Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Малая ГТФаза Arf6. 21
1.1. Общая характеристика белков семейства Arf 21
1.2. Структура и механизмы функционирования белков Arf 23
1.3. Механизмы регуляции Arf6. Белки GEF и GAP. 30
1.4. Функции Arf6 в клетке. 38
1.4.1. Метаболизм фосфолипидов. 38
1.4.1.1. Arf6 активирует PIP5K, стимулируя образование PI(4,5)P2 38
1.4.1.2. Arf6 активирует PLD – фермент, продуцирующий ФК и активирующий mTOR . 40
1.4.1.3. Arf6 и другие липиды. 48
1.4.2. Arf6 и эндоцитоз. 49
1.4.2.1. Arf6 в клатрин-зависимом эндоцитозе 51
1.4.2.2. Arf6-зависимый клатрин-независимый эндоцитоз
1.4.3. Arf6 и рециклирование эндосом 54
1.4.4. Неспецифическое влияние Arf6 на мембранный транспорт
1.4.4.1. Изменение кривизны мембраны 55
1.4.4.2. Регулирование актинового цитоскелета
1.4.5. Arf6 и экзоцитоз 59
1.4.6. Arf6 в процессах миграции, инвазии и метастазирования. 61
Глава 2. Материалы и Методы
2.1. Клеточные линии 65
2.2. Выделение нуклеиновых кислот
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК 65
2.2.2. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
2.3. Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях 67
2.4. Молекулярное клонирование
2.4.1. Получение компетентных клеток E. coli 67
2.4.2. Трансформация компетентных клеток E. coli 68
2.4.3. Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 68
2.4.4. Реакция лигирования 69
2.4.5. Клонирование предшественников малых шпилечных РНК 2.5. Трансфекция 70
2.6. Инфекция псевдовирусными частицами. 71
2.7. Анализ белков
2.7.1. Приготовление клеточных лизатов 72
2.7.2. Вестерн-блот гибридизация 73
2.7.3. Стимуляция ERK1/2 эпидермальным фактором роста 75
2.7.4. Анализ активности PLD 75
2.7.5. Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ 76
2.7.6. Анализ желатиназной активности 77
2.7.7. Анализ активности uPA 77
2.8. Исследование клеточных характеристик in vitro 78
2.8.1. Анализ динамики роста клеток 78
2.8.2. Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность) 78
2.8.3. Выделение ядер клеток и проведение исследования клеточного цикла на проточном цитофлуориметре 78 2.9. Статистическая обработка результатов 79
2.9.1. Денситометрия 79
2.10. Растворы, реагенты и среды 79
Глава 3. Результаты 83
3.1. Исследование влияния Arf6 на пролиферацию и активность белков, ассоциированных с опухолевой прогрессией, в клетках глиобластомы человека 84
3.1.1. Выбор основной экспериментальной модели. 84
3.1.2. Получение производных клеточных линий глиобластомы человека с продукцией экзогенного белка Arf6 86
3.1.3. Подавление экспрессии гена Arf6 в клетках линий глиобластомы человека LN229 и U87 при помощи малых шпилечных РНК (shRNA) 88
3.1.4. Анализ влияния продукции белка Arf6 на пролиферативный потенциал клеток глиобластомы 90
3.1.4.1. Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (тест на клоногенность) 91
3.1.5. Роль малой ГТФазы Arf6 в активации mTOR-зависимого сигнального пути 94
3.1.5.1. Участие малой ГТФазы Arf6 в активаци mTORС1-S6К в клетках полученных производных линий глиобластомы 94
3.1.5.2. Влияние малой ГТФазы Arf6 на активность других эффекторов сигнального пути протеинкиназы mTOR 96
3.1.5.2.1 Влияние малой ГТФазы Arf6 на фосфорилирование рибосомального белка S6 в клетках глиобластомы. 96
3.1.5.2.2. Влияние малой ГТФазы Arf6 на фосфорилирование белка 4E-BP1 в клетках глиобластомы 99
3.1.5.3. Влияние малой ГТФазы Arf6 на активность фосфолипазы D в клетках глиобластомы. 102
3.1.5.4. Анализ влияния гиперэкспрессии белка Arf6 на активацию Akt 104
3.1.6. Анализ влияния Arf6 на статус фосфорилирования MAP-киназы ERK1/2 в клетках глиобластомы 105
