Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1 Белки теплового шока. Основные представители и их функции 15
1.1.1 Белки теплового шока и опухолевый процесс 18
1.1.2 Белок теплового шока 27 кДа (Hsp27) 26
1.2 Рецептор эпидермального фактора роста Her2/neu 32
1.2.1 Механизмы регуляции экспрессии Her2/neu рецептора 35
1.3 Her2/neu-позитивные варианты рака молочной железы 39
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 46
2.1 Материал исследования 46
2.2 Методы исследования
2.2.2 Определение амплификации гена erbВ2 в опухолевых клетках РМЖ ... 57
2.2.3 Статистическая обработка результатов 60
2.2.4 Дизайн исследования 61
ГЛАВА 3. Результаты исследования 63
3.1 Функциональные особенности Hsp27 в опухолевых клетках разных морфологических структур инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы 63
3.1.1 Функциональные особенности Hsp27 в опухолевых клетках разных морфологических структур инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы 65
3.1.2 Функциональные особенности внутриклеточного Hsp27 при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы приразличных молекулярно-генетических типах РМЖ 71
3.1.3 Функциональные особенности Hsp27 в опухолевых клетках разных морфологических структур инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы с учетом молекулярно-генетического типа опухоли.. 74
3.2 Функциональные особенности Hsp27 при позитивной экспрессии рецептора Her2/neu и отрицательной амплификации гена erbB2 в опухолевых клетках инвазивной карциномы неспецифического типа 81
3.3 Экспрессия Hsp27 в клетках рака молочной железы при «полисомии 17
хромосомы» в группе диссонанса негативной амплификации гена erbB2 и позитивной презентации рецептора Her2/neu 88
3.4 Оценка взаимосвязи функционального состояния Hsp27 с уровнем экспрессии рецепторов к половым гормонам (ER, PR) и пролиферативной активностью опухоли (Ki-67) в зависимости от Her2/neu статуса рака молочной железы 93
3.5 Связь различных вариантов сочетания функциональной активности шаперона Hsp27 и Her2/neu статуса с лимфогенным метастазированием прираке молочной железы 106
Обсуждение результатов 119
Заключение 136
Выводы 140
Практические рекомендации 142
Список сокращений 144
Список литературы
- Белки теплового шока и опухолевый процесс
- Определение амплификации гена erbВ2 в опухолевых клетках РМЖ
- Функциональные особенности Hsp27 в опухолевых клетках разных морфологических структур инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы
- Оценка взаимосвязи функционального состояния Hsp27 с уровнем экспрессии рецепторов к половым гормонам (ER, PR) и пролиферативной активностью опухоли (Ki-67) в зависимости от Her2/neu статуса рака молочной железы
Белки теплового шока и опухолевый процесс
Белок теплового шока 27 кДа (Hsp27) Предствители семейства малых белков теплового шока (sHsp) составляют «первую линию обороны» с точки зрения клеточного стресса. sHsp препятствуют необратимой агрегации белков и вместе с фолдазами осуществляют рефолдинг протеинов [339]. Hsp27 (или heat shock protein beta-1, HspB1) является одним из представителей sHsp, который экспрессируется во всех тканях человека. Физиологически наиболее высокий уровень Hsp27 отмечается в мышечной ткани, где он регулирует взаимодействие главных белков сократительного аппарата мышц [237]. Его экспрессия обнаружена в человеческих эмбриональных клетках эпидермиса на 9-й неделе гестации, что совпадает с началом эпидермальной стратификации [162]. Hsp27 регулирует дегрануляцию и агрегацию тромбоцитов [323], дифференцировку остеобластов [93], фибробластов [250], клеток крови [95] и участвует в развитии нервной системы [178].
