорофиллов [82, 83].

Сравнительное исследование фотофизических характеристик димегина, фотодитазина и радахлорина (эффективность генерации синглетного кислорода, интенсивность флуоресценции и фотостабильность фотосенсибилизаторов)

Как уже было упомянуто выше, основным процессом, ведущим к разрушению опухолевой клетки, является ее контакт с высокореактивным синглетным кислородом и радикалами, образующимся при фотовозбуждении фотосенсибилизатора. Однако регистрация радикалов представляет собой сложную задачу и вероятность такой реакции значительно ниже, чем реакции с образованием синглетного кислорода. Именно поэтому в данном исследовании был сделан акцент на изучение эффективности генерации синглетного кислорода фотосенсибилизаторами. Эксперимент по сравнению данного параметра у димегина и известных российских фотосенсибилизаторов фотодитазина и радахлорина был проведен на основе метода регистрации синглетного кислорода с применением «химической ловушки», в качестве которой выступал триптофан, а также путем непосредственной регистрации люминесценции синглетного кислорода с применением спектрометров SDH-IV и М-266.

Материалы и техника эксперимента, применявшиеся в данном разделе при проведении исследований свойств фотосенсибилизаторов, описаны в главе 2.

Эффективность генерации синглетного кислорода фотосенсибилизаторами, растворенными в фосфатном буфере рН 7.0, была оценена по изменению спектров поглощения триптофана, измеряемых с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-3600. Концентрации фотосенсибилизаторов в растворе составляли 10"6 Моль/л, триптофана -5-Ю"5 Моль/л. Облучение растворов ФС производилось светодиодными матрицами. Скорость расходования «химической ловушки» триптофана в растворе являлась характеристикой эффективности генерации синглетного кислорода.

При применении прямого метода регистрации люминесценции синглетного кислорода на Я=1270 нм для оценки эффективности его генерации в растворах исследуемых фотосенсибилизаторов были выполнены измерения для ряда растворителей (этанол, ацетон, тетрахлорметан), в которых эффективность генерации синглетного кислорода значительно выше, чем в водных растворах, вследствие более высокого времени жизни возбужденного состояния кислорода.

Поскольку в клинике фотодинамическая терапия неразрывно связана с флуоресцентной диагностикой, представляющей собой фотовозбуждение фотосенсибилизаторов, содержащихся в патогенных тканях, светом с длиной волны, соответствующей минимуму в спектре поглощения ФС, что вызывает свечение препарата без повреждения содержащих его клеток, необходимо было провести сравнительное изучение интенсивности флуоресценции трех фотосенсибилизаторов как основного параметра, характеризующего эффективность проведения флуоресцентной диагностики. Для реализации поставленной задачи были получены спектры флуоресценции димегина, фотодитазина и радахлорина, растворенных в фосфатном буфере pH 7.0 с применением спектрометра М-266 при облучении светодиодными матрицами. Интенсивность люминесценции оценивалась по амплитуде максимума в полученных спектрах. Сравнение фотосенсибилизаторов по эффективности флуоресценции было выполнено по интегральным характеристикам свечения в пределах наблюдаемого спектрального профиля. Плотность мощности облучения на образце составляла 50-100 мВт/см2, концентрация фотосенсибилизаторов в растворе – 10-5 Моль/л.

В ряду необходимых характеристик идеального фотосенсибилизатора его фотостабильность стоит далеко не на последнем месте, ведь она влияет как на дозу вводимого в организм пациента фотосенсибилизатора, так и на дозу необходимого облучения. Сравнение фотостабильности димегина с фотостабильностью российских фотосенсибилизаторов фотодитазина и радахлорина проводилось также с применением спектрофотометрии. Фотосенсибилизаторы, растворенные в фосфатном буфере pH 7.0, подвергались облучению, длительность которого зависела от мощностей и спектральных характеристик источников облучения, в качестве которых выступали светодиодные матрицы. После каждого этапа облучения регистрировались спектры поглощения фотосенсибилизаторов с применением спектрофотометра Shimadzu UV-3600. Максимальное время облучения составляло 60 сек, плотность мощности – 250 мВт/см2. Изменение в концентрации фотосенсибилизаторов, т.е. их фоторазрушение, детектировалось по изменению оптической плотности растворов в пике Соре, характерного для всех изучаемых нами ФС после процесса облучения. Результаты исследования и их обсуждение

При подборе концентраций фотосенсибилизаторов и источников облучения для проведения данного исследования прежде всего были получены спектры оптического поглощения в растворе фосфатного буфера рН 7.0 для димегина, фотодитазина и радахлорина, представленные на рисунке 23.