3.1.6.1. Определение уровня фосфорилирования ERK1/2 при стимуляции эпидерамальным фактором роста (EGF) 105
3.1.6.2. Анализ статуса фосфорилирования MAP-киназы p38 в клетках глиобластом при модуляции экспрессии Arf6 108
3.1.6.3. Анализ активности секретируемых протеаз, ремоделирующих ВКМ, в клетках глиобластомы при модуляции экспрессии.. 111
3.1.6.4. Анализ клеточного цикла производных линий глиобластом при модуляции экспрессии Arf6 методом проточной цитофлуориметрии. 112
3.2. Исследование влияния Arf6 на пролиферацию клеток линий немелкоклеточного рака легкого 113
3.2.1. Получение производных клеточных линий НМРЛ A549 и H1299 с измененной экспрессией Arf6 113
3.2.2. Анализ влияния продукции белка Arf6 на пролиферативный потенциал клеток линий НМРЛ 115
3.2.2.1. Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (тест на клоногенность) 117
3.2.3. Участие малой ГТФазы Arf6 в альтернативной активации протеинкиназы mTOR и S6-киназы (p70S6K) в клетках НМРЛ. 118
3.2.4. Влияние малой ГТФазы Arf6 на активацию MAP-киназы ERK1/2 в клетках НМРЛ. 120
3.2.5. Влияние малой ГТФазы Arf6 на активацию MAP-киназы p38 в клетках НМРЛ. 121
3.2.6. Анализ активности матриксных металлопротеиназ и активатора плазминогена урокиназного типа в клеточных линиях НМРЛ с гиперэкспрессией малой ГТФазы Arf6. 122
3.3. Исследование влияния Arf6 на пролиферацию клеток опухолей других гистологических типов 123
3.3.1. Получение производных трансформированных клеток человека различного гистогенеза с гиперэкспрессией 123
3.3.2. Анализ пролиферативного потенциала производных клеточных линий HT1080, A375, PANC-1 и MIA PaCa-2 с гиперэкспрессией малой ГТФазы Arf6. 124
Обсуждение результатов исследования 127
Выводы. 145
Список использованной литературы
- Arf6 активирует PLD – фермент, продуцирующий ФК и активирующий mTOR
- Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
- Анализ влияния продукции белка Arf6 на пролиферативный потенциал клеток глиобластомы
- Исследование влияния Arf6 на пролиферацию клеток линий немелкоклеточного рака легкого
Arf6 активирует PLD – фермент, продуцирующий ФК и активирующий mTOR
Белки Arf – ГТФ-связывающие белки с молекулярным весом 21 кДА, регулирующие различные клеточные процессы, преимущественно ассоциированные с мембранным транспортом. Как и все белки, относящиеся к малым ГТФазам Ras, белки Arf содержат консенсусные последовательности, отвечающие за связывание с ГТФ. В кристаллической структуре белков Arf выделяют области switch I, swinch II и interswitch, играющие роль в реализации биологической активности белка (Рисунок 2). N-концевой пептид с 1 по 10 аминокислотные остатки имеет вид спирали. Данная амфифильная N-концевая спираль миристоилирована по глицину во втором положении и содержит консенсусную последовательность миристоилирования MGXXXS/A/G, где X – любая аминокислота. Во внутримолекулярных взаимодействиях белка участвуют также ионы магния Mg2+ и небольшое количество молекул воды [173].
Малые ГТФазы Arf, как и все малые G-белки суперсемейства Ras, выполняют свои функции благодаря последовательно сменяющим друг друга конформационным изменениям в ГТФ- и ГДФ-связанном состоянии, причем оба состояния имеют свои эффекторные белки. Ранее считалось, что только Arf6, связанный с ГТФ, является активным и именно в этом состоянии взаимодействует со своими эффекторами, а ГДФ-связанное состояние Arf6 полагали неактивным. В настоящее время эффекторы Агґб-ГТФ называют классическими, а эффекторы ГДФ-связанного состояния - ГДФ-специфическими [51] (Рисунок 3).
