Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Методы визуализации фазовых биологических объектов в микроскопии 13
1.1 Визуализация фазовых биологических объектов 13
1.2 Существующие интерференционные микроскопы для получения количественных фазовых изображений
1.2.1 Микроскопы на базе двулучевых интерферометров 17
1.2.2 Микроскопы на базе интерферометров общего пути 26
1.2.3 Микроскопы на базе сдвиговых интерферометров 36
1.3 Выводы 42
Глава 2 Методы получения фазовых изображений с применением интерферометров общего пути 44
2.1 Построение интерферометра общего пути с опорным пучком 44
2.1.1 Выбор оптического светоделителя 45
2.1.2 Формирование опорного пучка 49
2.2 Интерференционный микроскоп с призмой Кёстерса 50
2.2.1 Описание экспериментальной установки 50
2.2.2 Реализация метода фазовых шагов 53
2.2.3 Достоинства и недостатки интерференционного микроскопа с призмой Кёстерса 54
2.3 Интерференционный микроскоп с бипризмой Дове 55
2.3.1 Описание экспериментальной схемы 55
2.3.2 Реализация метода фазовых шагов 57
2.3.3 Компенсация смещения световых пучков 62
2.3.4 Достоинства и недостатки интерференционного микроскопа с бипризмой Дове 64
2.4 Автоматизированные методы расшифровки интерферограмм 66
2.4.1 Расшифровка интерферограмм методом Фурье 67
2.4.2 Расшифровка интерферограмм методом фазовых шагов 68
2.5 Выводы 69
Глава 3 Способы получения дифференциальных фазовых изображений в низкокогерентном свете 71
3.1 Выбор источника излучения для интерференционных измерений 71
3.1.1 Применение точечного светодиода 72
3.2 Сдвиговый интерференционный микроскоп с бипризмой Дове 74
3.2.1 Описание экспериментальной установки 74
3.2.2 Достоинства и недостатки оптической схемы 78
3.3 Интерференционный микроскоп на базе сдвигового интерферометра Майкельсона 79
3.3.1 Описание экспериментальной установки 79
3.3.2 Достоинства и недостатки оптической схемы 81
3.4 Анализ формирования дифференциальных фазовых изображений 83
3.4.1 Формирование интерферограмм поперечного сдвига 83
3.5 Анализ пространственно-временных шумов на дифференциальных фазовых
изображениях 92
3.5.1 Понятие о пространственно-временных шумах 92
3.5.2 Алгоритмы расчёта пространственных и временных шумов 94
3.5.3 Экспериментальные результаты 95
3.6 Выводы 97
Глава 4 Применение сдвигового интерференционного микроскопа для получения многоракурсных изображений 99
4.1 Получение трёхмерных изображений фазовых объектов 99
4.2 Получение многоракурсных фазовых изображений на сдвиговом интерференционном микроскопе с бипризмой Дове
4.2.1 Схема экспериментальной установки 100
4.2.2 Получение многоракурсных изображений в коническом пучке 101
4.2.3 Достоинства и недостатки работы установки 104
4.3 Получение многоракурсных изображений на интерференционном микроскопе со сдвиговым интерферометром Майкельсона 104
4.3.1 Описание экспериментальной схемы 104
4.3.2 Получение многоракурсных изображений в параллельном пучке 117
4.3.3 Достоинства и недостатки работы установки
4.4 Методика калибровки углов зондирования 120
4.5 Выводы 123
Заключение 125
Список литературы
- Микроскопы на базе интерферометров общего пути
- Достоинства и недостатки интерференционного микроскопа с призмой Кёстерса
- Сдвиговый интерференционный микроскоп с бипризмой Дове
- Получение многоракурсных изображений на интерференционном микроскопе со сдвиговым интерферометром Майкельсона
Введение к работе
Актуальность темы определяется повышенным интересом к неинвазивным исследованиям различных фазовых объектов со стороны различных отраслей промышленности, физики, биологии и медицины. Важной задачей при исследовании любых фазовых микрообъектов, будь то прозрачные структуры, плазма или биологические объекты (клетки, бактерии и т.д.), является не только их визуализация, но и получение количественных данных об этих объектах с максимально высокой точностью.