Особенностью Hsp27, является АТФ-независимый механизм регуляции и способность образовывать мультимерные комплексы с другими представителями sHsp (HspB5, HspB6, HspB8) [33,60]. Функциональная активность Hsp27 контролируется его посттрансляционной модификацией. Чаще всего шаперон подвергается фосфорилированию по остаткам серина (Ser15, Ser78, Ser82) и треонина (Thr143) вследствие конститутивной активации протеинкиназ (MAPKAPK-2/3/5, ПКA, ПКB (AKT), ПКС, ПКD1) [187]. Биологический смысл фосфорилирования каждого сайта Hsp27 в настоящее время не определен. Тем не менее, известно, что олигомеризация Hsp27 регулируется фосфорилированием по Ser78 и Ser82, и в меньшей степени по Ser15 [137,191]. Предполагается, что конформационные изменения Hsp27, в результате фосфорилирования, помимо диссоциации крупных комплексов опосредуют потерю шаперонной активности. Данные функциональные изменения шаперона обратимы и реализуются за счет активности фосфатаз (PP2A, PP2B, PP1) [316]. Кроме того, Hsp27 формируют различные по размеру и статусу фосфорилирования структуры: небольшие – 50-200 кДа (p-Ser15,82), средние – 200-400 кДа (p-Ser78), крупные – 400-700 кДа (p-Ser82) [32,251].
При воздействии неблагоприятных факторов соотношение структур Hsp27 по размеру и статусу фосфорилирования меняется и зависит от природы действующего фактора. Начальные этапы воздействия характеризуются диссоциацией крупных структур на малые гиперфосфорилированные комплексы Hsp27. В терминальном периоде наблюдается увеличение крупных гипо-/нефосфорилированных форм шаперона с последующим восстановлением соотношения всех ассоциаций [32,251].
Структурная пластичность Hsp27 является основным механизмом адаптации клеток к неблагоприятным условиям. Связано данное обстоятельство с изменением сродства к его белкам-мишеням, как в ядре, так и цитоплазме. Например, прокаспаза-3 присутствует только в олигомерных комплексах 200 кДа, транскрипционный фактор STAT2 во фракции 250-500 кДа, а деацетилаза гистонов HDAC6 в 550-650 кДа структурах [126]. Предполагается, что фосфопротеины Hsp27, наделенные малыми размерами, способны проходить через ядерные поры клеток [196]. В ядрах p-Hsp27 связан с кластерами интерхроматиновых гранул (ядерные «speckles») – функциональные центры эухроматиновых областей, которые группируют многие активные гены [58]. Фосфопротеин Hsp27 стабилизирует, транспортирует в ядро и повышает транскрипционную активность андрогеновых рецепторов [193,369]. При дефосфорилировании ядерного p-Hsp27 происходит вторичная сборка шаперона в крупные олигомерные комплексы, которые могут оказаться в ядерной ловушке и стимулировать протеосомальную деградацию транскрипционного фактора HSF1 [297]. Фосфорилированная форма Hsp27 ингибирует выход в цитоплазму медиатора Fas-индуцированного каспазо-независимого апоптоза Daxx (death-domain associated protein) [72] и модулирует полимеризацию актина, стимулируя клетучную миграцию [147]. Согласно последним данным идентифицировано 226 Hsp27-зависимых протеинов [178]. Группа французских ученых во главе Katsogiannou M. в результате проведения дрожжевого двухгибридного метода построила сеть «Hsp27-белок». Анализ полученной сети белковых взаимодействий указал на многофункциональный характер Hsp27 и позволил выявить новые функции шаперона. Например, ранее было, известно, что двухцепочечные разрывы молекулы ДНК индуцируют активацию ATM (ataxia telangiectasia mutated). Исследование Cosentino C. и др. (2011 г.) установило сопряжение ATM-зависимого фосфорилирования Hsp27 (Ser78) и увеличение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ). Активированный фермент Г-6-ФДГ, запуская пентозофосфатный путь и увеличивая уровень HAДФ-Н, стимулирует синтез нуклеотидов для восстановления структуры ДНК [89]. Katsogiannou M. и др. (2014 г.) обнаружили, что Hsp27 при двойных разрывах ДНК реализует его негомологичное воссоединение концов (non-homologous end joining, NHEJ), что может приводить к делециям и транслокациям в клетках [178]. Данный механизм согласуется с полученным выводом Castro G.N. и др. (2012 г.) о роли Hsp27 в генетическом дисбалансе (потеря гетерозиготности) в клетках олигодендроглиальной опухоли [70].
