Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов Метелкин, Александр Николаевич

Содержание к диссертации

стр.

ВВЕДЕНИЕ 7...

Список аббревиатур и условных обозначений

ГЛАВА I - ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ^Г~~"

Часть I - Состав, строение и форма эритроцитов

1.1. Современные представления о структуре

эритроцитов человека її...

1. Форма и размеры эритроцитов її...

2. Взаимосвязь формы эритроцитов и их функциональной активности в норме и

патологии^. ...т?...

Часть 2 - Методы измерения размеров, формы эритроцитов

и содержания в них гемоглобина ??...

1. Традиционные методы измерений 25...

2. Современные методы лабораторного анализа с применением лазерной

техники и голографии ?9...

ГЛАВА П - МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Объект исследования

2. Методы исследования 38...

2.1. Голографическая интерференционная

микроскопия. ??...

Z.I.I. Метод реального времени..... .?...

2. Анализ интерференционного поля 7т...

3. Чувствительность голографической микроинтерферометрии . .

4. Голографический интерференционный микроскоп:

A. Схемы микроскопа. Получение голограмм 7т...

Б. Система усреднения когерентных оптических

шумов .. .

B. Пути совершенствования схемы

микроскопа

2.

2.1.5. Методики количественной оценки формы,
размеров эритроцитов, массы и концент
рации плотных веществ в клетках по
данным голографической интерферометрии .т..

A. Получение интерферограмм эритроцитов..

Б. Линейные размеры и параметры формы

эритроцитов .?..

B. Измерение массы и концентрации

плотных веществ в эритроците г?..

2.2. Микроскопия в когерентном свете ??..

2.2.1. Микроскопия в проходящем свете:

A. Анализ эритроцитов в когерентном свете 1т..

Б. Оценка разрешающей способности лазерной

и голографической микроскопии * ....1?..

B. Измерение геометрических параметров
эритроцитов в монетных столбиках . ..11..

2.2.2. Микроскопия в отраженном свете 1?..

2.3. Погрешности измерений количественных

характеристик эритроцитов 1?..

ZA. Метод светорассеяния г?..

Обсуждение результатов ??..

- СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ Б НОРМЕ, ПРИ НАРУШЕНИЯХ СОСТАВА ПЛАЗМЫ И МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ

1. Размеры и форма эритроцитов .?...

1.1. Сравнительная характеристика линейных

размеров эритроцитов ??..

1.2. Форма эритроцитов .....;..

2. Площадь поверхности, объем и коэффициент

сферичности 104..

3. Связь коэффициента сферичности с осмотической

105
резистентностью эритроцитов т...

4. Теоретический анализ полученных результатов

на основе явления фрагментации ?..

5. Сравнительная характеристика эритроцитов
в норме и при наследственном микросфероцитозе
по массе и концентрации гемоглобина тт?

Обсуждение результатов . т.т

ГЛАВА 4 - СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ ФОРМЫ ЭРИТРОЦИТОВ В НОРМЕ И ПРИ НАСЛЕДСТВЕННОМ МИКР0СФЕР0ЦИТ03Е

1. Анализ изменений формы эритроцитов

здоровых детей тт?

2. Анализ эритроцитов при наследственном

микросфероцитозе . . .

Обсуждение результатов ^7.. ..7..

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Щ

ВЫВОДЫ Щ

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ Ї??

Приложение /Акты о внедрении, отзывы/ 7.7

Введение к работе

Актуальность темы. Расширение и углубление представлений о жизнедеятельности эритроцитов периферической крови _v непосредственно связано с внедрением в практику новейших методов

исследования. Этим определяется актуальность проблемы изучения не
фиксированных эритроцитов человека с целью изучения и количествен
ной оценки их размеров, формы, массы и концентрации гемоглобина в
норме и патологии методами голографической интерферометрии и лазер
ной микроскопии.

Б литературе имеется сравнительно мало работ, посвященных анализу свойств нефиксированных эритроцитов, что объясняется трудностями исследования живых клеток. Традиционные методы анализа размеров эритроцитов, как правило, позволяют получать усредненные дан-I ные, что делает невозможным оценку внутренней структуры популяции эритроцитов. Даже такие современные методы исследования как элект-ронная микроскопия /трансмиссионная и растровая/, требуют фиксации клеток, что приводит к определенному изменению их истинных разме-

ров и значительно эатрудняет изучение эритроцитов г динамике.

Методы голографической интерферометрии и лагерной микроскопии
лишены описанных недостатков и позволяют исследовать живые клетки,
v анализировать форму эритроцитов по их поперечному сечению /91/%
Ш производить количественную оценку формы //3#, измерять объем и

площадь поверхности эритроцитов, определять концентрацию внутриклеточных веществ /32/' Новые цитоморфометрические методы - гологра-фическая интерферометрия и лазерная микроскопия - позволяют проводить оценку состояния эритроцитов в динамике по таким важнейшим па-. раыетран как форма и размеры, масса и концентрация плотных веществ в клетке. В настоящее время в Советском Союзе и за рубежом не имеется специальной голографической аппаратуры для исследования биоме-

5.