Как можно видеть из представленного рисунка, все три фотосенсибилизатора обладают максимальным поглощением в полосе 395-405 нм – полосе Соре. У фотодитазина и радахлорина можно наблюдать также четко выраженный пик в области 650 нм, свойственный всем хлоринам. Разница в оптическом поглощении, наблюдаемая на рисунке, может быть связана с тем, что раствор димегина был получен из лиофильно высушенного порошка, а при получении растворов фотодитазина и радахлорина были использованы их лекарственные формы, в которых содержание действующего вещества значительно меньше. Представленные на рисунке 23 результаты были опубликованы в работе [205].

При более позднем измерении спектров оптического поглощения водных растворов этих фотосенсибилизаторов с использованием лиофильно высушенных порошков для димегина и фотодитазина были получены результаты, представленные на рисунке 24. Как видно из этого рисунка, максимумы поглощения в пике Соре для этих двух фотосенсибилизаторов практически не отличаются, демонстрируя при этом и примерно одинаковую стабильность при хранении. Эти результаты не плохо коррелируют с данными, приведенными в работе [28], в которой при одинаковой концентрации димегина и фотодитазина их поглощение в максимуме пика Соре также будет примерно одинаковым. Рисунок 24 – Спектры поглощения растворов димегина и фотодитазина в дистиллированной воде сразу после растворения (1) и через 24 часа (2). Концентрация фотосенсибилизаторов – 10-5 Моль/л.

При растворении в фосфатном буфере (см. рисунок 25) максимумы поглощения в пике Соре для димегина и фотодитазина также несущественно отличаются друг от друга, хотя и с обратным соотношением по сравнению с рисунком 24. Максимум поглощения в пике Соре для радахлорина несколько уступает димегину и фотодитазину, однако, не в такой степени, как на рисунке 23. Следует заметить, что наблюдающееся различие в соотношении максимумов поглощения в пике Соре для димегина и фотодитазина, по-видимому, носит все-таки не принципиальный характер, а вероятнее всего, связано с некоторой невоспроизводимостью условий приготовления растворов, особенно при взвешивании образцов фотосенсибилизаторов в количестве 1-2 мг на аналитических лабораторных весах марки Vibra HT 84 CE с дискретностью 0.1 мг.

Изучение влияния транспортных добавок (альбумин, плюроник F-127) на фотофизические свойства димегина и фотодитазина (эффективность генерации синглетного кислорода, флуоресценция, фотостабильность)

При исследовании влияния транспортных добавок (сывороточного альбумина и плюроника F-127) на эффективность генерации синглетного кислорода, флуоресценцию и фотостабильность димегина и фотодитазина комплекс фотосенсибилизатора с лиофилизированным альбумином, растворенным в фосфатном буфере pH 7.0 для димегина и рН 7.4 для фотодитазина, был получен при соотношении 1:1. Полученный раствор перемешивался на магнитной мешалке при температуре 20-22оС в течение 15 минут. Концентрация альбумина в полученных растворах была подобрана экспериментально и составила 10-5 Моль/л. Концентрации димегина и фотодитазина были равны 10-5 Моль/л. Растворы фотосенсибилизаторов с транспортной добавкой – плюроником были получены в аналогичных растворителях (концентрация ФС в растворе составляла 10-5 Моль/л, плюроника – 0.9 10-4 Моль/л), после чего растворы перемешивались на магнитной мешалке в течение 40 минут при температуре 20-22оС.

Добавление в раствор фотосенсибилизаторов сывороточного альбумина и плюроника повлекло за собой трансформацию основных полос спектра оптического поглощения ФС. Было зафиксировано смещение основного пика в спектре поглощения димегина и фотодитазина (пик Соре – 395 405нм) в красную область на 5-8 нм, а также небольшое увеличение его интенсивности при комплексообразовании с плюроником и аналогичное снижение интенсивности при комплексообразовании с альбумином. Первое свидетельствует об уменьшении агрегатов в растворе фотосенсибилизатора при добавлении плюроника, а второе – о гипохромном эффекте при образовании комплекса с альбумином, наблюдаемом в ряде работ с различными фотосенсибилизаторами. [225,226]. На рисунке 51 данная трансформация показана для димегина и фотодитазина.