Arf6, равно как и остальные белки Arf, не обладает слабой спонтанной ГТФазной активностью, присущей Ras, Rho, Rab и Ran-семействам [233] из-за различий в строении [173]. Гидролиз Агґб-связанного ГТФ до ГДФ осуществляется белками, активирующими ГТФазную активность - белками GAP (GTPase-activating proteins), а замена ГДФ на ГТФ производится факторами обмена гуанин-нуклеотидов - белками GEF (guanine nucleotide-exchange factors) [51]. Различные GAP и GEF белки могут быть как специфичными к определенным малым G-белкам, так и регулировать ГТФазную активность целого ряда белков [37]. GAP и GEF обладают собственными эффекторами и могут выполнять функции в клетке, не зависящие от их взаимодействия с малыми ГТФазами [51] (Рисунок 3). Эффекторы GAP
Все Ras-белки, а значит и белки Arf, имеют сходную конформацию в ГТФ-связанном состоянии, при которой консервативный тирозин в области «switch I» и консервативный глицин в области «switch II» связывают -фосфат ГТФ посредством водородной связи с амидной группой главной цепи [208, 226]. Switch-областями называются участки молекулы, подвергающиеся наиболее сильным конформационным изменениям в ходе ГТФ/ГДФ цикла и в которых происходит взаимодействие с эффекторами (причем switch II более важен для связывания с GAP и GEF, чем switch I). Когда ГТФ гидролизуется до ГДФ, в общем случае switch-области Ras-белков раздвигаются и освобождают сайт нуклеотидного связывания (Рисунок 4). В частности в белке Arf6 Gln67 в switch II области и Thr44 в switch I подвергаются наибольшим конформационным изменениям, которые обеспечивают раположение Gln67 и Тш-44 рядом с -фосфатом ГТФ. При этом Thr44 связывает -фосфат и ион Mg2+. Тш-27 участвует в связывании иона магния и -фосфата нуклеотидов [139] (Рисунок 4). Рисунок 4 - Конформационные изменения Arf6. Слева - структура Агґб-ГДФ [143], справа - структура Агґб-ГТФ [173]. Представлено структурное расположение Thr27, Thr44 и Gln67 на основе кристаллографических исследований. Голубым цветом обозначен гуанин-фосфат (адаптировано из [139]).
Белки Arf, в отличие от остальных Ras-белков, подвергаются дополнительным конформационным изменениям. В ГДФ-связанном состоянии так называемая interswitch-область сдвигается «внутрь» на два аминокислотных остатка [174], формируя гидрофобный карман, с которым связывается N-концевая спираль (Рисунок 5). Такая конформация служит молекулярным «замком», поддерживающим неактивное состояние [4, 83, 143]. Втянутый interswitch локализует консервативный аспартат (D), входящий в состав мотива DxxGQ, выше switch II, имитируя тем самым заряд -фосфата ГТФ и предотвращая таким образом связывание с ГТФ.
В ГТФ-связанном состоянии сдвиг interswitch происходит в обратном направлении: он выпячивается и выталкивает switch I и switch II «вверх», восстанавливая активную конформацию, способную связаться с ГТФ. При этом закрывается карман для N-пептида и разрушается его сайт связывания с гидрофобной поверхностью молекулы [79, 173]. N-концевая спираль в ГТФ-связанной конформации свободна и в кристаллической структуре немиристоилированного белка невидна, то есть электронная плотность в данной области в экспериментах по кристаллографии белка не различима (Рисунок 5). Это означает, что N-конец Arf6 не имеет жесткой структуры до Aspll, в отличие от остальной части белка [173] или имеет слабую связь с остальным белком [78]. Скорее всего спиральная форма сохраняется на протяжении всего ГТФ/ГДФ цикла [173]. белков, связанных с ГДФ, варьирует сильнее, чем связанных с ГТФ [16, 27]. Например, АгП и Arf6 структурно крайне схожи в активном, т.е. ГТФ-связанном состоянии, следовательно, именно различия в ГДФ-связанной форме могут объяснять присущие им различия во внутриклеточной локализации и биологических функциях. Их цикл ГДФ/ГТФ различается по своей природе в целом и по амплитуде внутримолекулярных перестроек, особенно в switch II, что объясняет разную аффинность Arf1 и Arf6 к нуклеотидам и ионам Mg2+. Данная область в Arf1-ГДФ обладает большей гибкостью и подвергается сильной перестройке, тогда как в Arf6-ГДФ этот участок более упорядочен и стабилен и представляет собой жесткую структуру, выполняющую поворот при связывании Arf6 с ГТФ вместо полной молекулярной реорганизации. Возможно такая разница в структурной пластичности и лежит в основе специфических свойств различных малых ГТФаз [173].