Любой фазовый объект характеризуется пространственным распределением показателя преломления, зная которое, возможно рассчитать ряд других физических параметров, описывающих состояние объекта, таких как плотность, температура, концентрация каких-либо веществ внутри объекта и т.п. Для получения информации о распределении показателя преломления, главным образом, применяется метод оптической интерферометрии.
Современная вычислительная техника и полупроводниковые технологии, расширив возможности существующих оптических интерференционных систем, позволили рассчитывать необходимые физические параметры слабоконтрастных микрообъектов по их фазовым изображениям, в каждой точке которых известна оптическая разность хода. Однако, в большинстве случаев, подобные оптические системы работают в когерентном лазерном свете, что, с одной стороны, позволяет с лёгкостью регистрировать интерферограммы, но с другой, не удовлетворяет возрастающим требованиям к точности извлекаемых данных.
Низкая точность количественных фазовых изображений, полученных в лазерном свете, является следствием высокой пространственно-временной когерентности лазерного излучения. Дифракция когерентного света на краях апертуры и любых неоднородностях оптических элементов, многократные переотражения света от оптических поверхностей различных элементов – всё это
ведёт к появлению паразитных интерференционных полос и спекл-структуры, искажающих результирующее изображение.
Единственным способом повысить точность количественных фазовых изображений является снижение степени пространственной и/или временной когерентности излучения.
Существует ряд оптических схем, построенных на базе двулучевых
интерферометров, которые обеспечивают аппаратную реализацию
интерференционных измерений фазовых микрообъектов в низкокогерентном свете. К ним относится известная схема интерференционного микроскопа Линника, автоматизированная модификация которого была разработана во ВНИИОФИ. Данный прибор работает в лазерном свете, который пропускается через быстровращающийся диффузор. Это снижает степень пространственной когерентности, но не изменяет степень временной когерентности, поскольку излучение является монохроматическим. Впоследствии формируются количественные фазовые изображения биологических объектов, однако, из-за того, что исследуемые объекты размещаются на зеркале в предметном канале интерферометра, свет дважды проходит через них. Впоследствии это приводит к удвоению шумов и также накладывает ограничения на оптическую толщину исследуемых объектов.
Количественные фазовые изображения прозрачных объектов предпочтительнее получать в проходящем излучении, что могут обеспечить оптические схемы, построенные на базе классической конфигурации интерферометра Маха-Цандера. Однако предметная и опорная ветви в таком интерферометре пространственно разнесены и его работа в низкокогерентном излучении оказывается затруднительной, поскольку предметный и опорный световые пучки в разной степени подвержены влиянию вибраций и температурных флуктуаций, а кроме этого требуется выравнивать их оптические пути с высокой точностью.
На сегодняшний день во всём мире над решением проблемы получения количественных фазовых изображений с высокой точностью работает несколько экспериментальных групп. Объединяющей тенденцией является применение в
оптических микроскопах интерферометров с совмещёнными ветвями, иначе называемых интерферометрами общего пути, и работа в низкокогерентном излучении.
В интерферометрах общего пути можно сформировать опорный пучок из предметного с помощью точечной диафрагмы методом пространственной фильтрации излучения. Насколько известно, первыми подобный подход применили экспериментальные группы Г.Попеску (G.Popescu, 2006) и Н.Шакеда (N.Shaked, 2012). Их оптические системы обеспечивали получение количественных фазовых изображений биологических микрообъектов в низкокогерентном, но всё же лазерном излучении, потому что для формирования опорного пучка точечной диафрагмой диаметром ~30мкм требуется мощный источник излучения.
Иной подход заключается в применении осветителей с нелазерными источниками, например, светодиодами. Осветитель формирует точечный источник, чтобы обеспечить высокую степень пространственной когерентности излучения для возникновения интерференции, но при этом степень временной когерентности остаётся низкой, поскольку спектр подобных источников достаточно широкий, порядка 50нм.