дицинских микрообьектов. В- связи с вышеизложенным представляются актуальнымицели и задачи данной работы.

Целями исследования являлись:

1. Выбор и реализация наиболее оптимальной схемы лазерного, голографического интерференционного микроскопа для анализа биологических микрообьектов, разработка количественных методик оценки размеров, формы, массы и концентрации гемоглобина в эритроцитах.

2. Проведение сравнительной характеристики свойств популяций эритроцитов в норме и патологии. Сопоставление полученных новыми методами результатов с известными данными. Количественный и качественный анализ основных преобразований формы и размеров эритроцитов в норме, при наследственных изменениях цитонембраны эритроцитов и при нарушениях состава плазмы.

Задачи работы:

3. Выбор и реализация наиболее оптимальной схемы лагерного, голографического интерференционного микроскопа для получения высококачественных интерферогранн и микрофотографий живых клеток.

4. Разработка количественных методик анализа эритроцитов на основе данных голографической интерферометрии и лазерной микроскопии по следующим параметрам: диаметр, максимальная и минимальная толщина, площадь поверхности, объем, коэффициент сферичности эритроцитов, масса и концентрация гемоглобина в клетках. Выработка количественных критериев оценки эритроцитов по их поперечному сечение.

5. Анализ свойств нефиксированных эритроцитов /на основе методик количественной и качественной оценки состояния клеток/ в норме, при нарушениях ионного состава плазмы /диффузный гломерулонефрит/, содержания глюкозы /сахарный диабет/ и при нарушениях свойств цито-мембраяы эритроцитов /наследственный микросфероцитоз/.

6. Сравнительная характеристика эритроцитов в норме и наслед-

6.

ственном ыикросфероцитозе в исследованияхЬптгФх) при индуцированных изменениях формы клеток от дискоидальной до сферической / количественная и качественная оценка/.

Научная новизна. Количественные данные, полученные на препаратах без изменения нативных свойств клеток с использованием оригинальных количественных методик интерференционного анализа, указывают на однозначную взаимосвязь между формой, размерами эритроцитов, массой и концентрацией в них гемоглобина. Характер взаимосвязи одинаков для эритроцитов в норме и при наследственном микросфероци-тозе /НС/. Выявлено полное отсутствие истинных сфероцитов в плазме крови детей больных НС. Установлено, что увеличение сферичности эритроцитов при данном заболевании связано с уменьшением площади - поверхности клеток. Исследование йъъто явления перехода эритроцитов от двояковогнутого диска к сфере в норме и при НС показало, что этот переход в обоих случаях представляет собой последовательный обратимый процесс, однако форма поверхности эритроцитов сферической формы в норме и при НС различна. Установлено, что переход от диска к сфере у эритроцитов больных НС происходит при меньших физико-хи-мическнх воздействиях, что указывает на увеличенную способность эритроцитов к сферудяции при данном заболевании.

Наиболее существенные результаты: I/ На основе отечественной аппаратуры создан оригинальный макет голографического микроскопа, который дает возможность методами интерферометрии и лазерной микроскопии проводить количественную и качественную оценку состояния эритроцитов в динамике. 2/ Получены экспериментальные данные, позволяющие в количественном отношении анализировать форму эритроцитов, измерять площадь поверхности, объем клеток, массу гемоглобина и его концентрацию в эритроцитах без окраски и фиксации, что дает возможность изучать в динамике процессы сферуляции эритроцитов и отщепления микронузырьков от поверхности

7.

эритроцитов. 3/ Анализ параметров поперечного сечения эритроцитов и их интерферограмн позволил выявить следующие закономерности: а/ при уменьшении диаметра эритроцитов происходит изменение формы центральной и периферической части клеток и сдвиг максимальной толщины к центру; б/ с уменьшением диаметра эритроцитов наблюдается уменьшение площади поверхности клеток и массы гемоглобина, увеличение его объемной концентрации; в/ распределение эритроцитов в зависимости от их диаметров носит полимодальный характер с наличием пяти пиков. Эти закономерности характерны для эритроцитов как в норне так и при патологических состояниях. 4/ Не показано достоверных различий между эритроцитами в норме при диффузном гломерулонефрите и сахар-нон диабете по измеренным параметрам. Эритроциты больных наследственным микросфероцихозон в аутоплазне инеют форму утолщенных двояковогнутых дисков с уменьшенной площадью поверхности и неизменным объемом, что соответствует снижению коэффициента сферичности клеток при данной заболевании по сравнению с норной. 5/ Наблюдаемое в экспериненте изменение форны эритроцитов от дискоидальной до сферической представляет собой обратиный процесс, который сопровождается уменьшением общей площади поверхности без значительного изменения объема. Этот переход не зависит от природы действующего фактора и является специфической реакцией эритроцитов на внешние воздействия. Эритроциты при наследственном микросфероцитозе переходят в сферическую форну при меньших по сравнению с норной воздействиях на клетки.