Как уже упоминалось выше, белки Arf имеют миристоилированную амфифильную N-концевую спираль. И миристоильная группа, и непосредственно N-концевая спираль вносят вклад в способность данных белков связываться с мембранами [68]. По одним данным связывание белка с мембранами происходит даже в отсутствие миристоильной модификации [66], по другим – удаление N-миристоила приводит к утрате способности связываться с мембранами [40]. Удаление N-концевого пептида влияет не только на связь с мембранами, но и на активацию белков Arf в целом [106]. Интересно, что Arf1 тесно связывается с мембранами только при активации ГТФ, в то время, как Arf1-ГДФ обнаруживается либо в цитозоле либо образует с мембранами низкоаффинный комплекс [79]. В отличие от Arf1, и Arf6-ГТФ и Arf6-ГДФ локализуются на плазматической мембране [139], причем это единственный белок семейства Arf, представленный на ЦПМ [23]. Отличия в связывании Arf1и Arf6 с мембранами, вероятно, обусловлены тем, что N-пептид Arf6 на 4 аминокислотных остатка короче, чем N-пептид Arf1, при этом укорочена не сама спираль, а линкер, связывающий её с белковым кором [143].
В то же время по данным Joelle Gaschet и Victor W. Hsu ГДФ/ГТФ-цикл Arf6 влияет на его распределение между мембранами и цитоплазмой (подобно ГТФ-циклу Arf1). Экспериментально показано, что мутантный Arf6, конститувно связанный с ГТФ (мутант Arf6(Q67L)), связывается с мембранами лучше, чем Arf6 дикого типа [73]. Также этой группой исследователей продемонстрирована зависимость внутриклеточного распределения Arf6 от концентрации ионов Mg2+. Показано, что Arf6 рекрутируется из цитозоля к мембране ГТФ-завсимым образом, а диссоциация с мембраной происходит при повышении концентрации ионов магния, которые облегчают гидролиз ГТФ. По мнению авторов, магний влияет на распределение Arf6 главным образом за счет увеличения активности белков GAP. При этом отмечается, что магний в клетках содержится в достаточной концентрации для поддержания значительной цитозольной фракции Arf6 in vivo [73]. Распределение Arf6 в клетке зависит и от уровня его экспрессии. При низком уровне экспрессии почти весь Arf6 находится на мембранах, тогда как при более высоком уровне экспрессии цитозольная фракция увеличивается. По всей видимости данный эффект обусловлен насыщением сайтов связывания Arf6 на мембране [40].
Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
Процентное содержание агарозы (GibcoBRL) в буфере ТАЕ (см. список использовавшихся растворов и сред), оптимальное для разделения фрагментов ДНК в геле, определяли в соответствии с длинами анализируемой ДНК: 0,6% - 1 - 20 т.п.н., 0,9% - 0,5 - 7 т.п.н., 1,2% - 0,4 - 6 т.п.н., 1,5% - 0,2 - 3 т.п.н., 2,0% - 0,1 - 2 т.п.н. Гель содержал 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Перед нанесением на гель к образцу ДНК добавляли буфер для нанесения (1/6 объема образца) (см. список растворов и сред).
Разделение фрагментов ДНК проводилось с учетом расстояния между электродами при максимальном напряжении 5 В/см. ДНК в геле регистрировали по флюоресценции в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны от 240 до 360 нм. Для анализа размера ДНК использовались маркеры молекулярного веса фирм Fermentas, Invitrogen.
2.4. Молекулярное клонирование 2.4.1. Получение компетентных клеток E. coli В работе использовали штамм бактерий E. coli DH5a. Замороженный бактериальный сток разводился в 100, 1000 и 10000 раз. Разведения рассевали на чашки с LB-агаром без ампициллина в асептических условиях. Чашки инкубировали в течение ночи при +37 С. На следующий день выбирали чашку с примерно 10000 отдельных колоний. Бактерии смывали 2,5-3 мл среды LB без ампициллина. Далее суспензию клеток переносили в 300 мл среды SOB, содержащей 10мМ MgSO4, до оптической плотности OD600=0,05. Суспензия клеток инкубировалась при +37 С в шейкере (200-250 об/мин) примерно в течение 50-60 мин до достижения оптической плотности OD600=0,15, после чего немедленно помещали в ледяную баню на 10 мин. Клетки собирали центрифугированием при 4000 g, 10 мин при +4 С, образовавшийся осадок клеток ресуспендировали в 150 мл ледяного раствора RF1. Клетки осаждали повторным центрифугированием в тех же условиях. После повторного центрифугирования осадок ресуспендировали в 15-30 мл ледяного раствора RF2. Затем клеточная суспензия делилась на аликвоты по 100 мкл, которые помещали в охлажденные стерильные микропробирки и замораживали в жидком азоте.