В области медицинских и биологических исследований детализация внутренних структур исследуемых микрообъектов на фазовых изображениях может оказаться недостаточной. В подобных случаях обеспечивается получение дифференциальных фазовых изображений методом дифференциального интерференционного контраста. Дело в том, что фазовое изображение характеризуется двумерным распределением оптической разности хода излучения, прошедшего через объект, а дифференциальное – градиентом оптической разности хода в направлении поперечного сдвига двух идентичных интерферирующих пучков, благодаря чему визуализируются различные мелкие структуры.
Таким образом, для получения количественных фазовых или дифференциальных фазовых изображений с максимальной точностью интерференционный микроскоп должен работать в проходящем низкокогерентном свете нелазерных источников. На сегодняшний день подобных оптических приборов
для получения количественных фазовых изображений мало, а для получения количественных дифференциальных фазовых изображений практически нет.
Ещё одна современная тенденция, которая особенно проявляется в области биологии и медицины, связана с получением изображений исследуемых микрообъектов со сверхразрешением, а также с обеспечением возможности получения их трёхмерных изображений, т.е. томограмм. Для этого необходима реализация многоракурсного углового зондирования объекта в интерференционном микроскопе, что позволит повысить латеральное разрешение методом синтеза апертур или получать необходимые проекционные данные для последующей томографической реконструкции.
Таким образом, задачи получения количественных фазовых и дифференциальных фазовых изображений прозрачных микрообъектов, а также оснащение интерференционного микроскопа системой многоракурсного углового зондирования представляются весьма актуальными.
Цель и основные задачи диссертации
Разработка и исследование интерференционного микроскопа, обеспечивающего получение высокоточных фазовых и дифференциальных фазовых изображений биологических объектов в проходящем низкокогерентном свете, с возможностью их многоракурсного углового зондирования.
Из цели данной работы вытекают основные задачи, решаемые в данной диссертационной работе:
-
Разработка и исследование интерференционного микроскопа для получения фазовых изображений биологических объектов в низкокогерентном проходящем свете.
-
Разработка и исследование способов реализации метода фазовых шагов в микроскопах с интерферометрами общего пути, построенных на базе различных светоделительных призм.
-
Разработка микроскопа со сдвиговым интерферометром Майкельсона для получения дифференциальных фазовых изображений на бесконечно широкой интерференционной полосе в низкокогерентном проходящем свете.
-
Выбор источника низкокогерентного излучения для получения фазовых и дифференциальных фазовых изображений с минимальным уровнем шумов.
-
Разработка и исследование метода формирования многоракурсных изображений в сдвиговом интерференционном микроскопе.
-
Разработка метода калибровки углов зондирования исследуемого объекта при работе интерференционного микроскопа в режиме многоракурсного углового зондирования.
Научная новизна работы
В работе впервые:
предложена и реализована схема оптического интерференционного микроскопа, работающего в проходящем низкокогерентном свете, для прозрачных объектов, построенного на базе призмы Кёстерса и бипризмы Дове (патент RU 2527316);
предложен и реализован метод фазовых шагов в интерферометре общего пути на базе бипризмы Дове, который заключается в поперечном смещении бипризмы Дове на линейном моторизованном трансляторе, при этом оптическая разность хода между интерферирующими пучками определяется величиной смещения бипризмы и углом наклона зеркала в интерферометре (патент RU 2536764);
- показано методом математического моделирования и экспериментальным
исследованием, что если в сдвиговом интерферометре Майкельсона обеспечивается
поперечный сдвиг между идентичными интерферирующими пучками, величина
которого равна радиусу диска Эйри, характеризующего разрешающую способность
оптической системы, то формируемое фазовое изображение является
дифференциальным и описывается производной оптической разности хода;
- предложен и реализован метод прямой калибровки углов зондирования исследуемого объекта, основанный на методе покадровой съемки с последующей цифровой обработкой полученных изображений.
Практическая ценность и использование результатов работы
-
Предлагаемые схемы интерференционных микроскопов обеспечивают неинвазивное статическое и динамическое исследование различных фазовых микрообъектов в проходящем низкокогерентном свете.
-
С применением дополнительного программного обеспечения по полученным количественным фазовым и дифференциальным фазовым изображениям исследуемых биологических микрообъектов можно рассчитать массу сухих веществ клеток, выполнить морфологический анализ, сравнить параметры схожих объектов, а также изучить динамику клеточной активности.