Можно отметить, что образование комплекса димегина с альбумином не вызвало значительного уменьшения спектра оптического поглощения, в то время как поглощение комплекса фотодитазин-альбумин отличается от спектра чистого фотодитазина на 25 процентов. Такое отличие вызвано, по-видимому, двумя причинами: во-первых, уменьшением концентрации молекул фотодитазина в растворе вследствие образования комплексов с альбумином, которая не восполняется столь же эффективно, как в случае димегина за счет «резервуара» агрегатов, который для фотодитазина значительно меньше, как уже было отмечено выше, во-вторых, возможным отличием в поглощении образовавшихся комплексов по сравнению с исходным раствором. Эффективность генерации синглетного кислорода комплексами димегин альбумин, фотодитазин-альбумин, димегин-плюроник и фотодитазин-плюроник была охарактеризована по интенсивности люминесценции 1О2 на длине волны 1270 нм при облучении растворов фотосенсибилизаторов светом с m=405нм. На рисунке 52 представлены спектры люминесценции синглетного кислорода, генерируемого при взаимодействии с фотовозбужденным фотосенсибилизатором, заключенным в транспортные добавки, на примере димегина. Похожая зависимость наблюдается и для фотодитазина. Для наглядности, на рисунке также добавлен спектр люминесценции 1О2 в растворе фотосенсибилизатора без транспортных добавок.

Как можно видеть из представленных результатов, заключение фотосенсибилизатора в альбумин и плюроник F-127 незначительно влияет на эффективность генерации синглетного кислорода, что ранее было показано в работах [206,227]. В работах [200,228] увеличение фотокаталитической активности комплексов плюроника F127 с димегином и фотодитазином, наблюдавшееся в процессе окисления Х триптофана синглетным кислородом в водно-солевом растворе, было более заметным, примерно в 1.5 раза. Авторами этих работ сделан вывод, что наблюдающийся "полимерный эффект" обусловлен диссоциацией агрегатов, в виде которых молекулы фотодитазина и особенно димегина находятся в водных растворах, на что указывает и повышение интенсивности их флуоресценции в комплексах с альбумином и плюроником.

Установлено, что степень солюбилизации или разагрегации порфириновых фотосенсибилизаторов зависит от исходного соотношения между молярными концентрациями порфирина и плюроника [229]. Среди изученных полимеров поливинилпирролидон оказывает самое значительное влияние на фотоактивность димегина как в процессе фотогенерации синглетного кислорода, так и при реакции фотоокисления субстрата в D2O и воде [230].

В результате изучения интенсивности флуоресценции комплексов фотосенсибилизаторов с альбумином и плюроником были получены соответствующие спектры, представленные на рисунке 53.

На этом рисунке можно наблюдать увеличение интенсивности флуоресценции и батохромный сдвиг при образовании комплекса димегина и фотодитазина с плюроником. Спектральный сдвиг максимумов флуоресценции фотосенсибилизаторов при добавлении в раствор плюроника или альбумина, как видно на рисунке 53, примерно одинаковый, несмотря на различие природы этих комплексов. Изменение интенсивности флуоресценции ФС при образовании комплексов с транспортными добавками коррелирует с разницей интенсивностей в спектрах оптического поглощения и генерации синглетного кислорода растворов фотосенсибилизаторов. Вероятно, причины данных различий носят схожий характер, связанный с уже отмеченной разагрегацией порфиринов. Для комплекса альбумина с фотодитазином, однако, наблюдается более заметное снижение интенсивности флуоресценции, что, по видимому, связано с фотокаталитическим разрушением фотосенсибилизатора в комплексе с альбумином за время регистрации спектра вследствие более низкой фотостабильности самого фотодитазина, отмеченной выше, и частичной разагрегацией раствора, вызывающей дополнительное понижение его фотостабильности. Еще одной причиной может являться изменение излучательных свойств образовавшегося комплекса альбумина с фотосенсибилизатором. Фотостабильность комплексов фотосенсибилизаторов с транспортными добавками оценивалась по изменению концентрации ФС в растворе при облучении светодиодной матрицей с m395 405нм с плотностью мощности 250 мВт/см2. На рисунке 54 представлено изменение спектра оптического поглощения комплекса димегин-плюроник и димегин-альбумин при облучении в течение минуты. Как видно из рисунка, фотостабильность раствора комплекса димегина с альбумином значительно ниже, чем для раствора комплекса димегина с плюроником.

Похожая зависимость наблюдается и для фотодитазина. Для наглядности результаты по фотостабильности с транспортными добавками представлены на рисунке 55 в виде зависимости концентрации фотосенсибилизаторов от времени облучения растворов.