Для оценки степени компетентности полученных клеток проводили трансформацию разными количествами плазмиды pBS2SKM. Компетентность клеток составляла 10-6 – 10-8 мкг/мкл плазмиды. Трансформация компетентных клеток E. coli К 100 мкл компетентных клеток на льду добавляли аликвоту лигазной смеси или плазмидной ДНК (до 10 мкл) и инкубировали 30 мин на льду. После этого клетки подвергали тепловому шоку (+42 С, 90 сек) и снова инкубировали на льду 5 мин. Затем к клеткам добавляли 1 мл среды LB без ампициллина и проводили инкубацию при +37 С в течение 60 мин. Суспензию клеток центрифугировали при 3000 g 10 мин. Осадок клеток в остаточном объеме 100 мкл высевали на чашки Петри с LB-агаром и 50 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубировали в течение 16-24 часов при +37 С. Плазмидную ДНК клонов анализировали с помощью рестрицирующих эндонуклеаз, ПЦР in situ, а также секвенированием.
Гидролиз ДНК рестрицирующими эндонуклеазами проводили с использованием ферментов разных фирм в условиях, рекомендуемых производителями. Обычно реакционная смесь содержала рестрикционный буфер (1/10 от общего объема), необходимое количество ДНК и рестриктаз, бычий сывороточный альбумин (до концентрации 1 мг/мл) и деионизированную воду до конечного объема 20 мкл. Рестрикцию проводили при оптимальной для фермента температуре (обычно +37 С) в течение 1-2 часов. Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле.
Реакцию лигирования «липких» концов плазмидной ДНК проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 (Fermentas) в условиях, рекомендованных производителем (1-2 единицы на 20 мкл лигазной смеси). Выделенные из геля векторную ДНК и клонируемый фрагмент лигировали в молярном соотношении 1:2-1:3. Реакция проводилась при +16 С в течение часа, либо при +4 С в течение ночи. Полученную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E. coli. Перед трансформацией лигазу инактивировали инкубацией в течение 10 мин при +65 С.
Олигонуклеотиды отжигали друг на друге при 95 С в эквимолярном соотношении в течение 10 минут. Затем проводили киназную реакцию 20 пмолей полученной смеси в присутствии киназы Т4 (Fermentas) согласно протоколу производителя. Полученные конструкции использовали для молекулярного клонирования. Секвенирование плазмидной ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems
Для получения псевдоретровирусных частиц клетки GP293 наращивались в 100 мм культуральных чашках; затем рассаживались на 35 мм культуральные чашки либо 6-луночные планшеты до 70% конфлюентности в той же среде. Для трансфекции брали 2мкг ДНК - ретровирусный вектор pLXSN (Clontech) с целевым геном и плазмиду pVSVG (Clontech), кодирующую белок оболочки вируса везикулярного стоматита, необходимый для сборки вируса и увеличения тропности вирусных частиц к клеткам хомяка. Плазмиды смешивались в эквимолярном соотношении. Трансфекцию проводили с использованием липофектамина 2000 (LipofectAMINE 2000 Reagent, Invitrogen, США), согласно протоколу производителя. Полученные вирусные частицы в супернатанте собирали через 24, 48 и 72 часа, центрифугировали 10 мин при 1500g для удаления клеточного дебриса и использовали для инфекции. Для получения псевдолентивирусных частиц использовали клеточную линию 293FT. Для трансфекции брали 2мкг плазмидной ДНК – лентивирусный вектор pLKO.1 puro (addgene), несущий последовательной малой шпилечной РНК, pVSVG и пакующую плазмиду pCMV delta R8.2 (Addgene) , кодирующую вирусные белки в эквимолярном соотношении. В остальном процедура трансфекции не отличалась от таковой в случае GP-293.