-
Интерференционный микроскоп, работающий в проходящем низкокогерентном свете, оснащенный системой углового зондирования, позволяет получать многоракурсные проекционные данные, по которым методами томографии возможно восстановление трёхмерных изображений фазовых объектов, а также увеличение латерального разрешения методом синтеза апертур.
Апробация работы
Результаты данной диссертационной работы докладывались на следующих конференциях:
Научно-техническая конференция «Фотометрия и её метрологическое
обеспечение» (Москва, 2013);
III Всероссийская конференция по фотонике и информационной оптике
(Москва, 2014);
III Всероссийский конгресс молодых учёных I секция научной школы «Методы цифровой обработки изображений в оптике и фотонике» (Санкт-Петербург, 2014);
Всероссийская научно-техническая конференция «Метрологическое обеспечение фотоники» (Москва, 2015);
Advanced Microscopy Techniques IV; and Neurophotonics II (Munich, 2015);
V Съезд Биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015).
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, 2 патента на изобретение, 5 тезисов докладов на научно-технических конференциях.
Структура и объём диссертационной работы
Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка литературы и приложений.
Общий объём составляет 136 страниц печатного текста, включая 57 рисунков, одну таблицу, список литературы из 59 источников и 4 приложения.
Основные положения, выносимые на защиту
1. При смещении бипризмы Дове перпендикулярно оптической оси системы, оптическая разность хода между интерферирующими пучками определяется по формуле
tan(a) A(d,a) = 4d 1-
-tan 2 (a)
где d - смещение бипризмы, a - угол наклона зеркала интерферометра.
-
Фазовое изображение описывается производной оптической разности хода в направлении поперечного сдвига между интерферирующими пучками при величине сдвига, равной радиусу диска Эйри.
-
Применение точечного светодиода позволяет снизить уровень пространственных и временных шумов, определяющих точность восстановления производной оптической разности хода, на дифференциальных фазовых изображениях до 1.2нм и 0.5нм, соответственно.
-
Для формирования многоракурсных дифференциальных фазовых изображений на интерференционном микроскопе траектория перемещения изображения точечного источника в сдвиговом интерферометре Майкельсона должна быть параллельна оси наклона зеркала, задающего поперечный сдвиг.
Микроскопы на базе интерферометров общего пути
Современная тенденция в интерференционной микроскопии – это переход к низкокогерентному свету, источником которого служит обычная галогеновая лампа или светодиод. Малая длина временной когерентности исключает возникновение спекл-шума на интерферограммах, однако, для их формирования возникает необходимость построения интерферометра по схеме общего пути, т.е. с пространственно совмещенными объектной и опорной ветвями.
Основное назначение интерферометров общего пути – сформировать опорный пучок из объектного так, чтобы оптическая разность хода между ними была нулевой [21]. Подобный приём, кроме всего прочего, обеспечивает низкую чувствительность интерференционной картины к вибрациям, воздушным потокам и прочим источникам шума, поскольку они одинаково воздействуют на оба интерферирующих пучка, которые проходят в пространстве идентичные оптические пути.
В зависимости от нас тройки интерферометра может быть получено либо фазовое изображение, либо производная фазового изображения, т.е. реализован т.н. метод дифференциального интерференционного контраста. В первом случае один из пучков в интерферометре преобразуется в опорный методом пространственной фильтрации или же, при достаточной длине поперечной когерентности, между интерферирующими пучками выставляется поперечный сдвиг так, чтобы в качестве опорного пучка использовать невозмущенную фазовым объектом часть волнового фронта.
Интерферометры общего пути можно условно разделить на два типа: пучок света сначала проходит через образец, а затем попадает в интерферометр, и, наоборот, пучок света сначала разделяется на два и оба направляются на образец. Последний тип встречается редко, потому что большую популярность приобрели т.н. интерференционные приставки [22] – интерферометры, исполненные в виде законченных модулей, которые можно присоединять к выходу обычного коммерческого микроскопа, расширяя, тем самым, его возможности. Автоматизированный фазоконтрастный микроскоп Цернике
Группа учёных в Иллинойсском университете в Урбане-Шампейне, возглавляемая Г.Попеску разработала подобную интерференционную приставку, расширив возможности обычного фазово-контрастного микроскопа Цернике [23].