Очевидно, что плюроник не оказывает существенного фотостабильность ФС, в то время как образование комплекса, вызванное присутствием альбумина в растворе фотосенсибилизатора, приводит к заметному ухудшению фотостабильности как для димегина, так и для фотодитазина. Вероятно, мицеллы, образуемые плюроником, включают в себя слипшиеся молекулы фотосенсибилизаторов, т.е. не слишком эффективно способствуют разагрегации, в то время как сайты на молекуле альбумина очень активно комбинируются с отдельными молекулами фотосенсибилизатора, тем самым «растаскивая» агрегаты и образуя комплексы с другими свойствами. Как уже было показано выше, высокая фотостабильность димегина при применяемой в данном эксперименте концентрации 10-5 Моль/л, объясняется большим количеством агрегатов в растворе, и было отмечено, что уменьшение концентрации димегина приводит к его разагрегации и снижению фотостабильности. Таким же образом разагрегация димегина альбумином приводит к значительному снижению его фотостабильности. При этом для димегина она остается все же более высокой, чем для фотодитазина, по-видимому, вследствие отмеченного ранее [205] различия химической структуры между порфириновыми соединениями и хлоринами.

Изучение флуоресцентных свойств димегина и определение сайтов его накопления в клетке и, как следствие, механизма разрушения опухоли

Изучение флуоресцентных свойств димегина было проведено при моделировании процедуры флуоресцентной диагностики на линиях опухолевых клеток AY27, HT1372, U87 и RG2, одновременно с которым были определены сайты накопления димегина в изучаемых клетках.

Материалы и сследования

В качестве фотосенсибилизатора для данного исследования был использован димегин – динатриевая соль 2,4–ди(-метоксиэтил)-дейтеропорфирина-IX, лиофильно высушенный порошок, изготовленный в институте биохимии имени А. Н. Баха, РАН.

Используемые клеточные культуры

В данном исследовании были использованы клеточные культуры U87 – первичная глиобластома человека, RG2 – глиома крыс, HT1372 – рак мочевого пузыря человека и AY27 – карцинома мочевого пузыря крыс, культивируемые в питательной клеточной среде DMEM, содержащей фетальную бычью сыворотку, глутамин и пенициллин/стрептомицин, Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Линии клеток содержались как описано в литературе [231]. В средах, используемых для культивирования и гальванизации клеток, присутствовал феноловый красный, однако для модуляции процедуры флуоресцентной диагностики и анализа сайтов накопления фотосенсибилизатора в клетках использовались бесцветные среды.

В данном исследовании применялся инвертированный микроскоп ZEISS Axio Observer, ZEISS International.

Методология проведения экспериментов

Для изучения флуоресцентных свойств димегина и определения сайтов его накопления в клетке пятьдесят тысяч клеток линий AY27, HT1372, U87 и RG2 были посеяны на специальную плату для визуализации Lifecell (Ibidi, Muenich, Germany) и оставлены в инкубаторе СО2 на 24 часа. По истечении срока клеточная среда заменялась на бесцветную питательную среду, содержащую раствор димегина в средней для всех культур полулетальной дозе, вычисленной из предыдущего эксперимента – 3 мкМоль/л. После 3-х часовой инкубации среду заменяли на бесцветную для получения изображений.

Результаты исследования, общие выводы

Микрофотографии, полученные в исследовании сайтов накопления димегина с помощью инвертированного микроскопа ZEISS Axio Observer, представлены на рисунке 65.

На рисунке 65 можно заметить, что большинство клеток, содержащих димегин в полулетальной дозе, угнетены, что выражается в округлении. Из этого можно сделать вывод, что даже при облучении светом с длиной волны 465 нм, соответствующей минимальному поглощению в спектре димегина, клетки подвергаются интенсивному окислению. Вероятно, данная концентрация димегина слишком велика для проведения флуоресцентной диагностики с димегином. Также можно заметить хороший флуоресцентный сигнал фотосенсибилизатора, что делает возможным проведение с ним ФД. По полученным микрофотографиям сделан вывод о приблизительной локализации димегина. Преимущественное свечение вокруг ядер клеток указывает на то, что мишенями для димегина являются клеточные органеллы, преимущественно митохондрии. Избирательное накопление димегина в митохондриях также было подтверждено в исследовании [135]. Совокупность литературных данных и полученных результатов позволяют заключить, что преимущественным механизмом клеточной гибели при фотодинамической терапии с димегином является апоптоз, что положительно скажется на эффективности лечения.