Инфицирование проводилось в формате 6-луночных планшетов. За день до инфекции клетки-мишени (клеточные линии человека) рассеивались в 2 мл среды с таким расчетом, чтобы к моменту инфекции они достигали 20-30% конфлюэнтности. В день инфекции среду заменяли: добавляли 50% вирусного супернатанта, объем доводили обычной средой и добавляли в каждую лунку полибрен (Sigma) до конечной концентрации 8 мкг/мл. Использовались 24, 48 и 72-часовые инокуляты вируса. После окончания инфекции клетки наращивались 48 часов, после чего пересеивались на 60-мм культуральные чашки для селекции на антибиотике. Для контроля селекции рассевали неинфицированные клетки. В случае ретровирусной инфекции cелекция проводилась на G418 (Sigma) в течение 8-9 дней, среду с антибиотиком меняли каждые 2-3 дня (Таблица 2). В случае лентивирусной инфекции отбор проводился с добавлением пуромицина (Sigma) в течение 5 дней (Таблица 3). После окончания селекции клетки наращивали до состояния субконфлюэнтности, замораживали при -70С в эмбриональной сыворотке с 10% ДМСО. Для дальнейших экспериментов использовали свежеразмороженные аликвоты полученных клеточных линий.
Анализ влияния продукции белка Arf6 на пролиферативный потенциал клеток глиобластомы
О фосфорилировании рибосомального белка S6 известно мало. Показано, что S6 фосфорилируется по крайней мере по пяти сайтам, расположенным в C-конце [9]. В целом роль фосфорилирования S6 в физиологии клетки практически не ясна, за исключением того, что оно влияет на рост клетки [191]. В данной работе методом вестерн-блот гибридизации были проанализированы четыре сайта фосфорилирования рибосомального белка S6: Ser235, Ser236, Ser240 и Ser242 (Рисунок 23 и Рисунок 24)
На рисунке 23 видно, что в случае производных линий LN229 с гиперэкспрессией Arf6 в клетках, экспрессирующих Arf6 дикого типа, наблюдается усиление фосфорилирования S6 по сайтам Ser235/236, а в клетках, экспрессирующих конститутивно-активный мутант Arf6(Q67L), повышается фосфорилирование по всем четырем сайтам – Ser235/236 и Ser240/242. При этом повышение содержания тотального белка S6 в клетках с гиперэкспрессией Arf6 не выявлено.
Подавление экспрессии Arf6 в линии LN229 приводит к снижению фосфорилирования S6: в линии, экспрессирующей sh3, снижается фосфорилирование по всем сайтам, а в линии с подавлением Arf6 при помощи sh2 уменьшается фосфорилирование по сайтам Ser235/236. Изменение количества тотальной формы белка S6 также не наблюдается.
Согласно полученным результатам (Рисунок 24), в клетках производных линий U87 наблюдается незначительное увеличение количества фосфо-формы белка S6 (сайты Ser235/236) как в случае гиперэкспрессии Arf6 дикого типа, так и в случае экспрессии конститутивно-активного белка Arf6. При подавлении экспрессии Аг/б при помощи sh3 фосфорилирование S6 по сайтам Ser235/236 уменьшается. В остальных случаях изменения в уровне фосфорилирования отсутствуют.
Таким образом, в производных линиях LN229 и U87 наблюдалось усиление фосфорилирования белка S6 по сайтам Ser235/236 как при экспрессии Arf6 дикого типа, так и при экспрессии Arf6(Q67L). При подавлении экспрессии эндогенного Arf6 фосфорилирование rpS6 по сайтам Ser235/236 снижалось в обеих линиях (при этом эффект выражен сильнее в клетках линии U87). Описанные изменения статуса фосфорилирования белка rpS6 не сопровождались изменением общего количества данного белка в клетках (аналогично случаю изменения фосфорилирования киназы p70S6K), что свидетельствует о том, что Arf6 влияет на активацию белков-мишеней mTOR, а не на их продукцию.