Метод получил название SLIM – Spatial Light Interference Microscopy или «интерференционная микроскопия на базе пространственного модулятора света». Основная идея заключается в комбинации метода фазового контраста Цернике и голографии Габора [23].
На выход микроскопа устанавливается оптический модуль (рис.1.10а), который представляет собой 4f оптическую систему, образованную двумя фурье-объективами (Fourier lens L1 и L2). Её передняя фокальная плоскость совмещена с выходной плоскостью (Image plane) микроскопа, а в задней плоскости помещается регистратор – ПЗС-матрица (CCD).
Внутри 4f оптической системы в фурье-плоскости располагается пространственный жидкокристаллический модулятор света, который работает на отражение. Модулятор управляется от компьютера и сдвигает фазу нерассеянного излучения, сфокусированного вблизи оптической оси, т.е. он работает как переменный фазовый фильтр Цернике. Сам фильтр имеет форму кольца, поскольку в конденсоре микроскопа используется кольцевая диафрагма, а пучок, отраженный от фильтра, является опорным. Свет, который претерпел дифракцию на объекте, выходит за пределы кольцевого фильтра и отражается от остальной части модулятора, образуя, тем самым, объектный пучок. На выходе 4f оптической системы оба пучка сводятся под нулевым углом и в плоскости ПЗС-матрицы регистрируется интерферограмма.
Так как один из пучков света сформирован из излучения, рассеянного на объекте, то такую интерферограмму можно рассматривать как голограмму Габора [6], а поскольку пучки сводятся под нулевым углом, для восстановления фазового изображения (рис.1.10c) применяется метод фазовых шагов. В данном случае используется четыре интерферограммы со сдвигом фазы на /2 (рис.1.10b).
Основной недостаток данного интерференционного микроскопа заключается в использовании дорогостоящего фазового жидкокристаллического модулятора света. Другой недостаток связан с тем, что для получения количественной информации о фазовом объекте используется более сложная математическая процедура, чем в обычном методе фазового сдвига. В частности требуется дополнительная регистрация амплитудного изображения, сформированного из рассеянного излучения, нормированного на амплитуду нерассеянного излучения.
Той же группой Г.Попеску был предложен [24] второй вариант интерференционной приставки к фазово-контрастному микроскопу Цернике. Установка, представленная на рисунке 1.11, имеет сходство с предыдущей, однако, пространственный жидко-кристаллический модулятор света в данном случае работает в проходящем излучении и по иному принципу, который заключается во вращении жидких кристаллов.
Модулятор установлен в фурье-плоскости 4f оптической системы, образованной фурье-линзами Fourier Lens 1 и Fourier Lens 2, а также между вспомогательными поляризаторами (Polarizer, Analyzer). Его задача заключается в том, чтобы обеспечить регистрацию на ПЗС-матрице (CCD) сначала двух амплитудных изображений, промодулированных по яркости, а после – двух фазовых изображений, промодулированных по фазе.
Достоинства и недостатки интерференционного микроскопа с призмой Кёстерса
Интерферометры общего пути, ещё известные как интерферометры с совмещенными ветвями [21], имеют существенное преимущество, по отношению к классическим двулучевым интерферометрам, в которых опорное и предметное плечи широко разнесены в пространстве.
В интерферометрах общего пути и предметное, и опорное плечо пространственно совпадают, что нивелирует вибрации и температурные колебания, воздействующие на оптическую схему. Однако самым примечательным является нулевая разность оптического хода интерферирующих пучков в центре поля зрения, что позволяет использовать как некогерентные источники белого света, так и светодиодные источники с малой длинной временной когерентности.
Разделение пучков возможно при помощи точно изготовленных светоделительных призм, двулучепреломляющих кристаллов, полупрозрачных пластин и т.д., однако, не все светоделительные элементы способны обеспечить нулевую разность хода после разделения пучков.
