Введение к работе
Актуальность темы. Практическая потребность в аналитических средствах, использующихся в медицине, химии, биотехнологии и экологии, основанных на чувствительных и высокоэффективных методах анализа и контроля твёрдых и жидких сред вызвала интенсивное развитие комбинированных методов. В этих методах совмещены стадии предварительного концентрирования и разделения сложных смесей на компоненты, а также способы качественного и количественного определения искомых компонент. Среди этих методов разделения веществ важное значение занимает электрофорез, получивший всеобщее признание как наиболее удобный для исследования образцов, представляющих собой сложные многокомпонентные смеси неизвестного состава. Современные технические приемы, используемые в электрофорезе, в общем случае можно разделить на две большие части по принципу проведения процесса - это электрофорез на плоскости (классический) и капиллярный электрофорез. Быстрое развитие техники капиллярного электрофореза (КЭ) было обусловлено разработкой высококачественных кварцевых капилляров с равномерным внутренним диаметром 10-200 мкм, имеющих высокую прозрачность в УФ-области. В результате этого удалось улучшить как разделение многокомпонентных смесей, так и возможности детектирования отдельных компонент. Специфической особенностью КЭ является малая по объему измерительная ячейка, определяемая внутренним диаметром капилляра, вследствие чего возникают проблемы, связанные с низким уровнем полезного сигнала.
В последние годы КЭ наиболее активно и успешно применяется для определения последовательности ДНК, изучении наследственности, мутаций и в других генетических исследованиях. Такие исследования, как правило, характеризуются малыми количествами пробы и низкими концентрациями исследуемого вещества. В силу этой особенности, а также учитывая малый объём измерительной ячейки необходимо дальнейшее совершенствование
эксплуатационных характеристик систем КЭ и повышение чувствительности детектирования.
Целью диссертационной работы является создание флуориметрического детектора с высокой чувствительностью, предназначенного для использования в приборах капиллярного электрофореза.
Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:
Изучить влияние отражённого от капилляра излучения на чувствительность измерений;
Разработать оптическую систему детектора, обеспечивающую прецизионную автоматическую юстировку излучения, возбуждающего флуоресценцию в центре капилляра и оптимизировать элементы детектора;
Исследовать процесс фоторазложения красителей, используемых в приборах КЭ в качестве флуоресцентных меток, при их взаимодействии с лазерным излучением, с целью оптимизации условий измерений, обеспечивающих достижение наибольшей чувствительности;
Разработать на основе полученных результатов приборы КЭ для лабораторных биохимических анализов с чувствительными флуориметрическими детекторами на базе лазерных источников возбуждения.
Научная новизна.
1. Разработана оригинальная схема флуоресцентного детектора для КЭ,
обеспечивающая высокую чувствительность за счёт оптимизации условий
освещения цилиндрического капилляра.
Предложена оригинальная схема автоматической фокусировки лазерного луча точно в центр капилляра с помощью многоэлементного фотоприёмника, основанная на совмещении пучков, отражённых от 4-х поверхностей капилляра.
Показано, что для достижения наибольшей чувствительности флуоресцентных измерений константа скорости поглощения света молекулой, используемой в качестве флуоресцентной метки, должна быть близкой по
величине к константе скорости флуоресценции.
Практическая ценность работы.
В работе были получены следующие результаты, получившие внедрение в конкретные разработки приборов КЭ:
предложена базовая оптическая схема флуориметрического детектора, отличающаяся низкой фоновой засветкой фотоприёмника и прецизионной автоматической юстировкой лазерного луча в центр капилляра;
на основе проведённых в работе исследований предложена практическая методика по определению оптимальной интенсивности возбуждающего света для систем КЭ.
разработаны системы капиллярного электрофореза с одноканальным и четырёхканальным флуоресцентными детекторами.
Основные результаты, выносимые на защиту.
1. Показано, что условия освещения кварцевого капилляра и способ
автоматической юстировки луча лазера в центр капилляра, предложенные в
работе, позволяют достичь предельной чувствительности анализа в приборах
КЭ, использующих флуоресцентные детекторы.
Показано, что выбор мощности источника возбуждения флуоресценции рекомендуемой для использования в приборах КЭ, полученный на основе проведенных в работе исследований, имеет благодаря минимизации уровня шума оптимальное значение, при котором обеспечивается наибольшая светоотдача флуоресцентных красителей, что обеспечивает повышение чувствительности анализа в тех случаях, когда молекулы имеют высокую электрофоретическую скорость.
Методика, позволяющая определять оптимальную мощность возбуждения флуоресцентной метки в капилляре применительно к анализу молекул в тех случаях, когда их электрофоретическая скорость низкая.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семинарах лаборатории в Институте Аналитического Приборостроения РАН (С.-Петербург), а также были представлены на Всероссийской конференции
«Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 11-15 апреля 2000); научной и учебно-методической конференции СПбГУ ИТМО (С.-Петербург 3-6 февраля 2004).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 6 статьях и тезисах докладов, а также получен патент на изобретение.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка литературы и приложения. Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков, 4 таблиц и 69 библиографических ссылок на литературу.