Влияние малой ГТФазы Arf6 на фосфорилирование белка 4E-BP1 в клетках глиобластомы. Белок 4E-BP1 (белок, связывающий eIF4E - эукариотический фактор инициации трансляции 4E) подвергается фосфорилированию по семи сайтам, четыре из них фосфорилируются mTOR-зависимо (Thr37, Thr 46, Thr 70 и Ser65) [155] [77] [230]. Ser65 и Thr70 расположены близко к сайту связывания eIF4E, и в литератруре имеются данные, указывающие на их важность для высвобождения фактора инициации eIF4E и его диссоциации от 4E-BP1 [61]. Однако, согласно ряду других данных, фосфорилирования Ser65 и Thr70 недостаточно для высвобождения eIF4E из комплекса с его связывающим белком 4E-BP1 [218], таким образом, сведения о необходимости фосфорилирования данных сайтов в этом процессе носят противоречивый характер. Фосфорилирование 4E-BP1 по различным сайтам носит иерархический характер. Так, фосфорилирование и Ser65, и Thr70 зависит от более раннего фосфорилирования других сайтов, при этом фосфорилирование Thr46 является необходимым для последующего фосфорилирования Thr37 [154] [77; 90]. В нашей работе мы оценивали фосфорилирование 4E-BP1 по сайтам Thr37, Thr46 и Thr70 (Рисунок 25 и Рисунок 26). Для анализа использовался метод вестерн-блот гибридизации.
Как видно на рисунке 25, гиперэкспрессия Arf6 дикого типа и экспрессия конститутивно-активного Arf6 в линии LN229 практически не влияет на фосфорилирование 4Е-ВР1 по 70 треонину. Фосфорилирование 4Е-ВР1 по 37 и 46 треонину увеличивается в обеих производных линиях LN229, гиперэкспрессирующих Arf6, причем в линии LN229 Arf6(Q67L) сильнее, чем в линии LN229 Arf6 WT. Также в линии LN229 Arf6(Q67L) наблюдается увеличение тотального количества белка 4Е-ВР1.
В случае подавления экспрессии Аг/6 наблюдается усиление фосфорилирования 4Е-ВР1 по всем трем сайтам (Thr70, Thr37 и Thr46), причем эффект был более выражен при экспрессии sh3. В случае линии, экспрессирующей sh3 также наблюдается повышениие содержания тотального белка 4Е-ВР1.
В производных линиях U87 (Рисунок 26) фосфорилирование белка 4ЕВР1 по Thr70 практически не изменяется, также как и в производных линиях LN229. Фосфорилирование 4Е-ВР1 по сайтам Thr37 и Thr46 значительно увеличено в обеих производных линиях U87, гиперэкспрессирующих экзогенный Arf6. Для линии U87 Arf6(Q67L) также характерно значительно более выраженное увеличение тотальной формы 4Е-ВР1, чем для линии U87 WT. В клетках производной линии U87, экспрессирующей sh3, наблюдается повышение содержания тотального и фосфорилированного белка 4Е-ВР1 (сайты Тш-70, Thr37 и Thr 46).
Исследование влияния Arf6 на пролиферацию клеток линий немелкоклеточного рака легкого
Данные о влиянии малой ГТФазы Arf6 на актвиацию mTOR и о связи Arf6-зависимой активации сигнального пути mTOR с клеточной пролиферацией были подтверждены на линиях НМРЛ A549 и H1299. Как и в линиях глиобластомы, мы наблюдали, что гиперэкспрессия Arf6 увеличивала количество фосфорилированной формы p70S6K, а эффективное снижении продукции белка Arf6 при помощи sh3 приводила к уменьшению уровня фосфорилирования p70S6K в клетках обеих линий НМРЛ. Однако, в отличие от результатов, полученных на клетках линий глиобластомы (где любое снижение экспрессии Arf6 приводило к подавлению пролиферации и уменьшению количества активной формы p70S6K), в случае менее эффективного подавления экспрессии гена Arf6 посредством sh2, отмечалось усиление фосфорилирования p70S6K. Иными словами, в обеих линиях НМРЛ недостаточное подавление Arf6 оказывало противоположный эффект – увеличивало фосфорилирование p70S6K, а также, напомним, предотвращало снижение (даже незначительно стимулировало) динамику роста клеток. Мы предполагаем, что в основе данного эффекта может лежать активация некоего механизма, компенсирующего уменьшение количества малой ГТФазы Arf6 в клетке и предотвращающего снижение пролиферативной активности. То есть при снижении количества Arf6 в клетке до некоторого уровня, возможно происходит активация параллельных сигнальных путей, которые стимулируют mTORC1, «компенсируя» потери в фосфорилировании p70S6K. При этом дальнейшее уменьшение количества Arf6 в клетке уже не может быть компенсировано и вызывает снижение активации mTOR-зависимого сигнального пути. В целом в линиях НМРЛ Arf6 также положительно влияет на активацию mTOR, причем уровень активации mTOR и ее эффектора p70S6K прямо пропорционален уровню клеточной пролиферации в данных линиях.