Hsp27 модулирует активность факторов сплайсинга мРНК (SRp38, SF3A3, SFRS18), поддерживает функционирование сплайсосомы (SNRNP200, SNRPF, HNRNPA2B1, HNRPF и др.), регулирует транскрипцию, участвует в процессе сборки нуклеосом, связан с транспортом белков и мРНК через ядерный поровый комплекс (экспортин, импортин) [178]. Данный шаперон координирует инициацию трансляции, связываясь с различными факторами (eIF4G1, eIF1AX, eIF2S1 и т.д.) и рибосомальным белком RPSA [91,105,178]. Например, Cuesta R. и др. показали участие Hsp27 в ингибировании eIF4F-зависимой трансляции мРНК. В условиях гипертермии данный механизм позволяет снизить интенсивность белкового синтеза для ограничения накопления денатурированных протеинов клетки [91]. Hsp27 контролирует распад мРНК, имеющих в нетранслированных областях с 3-конца AU-богатые элементы (AU-rich elements, AREs). ARE-связывающий белок AUF1 (ARE/poly (U) - binding/degradation factor 1) способствует быстрой деградации мРНК цитокинов, сигнальных белков и онкопротеинов. Фосфорилированная форма Hsp27 стабилизирует мРНК, обеспечивая убиквитин-зависимую деградацию AUF1 [184,205]. На посттрансляционном уровне Hsp27 активирует протеолиз белков за счет связывания с субъединицами протеасомы (PSD1, A3 и A6) и убеквитин-лигазой Е3. В литературе наиболее подробно описана Hsp27-зависимая протеосомальная деградация ингибиторной субъединицы NF-kB (I-kB), ингибиторов циклин зависимых киназ (p27Kip1, p21Waf1) и опухолевого супрессора Р53. Данная функция шаперона в опухолевых клетках позволяет поддерживать высокий пролиферативный потенциал и резистентность к запуску апоптоза [90,178,247,248,334]. В последнее время появились данные, что Hsp27 в опухолевых клектах РМЖ и легких нарушает сигнальный каскад Hippo, за счет убиквитин-зависимой протеосомальной деградации опухолевого супрессора MST1 (mammalian STE20-like kinase 1). Снижение MST1 повышает активность регуляторов транскрипции YAP1 (yes-associated protein 1) и TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif), которые в ядрах опухолевых клеток стимулируют экспрессию прометастатических генов и онкогенный сигналинг TGF-/Smad, Wnt/-catenin, ILK (integrin-linked kinase) [327].
Определение амплификации гена erbВ2 в опухолевых клетках РМЖ
Согласно рекомендациям ASCO/CAP анти-Her2/neu-терапию должны получать только те пациенты, которые имеют ИГХ (3+) и ИГХ (2+) / FISH (+). В клинической практике применение анти-Her2/neu терапии у таких больных привело к заметному улучшению результатов лечения [42,276,298,310,335]. Тем не менее, трастузумаб эффективен в 11-26% Her2/neu-позитивных больных метастатическим РМЖ. При комбинированном лечении трастузумаба и цитостатическими препаратами группы таксанов (паклитаксел или доцетаксел) эффективность достигает от 50 до 80% [233]. Кроме того, вопреки распространенному мнению, что трастузумаб может быть полезен только для пациентов РМЖ с экспрессией Her2/neu в результате амплификации гена erbB2, описаны случаи положительного терапевтического ответа у больных с неамплифицированной экспрессией Her2/neu [244,255]. Стоит также отметить, что соответствие результатов ИГХ и FISH методов при Her2/neu-тестировании отмечают у 82% проанализированных пациентов. Крупные рандомизированные исследования показали, что среди опухолей с ИГХ на (3+) в 3-15 % случаев FISH-исследование не выявляет амплификацию гена erbB2. В случаях, относящихся к гистохимическим категориям (0 и 1+), амплификация гена erbB2 определяется приблизительно в 4,0% [38]. Большую проблему составляют и случаи РМЖ, относящиеся к категории сомнительных результатов. Среди опухолей с оценкой ИГХ на (2+) только 36% имеют амплификацию гена erbB2 [38,87]. Полученные данные, могут говорить о проблеме установления Her2/neu статуса, которая связана с ошибками в проведении Her2/neu-тестирования на различных этапах исследования. Помипо этого, интерпритация молекулярных методов исследования может быть затруднена в виду внутриопухолевой морфологической гетерогенности РМЖ, которая предсталена пятью различными типами морфологических структур (тубулярные, солидные, трабекулярные, альвеолярные структуры и дискретные группы опухолевых клеток) [1,3,5,97,124,358,359].