Эхперинентальные работы по созданию пакета голографического интерференционного микроскопа для биомеднцин-ских исследований проведены во ВНИИ оптико-физических измерений под научным руководством д.т.н. В.М.Гинзбург. Исследование эритроцитов в норме и патологии проведено на базе лаборатории гормональной диагностики 2-го Московского ордена Ленина Государственного недицинско-

и.

го института имени Н.И.Пирогова под руководством д.м.н., профессора Князева Ю.А.

Хочется поблагодарить директора ВНИИ оптико-физических измерений профессора Степанова Б.М. за постоянную поддержку и помощь в развитии работ по внедрению новых методов в биомедицинские исследования; директора МНИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РСФСР, профессора Вельтищева Ю.Е. за помощь г организации клинической базы исследований, за участие в обсуждении результатов работы; зав.лабораторие! гемоцигологии ЦНШЩЧЖ, профессора Козинца Г.И. за ценные замечания по гематологической части работы.

Хочется также поблагодарить сотрудников кафедры факультативной педиатрии А.Г.Румянцева и В.Н.Панина и сотрудников лаборатории гормональной диагностики Л.Ф.Марченко и Г.В.Тананойу.Й-го МОЛГМИ, а также зав.отделением 1-ой детской клинической больницы А.Г.Таладае-ва, сотрудников МНИИ педиатрии и детской хирургии - Капелько М.А., Цветкову Т.В. и Титова Г.Н. за участие в обсуждении результатов работы, помощь в подборе клинического материала; сотрудников ВНИИ оптико-физических измерений - Преснякова Ю.П., Гордеева А.П., Лехциера Е.Н. за помощь в математической обработке и физической Сі ^ /гврпретации экспериментальных данных, за ценные замечания по оформлению работы.

список

АББРЕВИАТУР И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

Н - норма, практически здоровые дети ,

ДГН - диффузный гломерунонефрит

СД - сахарный диабет

НС - наследственный микросфероцитоз

Н&А, НЬР, Н6Р - различные типы молекул гемоглобина, различающиеся по

сочетанию полипшшдных цепей

HfiS - патологический тип гемоглобина, вызывающий нарушение формы эритроцитов при серйовидноклеточной анемии

'jJTjff- цепи - типы полипемтидных цепей, входящих в состав молекул

-(гемоглобина.

2,3 - ДФГ -2,3 - дифосфоглицериновая кислота

Г-б - ФДГ - Гл|юкозо- -фосфат- дегидрогеназа

* НАД - нийотинамидадениндинукйбтид

АТФ - аденазштрифосфат

СДЗ. - средний диаметр эритроцита

СОЭ - средний объем эритроцита

* СПЗ - средняя площадь эритроцита
Т - средняя толщина эритроцита

К_Сф - средний коэффициент сферичности

* РЭМ - растровый электроннй микроскоп
Ш Об - объектив

Ш - мнимое изображение Г - голограмма

ф - фоторегистрирующее устройство: фотоаппарат, киноаппарат.
\ телекамера

v z - оптический путь

А- длина волны лазера

5~ ширина интерференционной полосы / период полос /

10. Б 0 _- абсолютная чувствительность интерференционного метода д^- - смещение интерференционных полос Л*- - разность хода

о - число интерференционных полос на единицу длины в плоскости

объекКа^ w - показатель преломления д Р - амплитуда колебания лазерного луча А4-л4-гелий-неоновый яазер

Ф(у,ч) - фазовое возмущение, вносимое объектом в предметную волну ТЫ*у) - толщина объекта и, ал. - разрешающая сила микроскопа А - численная апертура микрообъектива сіи*.. - разрешающая сила голографического микроскопа L - ток ФЭУ О - диаметр эритроцита R - радиус эритроцита // - максимальная толщина эритроцита /и - минимальная толщина эритроцита р - диаметр лазерного луча аДс,с6 - основные параметры формы эритроцита Кч> К?д ~ производные параметры формы эритроцита

C_v ~ объемная концентрация внутриклеточных веществ т/ - масса плоеных веществ в эритроците

X - характеристический коэффициент, связывающий показатель преломления /я/ и концентрацию /Cv/ растворенных веществ S э, ~ площадь поверхности эритроцита Vs. " объем эритроцита Ке<р. - коэффициент сферичности.

/л