В контексте эффекта Arf6-зависимой активации mTOR/S6K была проанализирована активация рибосомального белка S6 (эффектора p70S6K1) и белка 4E-BP1 (эффектора mTORC1) в клетках глиобластомы. В случае рибосомального белка S6 в линиях LN229 и U87 происходило увеличение фосфорилирования преимущественно по сайтам Ser235/236 при гиперэкспрессии Arf6. Данный эффект более выражен для экспрессии активного Arf6. При подавлении продукции Arf6 наблюдается снижение фосфорилирования также преимущественно по этим сайтам фосфорилирования. При этом изменение количества тотальной формы белка обнаружено не было. Таким образом, аналогично случаю Arf6-зависимого изменения фосфорилирования киназы p70S6K, изменение фосфорилирования ее непосредственного эффектора – белка S6 – протекает также без изменения общего количества белка S6 в клетке, что свидетельствует о том, что Arf6 влияет именно на активацию белков пути mTOR-S6K-S6, а не на их продукцию.
Паттерн экспрессии и фосфорилирования 4E-BP1 в производных линиях LN229 и U87 был схож: для гиперэкспрессии Arf6 было характерно увеличение тотального белка 4E-BP1 и белка, фосфорилированного по сайтам Thr37 и Thr46, причем большее влияние оказывал конститутивно-активный Arf6(Q67L). При этом уровень фосфорилирования 4E-BP1 по сайту Thr70 при гиперэкспрессии Arf6 в обеих линиях глиобластомы не изменялся. В то же время, повышение фосфорилирования наряду с общим количеством белка было обнаружено и при выраженном подавлении Arf6. Таким образом, как увеличение, так и снижение уровня продукции Arf6 в клетках глиобластомы приводит к повышению количества белка 4E-BP1 в клетке. В случае нокдауна Arf6 мы предполагаем активацию неизвестных механизмов, целью которых может быть инициация трансляции отдельных групп генов посредством повышенной продукции и активности белка 4E-BP1, способных компенсировать изменение количества Arf6 в клетке или элиминировать малую шпилечную РНК и восстановить экспрессию Arf6. Восстановление уровня экспрессии Arf6 в линиях, трансфицированных sh3, в ходе экспериментов действительно происходило: так, мы наблюдали восстановление продукции через 4-5 пассажей. Напомним, что при работе с клетками с подавленной экспрессией Arf6 мы использовали исключительно клетки первого пассажа. Другой гипотетической причиной изменения количества 4E-BP1 в клетках может быть изменение стабильности самого белка 4E-BP1. В любом случае надо помнить, что малая ГТФаза Arf6 выполняет в клетках множество функций, и мы всегда видим некоторый результирующий эффект, который порой может обуславливать результаты, противоречащие ожиданиям. Тем не менее мы можем с уверенностью заключить, что Arf6 также влияет на активацию и продукцию еще одного эффектора киназы mTOR – белка 4E-BP1.
Выдвинутая нами гипотеза об Arf6-зависимой активации mTOR предполагает реализацию данного механизма при участии фосфолипазы D (PLD). Согласно некоторым литературным данным, Arf6-ГТФ непосредственно активирует PLD [176, 93], индуцируя образование фосфатидной кислоты (ФК) фосфолипазой D. В свою очередь, по некоторым данным, PLD посредством ФК может активировать mTOR [114, 240, 108, 104]. В связи с этим в нашей работе был проанализирован уровень активности PLD в производных клетках линий глиобластомы при помощи коммерческого набора реактивов. Эксперимент проводился на линиях LN229 и U87, экспрессирующих конститутивно-активную форму белка Arf6, и соответствующих контрольных линиях. В результате было обнаружено увеличение активности PLD в линиях, экспрессирующих Arf6-ГТФ. Таким образом, проведенный нами эксперимент подтвердил важность конститутивной активации Arf6 для повышения активности PLD, что согласуется с ранее полученными результатами [124] и свидетельствует в пользу гипотезы о влиянии Arf6 на активацию mTOR-зависимого сигнального пути посредством PLD.