С другой стороны, принятый алгоритм Her2/neu-тестирования пациентов с РМЖ учитывает экспрессию рецептора обусловленную только амплификацией гена erbB2. Однако, как показали исследования, избыточная презентация рецептора может быть не только следствием амплификации гена erbB2. Так, Perez E.A. и др. выявили, что из 216 образцов РМЖ имевших неопределенный результат ИГХ (2+), 26 (12%) имели высокий уровень амплификации гена erbB2, 54 (25%) имели дубликацию, 4 (2%) делецию erbB2 и/или CEP17 и 123 (57%) не имели никакой генетической аномалии [256]. Судя по накопренному фактическому материалу следует, что экспрессия онкопротеина на мембране опухолевых клеток РМЖ может быть результатом не только генетических перестроек (полисомия 17 хромосомы, коамплификация erbB2 с центромерной зоной 17 хромосомы и т.д.), но и следствием интенсивности процессов синтеза, презентации и распада рецептора [141,332]. К альтернативным механизмам увеличения гена erbB2 в опухолевых клетках РМЖ относят «полисомию 17 хромосомы». Тем не менее, существуют данные об отсутствии связи «полисомии 17 хромосомы» с интенсивностью экспрессии рецептора Her2/neu и количеством его мРНК [92]. Downs-Kelly E. и др. показали повышенное число CEP17 (CEP172,1) в 70% случаев при РМЖ с результатом ИГХ на (0 и 1+), в 27% на (2+) и порядка 3% на (3+), что свидетельствуют об отсутствии существенного влияния «полисомии 17 хромосомы» на биологическую экспрессию Her2/neu в клетках РМЖ [108]. Как полагают ученые, причина таких противоречий связана с использованием срезов опухолевой ткани малой толщины. Так как средний диаметр ядер опухолевых клеток более 6 мкм, соответственно в срезах ткани толщиной 4 мкм возможны потери некоторого генетического материала. Это может привести к нетчным результатам FISH в оценке «полисомии 17 хромосомы» и числа копий исследуемых генов [164,165]. Поэтому группа исследователей во главе Jiang H. для определения роли «полисомии 17 хромосомы» в экспрессии Her2/neu использовали метод количественной оценки генов в целых ядрах. Данное исследование показало, что при «полисомии 17 хромосомы» наблюдается не только увеличение количества гена erbB2, мРНК erbB2, но и гиперэкспрессия белка Her2/neu. Помимо этого «полисомия 17 хромосомы» взаимосаязана со степенью злокачественности и наличием метастазов у больных РМЖ [164,165,258]. С другой стороны, высокий уровень Her2/neu на мембране опухолевых клеток РМЖ связан с интенсивностью белкового синтеза, деградацией белка, стабильностью мРНК рецептора и т.д. Наибольший интерес ученых связан с опредлением механизмов стойкой презентации рецептора, поскольку эффективность анти-Her2/neu терапии и проведение онкогенных сигналов к прогрессии заболевания зависит от данного обстоятельства. С этих позиций в последнее время стали исследоваться шапероны, которые могут напрямую связываться с Her2/neu и/или через взаимодействие с другими молекулярными участниками (STAT3, NF-kB, HDAC6 и др.) определять Her2/neu статус на мембране опухолевых клеток РМЖ. Например, на модели трастузумаб-резистентных и р95Her2/neu-гиперэкспрессирующих клеточных линий показано, что длительное введение ингибиторов Hsp90 приводит к снижению экспрессии Her2/neu и p95Her2/neu [71,119]. Kang S.H. и др. показали, что Hsp27 может связываться с рецептором Her2/neu на поверхности опухолевых клеток РМЖ и тем самым снижает чувствительность к трастузумабу [176,181].
Таким образом, рецептор Her2/neu один из наиболее значимых молекулярных маркров. Его избыточное количество на поверхности опухолевых клеток свидетельствует о высокоагрессивной форме опухоли молочной железы. Предполагается, что выявление факторов ассоциированных с Her2/neu позитивным фенотипом без амплификации гена erbB2 при РМЖ может быть использовано в качестве дополнительных критериев установления Her2/neu-статуса, послужить разработке новых мишеней таргетной терапии, и связано с прогнозом заболевания.