Стоит отметить, что конфигурация оптическая схемы микроскопа, в состав которого входит интерферометр общего пути, может обеспечивать два варианта прохождения светового пучка. В первом случае световой пучок может быть разделен на два идентичных и сдвинутых друг относительно друга на малую величину, после чего оба пучка проходят через объект, а затем сводятся для получения интерференции. Подобная конфигурация реализована в поляризационном микроскопе Номарского [29]. Во втором случае световой пучок проходит через объект, а после него попадает в интерферометр общего пути, где так же разделяется на две части. Второй вариант более предпочтителен, поскольку позволяет адаптировать интерферометр под разные задачи. Например, при исследовании фазовых объектов, линейные размеры которых много меньше длины поперечной когерентности излучения, световые пучки на выходе интерферометра можно сдвинуть друг относительно друга так, что возмущенная часть волнового фронта будет интерферировать с невозмущенной. Как следствие, восстановленное фазовое изображение будет содержать информацию об оптической разности хода, обусловленной исследуемым объектом.
Обычно на практике линейные размеры объектов превышают длину поперечной когерентности излучения нелазерных источников, поэтому поперечный сдвиг малой величины приводит к формированию дифференциального интерференционного контраста. Однако если интерферометр помещен внутри 4f оптической системы, то в общей фокальной плоскости возможна пространственная фильтрация одного из пучков и, как следствие преобразование его в опорный с плоским волновым фронтом.
В качестве основы интерферометра общего пути в данной работе рассматривалось несколько вариантов светоделительных призм. Все призмы обеспечивали амплитудное деление падающего светового пучка на два, равных по интенсивности. Светоделительная призма Кёстерса Обычно данная призма используется в нуль-индикаторах для интерференционных измерений угла поворота объекта [36]. Призма Кёстерса представляет собой склейку из двух призм. В основе каждой – треугольники с углами при вершинах 30, 60 и 90. Склейку делают так, что в основании призмы получается равносторонний треугольник, а между соприкасающихся граней находится полупрозрачное покрытие.
Из рисунка 2.1 можно видеть, что световой пучок падает вдоль нормали к боковой грани призмы Кёстерса. Затем он делится на два идентичных пучка, лежащих в одной плоскости и выходящих из призмы строго параллельно друг другу. Рисунок 2.1. Ход лучей в призме Кёстерса
Однако применение призмы Кёстерса в качестве светоделителя в интерферометре имеет условный недостаток, заключающийся в том, что падающий световой пучок и пучки на выходе распространяются под углом друг к другу. Это усложняет сборку и юстировку оптических элементов интерференционного микроскопа.
Аналогично призме Кёстерса бипризма Дове является склейкой из двух призм Дове. В основе каждой – равнобедренная трапеция, а склейку делают так, чтобы соприкасались грани с наибольшей площадью. На границу раздела двух призм также нанесено полупрозрачное покрытие.
На рисунке 2.2 показано, что падающий на призму световой пучок и выходящие после разделения световые пучки параллельны др уг другу. Данное свойство как в случае применения бипризмы Дове, так и призмы Кёстерса в качестве светоделительного элемента интерферометра, позволяет использовать только одно зеркало для сведения световых пучков в обратном ходе.
Сдвиговый интерференционный микроскоп с бипризмой Дове
В данном параграфе приводи тся описание экспериментальной установки, которая обеспечивает формирование сдвиговых интерферограмм с их последующей расшифровкой методом фазовых шагов. Получаемое дифференциальное фазовое изображение аналогично изображению, которое может быть получено в микроскопе дифференциального интерференционного контраста, но без использования поляризационной оптики.
В параграфе 2.3 подробно описывалась оптическая схема интерференционного микроскопа с бипризмой Дове, при помощи которого можно получать фазовые изображения прозрачных объектов. Однако из-за проблемы малой мощности имевшихся источников низкокогерентного излучения и, как следствие, недостаточной яркости опорного пучка, получить качественные фазовые изображения не удалос ь. По этой причине в оптическую схему были внесены незначительные изменения – исключена точечная диафрагма, формирующая опорный пучок. Это привело к изменению режим работы интерферометра. Новая оптическая схема интерференционного микроскопа представлена на рисунке 3.3.