Функциональные особенности Hsp27 в опухолевых клетках разных морфологических структур инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы
По результатам проведенного исследования показано, что позитивная экспрессия Hsp27 в ткани опухоли ИКНТ наблюдалась в 81,9% случаях. Данные литературы свидетельствуют о том, что при РМЖ экспрессия молекулярного шаперона определяется в более чем 60% случаев [59,134]. Предполагается, что частое определение Hsp27 в опухолевых клетках является проявлением их ответной реакции на различные неблагоприятные факторы в результате неадекватного процесса ангиогенеза при опухолевой трансформации (низкий уровень глюкозы, ацидоз, гипоксия, высокий уровень активных форм кислорода и др.) [81,107,225,312]. Согласно литературным источникам, активность генов, регулирующих экспрессию Hsp, пропорциональна интенсивности, длительности воздействия, типу стресса и контролируется факторами теплового шока (heat shock factor, HSF). Способность клеток отвечать на стресс повышением уровня экспрессии молекулярных шаперонов взаимосвязано с активностью фактора теплового шока 1 (HSF1) [64,65]. Известно, что мономеры фактора транскрипции HSF1 в цитоплазме клеток ассоциированы с Hsp70 и Hsp90 [338]. При воздействии стресса Hsp90 и Hsp70 связываются с денатурированными белками. Освободившийся HSF1 активируется путем тримеризации и транслоцируется в ядро, где он связывается с промоторной областью генов Hsp и стимулирует их транскрипцию [262]. На начальных этапах активно экспрессируются ранние индуцибельные Hsp, такие как Hsp70 и Hsp90, а затем Hsp27. По окончанию воздействия повреждающего фактора, освободившиеся Hsp, связывают HSF1 и переходят в исходное состояние [297].
В нашем исследовании количество опухолевых клеток ИКНТ с позитивной экспрессией Hsp27 достоверно больше регистрировалось у пациенток с сохраненным менструальным циклом, по сравнению с больными в менопаузе.
Вероятно, физиологически повышенный уровень эстрогенов в крови больных РМЖ с сохраненной менструальной функцией по сравнению с пациентками, находящимися в состоянии менопаузы, может дополнительно стимулировать синтез Hsp27 в клетках. По литературным данным более высокий уровень экспрессии Hsp27 в клетках РМЖ у пациенток с сохраненной менструальной функцией может достигаться через активацию эстрагенами комплекса SP1/ER, AP2/ER и ядерных факторов Brn-3a, Brn-3b [59,116]. Например, Lee S.A. и др. (2005 г.) в опухолевых клетках рака молочной железы установили, что Brn-3b прямо и/или косвенно взаимодействет с эстрогенными рецепторами (ER), активирует промотор гена Hsp27 (HSPB1) [198]. Согласно литературным данным Hsp27 имеет несколько сайтов фосфорилирования (Ser15, 78, 82), может образовывать различные по молекулярной массе структуры: небольшие – 50-200 кДа, средние – 200-400 кДа, крупные – 400-700 кДа [32,251]. Наиболее устойчивыми из них являются димерные структуры, которые, как правило, фосфорилированные. При дефосфорилировании Hsp27 формируются большие нестабильные структуры (16, 24, 32-мерные структуры) [32]. Arrigo A.P. и др. (2012 г.) показали, что воздействие различных неблагоприятных факторов на начальных этапах воздействия приводит к диссоциации крупных структур молекулярного шаперона на малые фосфорилированные комплексы. Например, в нативной культуре опухолевых клеток линии HeLa Hsp27 в большей степени представлен крупными олигомерными структурами (48%), чем мелкими (38%) и средними (14%) ассоциацями. При воздействии гипертермии (42оС) в данной культуре клеток наблюдается диссоциация крупных нефосфорилированных структур Hsp27 ( 1%) с увеличением средних и малых фосфорилированных (p-Ser15,78,82) ассоциаций шаперона (35% и 65% соответственно). Действие стауроспорина (индуктор апоптоза) провоцирует снижение количества средних фосфорилированных (p-Ser15,82) (до 8%) и крупных нефосфорилированных (до 26%) комплексов с увеличением мелких фосфорилированных образований Hsp27 (p-Ser15,78,82) (до 66%) [32,251]. В терминальном периоде описанных влияний наблюдается увеличение крупных нефосфорилированных форм шаперона с последующим восстановлением соотношения всех структур [32,251]. Al-Madhoun A.S. и др. (2007 г.) экспериментально также показали, что 17-эстрадиол может активировать фермент р38/МАРК (p38 mitogen-activated protein kinase), который стимулирует фосфорилирование шаперона [27]. Группой исследователей под руководством Lanneau D. (2010 г.) предполается, что фосфопротеины Hsp27 наделенные малыми размерами способны проходить через ядерные поры [196].