В качестве осветителя в данной схеме использовался обычный светодиод LED (Thorlabs M530D1, 530нм) с конденсорной линзой L1, фокусирующей излучение на диафрагме D. Задача диафрагмы D – сформировать вторичный точечный источник с высокой пространственной когерентностью. Излучение точечного источника преобразуется линзой L2 в параллельный пучок, проходящий через микрообъектив MO1 (Olympus UPLFLN 100х O2, NA1.3).
На вставке показан ход лучей после микрообъектива MO1: пучок фокусируется, а затем расходится. Софокусно с MO1 установлен второй микрообъектив MO2 (Olympus UPLFLN 100х O2, NA1.3), собирающий расходящийся пучок и преобразующий его снова в параллельный.
Между микрообъективами за передней фокальной плоскостью микрообъектива MO2 располагается исследуемый образец, находящийся в капле раствора NaCl 0.9% между двух покровных стёкол. Воздушный зазор между микрообъективами и покровными стёклами сверху и снизу заполнен иммерсионным маслом.
Микрообъектив MO2 и объектив L3, установленные софокусно, образуют простейший инвертированный микроскоп светлого поля (без учёта осветителя). Излучение, рассеянное образцом, попадает в микроскоп и в его задней фокальной плоскости формируется промежуточное увеличенное изображение.
После микроскопа световой пучок попадает в 4f оптическую систему, образованную парой софокусных фурье-объективов L4 и L5. Передняя фокальная плоскость 4f системы пространственно совмещена с задней фокальной плоскостью микроскопа. Внутри 4f системы до её общей фокальной плоскости расположена бипризма Дове, проходя через которую световой пучок делится на два идентичных. Сама бипризма закреплена на линейном моторизованном трансляторе (Standa 8MT175-50) и может перемещаться в направлении, перпендикулярном падающему световому пучку. В общей фокальной плоскости находится зеркало M2, на поверхности которого отсутствует точечная диафрагма. Само зеркало закреплено в кинематической оправе (Thorlabs KM 100), которая обеспечивает его наклон вокруг оси, параллельной отражательной поверхности зеркала. Оба пучка беспрепятственно отражаются от зеркала M2, при ненулевом наклоне которого между пучками ними возникает угловой сдвиг. Поскольку зеркало M2 находится в передней фокальной плоскости фурье-объектива L5, угловой сдвиг будет на выходе 4f системы будет преобразован в поперечный. В результате на ПЗС-матрице (Videoscan-285) возникнет сдвиговая интерферограмма исследуемого объекта.
Также за общей фокальной плоскостью 4f оптической системы находится уголковый отражатель, собранный из зеркал M3 и M4. Уголковый отражатель закреплён вместе с бипризмой Дове на линейном трансляторе (на рис.3.3 не показано) и его главное назначение, как говорилось ранее, заключается в нивелировании смещения интерферограммы на ПЗС-матрице при работе линейного транслятора.
Получение многоракурсных изображений на интерференционном микроскопе со сдвиговым интерферометром Майкельсона
Величина сдвига в пикселях может быть представлена в метрических единицах. В используемой ПЗС-матрице (Imperx ICL-B1411) размер сенсора составляет 1392х1040 пикселей. В качестве объекта устанавливается полистирольный шар диаметром \мкм. Покровные стёкла с объектом перемещаются перпендикулярно оптической оси микроскопа с помощью прецизионного трёхкоординатного столика, оснащённого дифференциальными микрометрами (Thorlabs РТЗА/М). Один полный оборот винта точной подстройки обеспечивает линейное перемещение полистирольного шара на 25 мкм. При этом изображение шара в поле зрения камеры перемещается из одного края в другой в горизонтальном направлении на -1000 пикселей. Отсюда следует, что цена деления одного пикселя 25А«Ш/1000 «25нм. В таком случае, несложно пересчитать диапазон значений величины поперечного сдвига S = (10...20 пикселя) 25нм = 250...500ШІ.
Одним из главных достоинств сдвигового интерферометра является зависимость чувствительности от величины поперечного сдвига [52], что подтверждает выражение (13): чем меньше сдвиг, тем более точно искомое распределение описывается производной и тем меньшие фазовые неоднородности удастся разрешить. С другой стороны, разрешение всей оптической системы определяется, главным образом, характеристиками микрообъектива (Olympus UPLFLN 100х 02, NA1.3). Его латеральное разрешение зависит от радиуса диска Эйри, который можно оценить, как R &0.61Л / ЫА = 305нмпри длине волны излучения Я = 650нм . Иными словами, устанавливать поперечный сдвиг между интерферирующими пучками меньше, чем размер диска Эйри бессмысленно, поскольку линейные структуры, поперечный размер которых меньше величины R, разрешить нельзя. Также бессмысленно делать сдвиг больше радиуса диска Эйри (при S 20, см. табл.1), т.к. в этом случае фазовое изображение описывается явно не производной.
Несложно заметить, что величина радиуса диска Эйри лежит в экспериментально найденном диапазоне допустимой величины сдвига S между интерферирующими пучками. Отсюда следует, что фазовое изображение описывается производной оптической разности хода в направлении поперечного сдвига между интерферирующими пучками при величине сдвига, равной радиусу диска Эйри, т.е. при S » 305нм формируется дифференциальное фазовое изображение. Данное утверждение является вторым научным положением. На рисунке 3.1 несложно заметить качественную разницу между фазовым изображением, полученным в лазерном когерентном излучении, и изображением, полученным в низкокогерентном излучении светодиода. Однако помимо качественной оценки также важна и количественная оценка уровня шумов на фазовых изображениях, поскольку её физический смысл заключается в определении предельной чувствительности к изменению оптической разности хода.
Данный параграф посвящён понятию пространственно-временных шумов и их оценке при использовании различных источников излучения в работе интерференционного микроскопа, построенного на базе сдвигового интерферометра Майкельсона и описанного в параграфе 3.3.
Для анализа уровня шумов использовался пустой образец, т.е. два покровных стекла, скреплённые раствором хлорида натрия, без каких-либо фазовых объектов между ними. Это позволило получить фазовые изображения фона, которые затем подвергались последующему анализу.
В ходе многократно повторяющихся измерений фазового объекта важно знать, с какой погрешностью воспроизводится значение оптической разности хода в произвольной точке поля зрения. В качестве оценки данного параметра применяется понятие уровня пространственно-временных шумов, который так же называют пространственно-временной стабильностью [24, 42].
При отсутствии неоднородностей оптическая разность хода двух плоских волн, сходящихся под нулевым углом, будет постоянна. Как следствие, яркость интерференционной картины в любой точке ПЗС-матрицы ( x, y) будет одинакова. Однако в реальном эксперименте равномерной яркости интерференционной картины добиться невозможно, поскольку возникают искажения волновых фронтов интерферирующих пучков, которые могут носить как постоянный, не зависящий от времени, так и случайный характер.
Понятие уровня пространс твенных шу мов вводится для одного фазового изображения и характеризует минимально различимое изменение оптической разности хода, обусловленное фазовым объектом, при переходе от точки к точке в пределах поля зрения.
При работе в когерентном лазерном свете, который рассеивается на различных оптических неоднородностях и многократно отражается от оптических поверхностей, возникает спекл-структура, которая ухудшает детализацию фазового изображения. Чтобы достичь обратного эффекта, необходим переход к источникам с малой длиной когерентности, например, к светодиодам. С устранением спекл-структуры могут проявиться другие причины, препятствующие увеличению пространственной фазовой чувствительности, а именно пыль и загрязнения на оптических поверхностях, которые следует устранять. Иных способов для повышения пространственной фазовой чувствительности не существует [5].
Понятие уровня временных шумов вводится для серии фазовых изображений. Данная величина характеризует минимально различимое изменение оптической разности хода, обусловленное динамическими процессами внутри исследуемого объекта, в фиксированной точке фазового изображения.
Уровень временных шумов является более важным параметром, чем уровень пространственных шумов. Это становится очевидным, когда, например, необходимо исследовать флуктуации мембраны эритроцита, что требует чувствительности к изменению оптической разности хода порядка 1нм [5].