На основании вышеизложенного следует, что эстрогены, так же как и многие другие факторы, влияя на активность специфических протеинкиназ, могут фосфорилировать молекулярный шаперон, приводя к диссоциации его крупных структур на мелкие, которые затем транслоцируются в ядро. Вероятно поэтому, у пациенток с сохраненным менструальным циклом мы наблюдали высокие значения Кф (указывает на относительное преобладание клеток с фосфорилированной формой Hsp27) и Кв/р (указывает на относительное увеличение количества клеток с ядерной локализацией Hsp27). Стоит отметить, что экспрессия Hsp27 встречалась в клетках всех структур инфильтративного компонента ИКНТ. У пациенток с сохраненной менструальной функцией, по сравнению с постменопаузальными больными, отмечался достоверно высокий уровень экспрессии фосфорилированной формы Hsp27 в клетках альвеолярных структур и в дискретных группах опухолевых клеток. В солидных структурах у пациенток с сохраненным циклом наблюдалось увеличение и фосфорилированной и нефосфорилированной формы Hsp27. Можно предположить, что различия по уровню функциональных форм Hsp27 в разных морфологических структурах могут быть обусловлены гетерогенной чувствительностью опухолевых клеток к воздействию половых гормонов. Вероятно, в альвеолярных, солидных структурах и в дискретных группах опухолевых клеток под действием половых гормонов протеинкиназы (ПКА, ПКB, p38/MAPK и др.) более активны, либо наблюдается низкая активность фосфатаз (PP2A, PP2B, PP1), чем в опухолевых клетках трабекулярных и тубулярных структур. Кроме того, в группе пациенток с сохраненной менстраульной функцией в трижды негативных опухолях, по сравнению с остальными молекулярно-генетическими типами РМЖ, позитивная экспрессия Hsp27 встречалась реже. Также в опухолях с трижды негативным фенотипом, по сравнению с Her2/neu-позитивным молекулярно-генетическими типами РМЖ (Люминальный B2, Her2/neu-позитивный), отмечались низкие показатели экспрессии Hsp27 (p-Hsp27-Я, Hsp27-Ц, p-Hsp27-Ц, Кф Hsp27, Кв/р Hsp27).
Вероятней всего, это связано с тем, что в опухолях с фенотипами Люминального В2 и Her2/neu-позитивного активированный рецептор Her2/neu запускает сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR, который стимулирует транслокацию фактора транскрипции HSF1 и активирует генный синтез Hsp27 [240]. Тем не менее, мы не показали достоверных различий содержания функциональных форм молекулярного шаперона Hsp27 в опухолевых клетках разных структур инфильтративного компонента ИКНТ, между опухолями с разными молекулярно-генетическими типами, что может быть связано с универсальными внутриклеточными механизмами экспрессии шаперона в данных типах клеток. Известно, что один из классических механизмов стимуляции генной экспрессии Hsp27 реализуется через фактор транскрипции HSF1, который активируется на воздействие различных неспецифических стимулов, сопровождающие любой опухолевый процесс, независимо от фенотипа опухоли (низкий уровень глюкозы, ацидоз, гипоксия и др.) [59]. К специфическим факторам, предопределяющим повышенный уровень экспрессии Hsp27 в опухолевых клетках РМЖ, является уровень половых гормонов, рецепторный статус опухолей, прежде всего в отношении ER и Her2/neu. Вероятно, поэтому в группе пациенток с сохраненной менструальной функцией с трижды негативным молекулярно-генетическим типом РМЖ в опухолевых клетках реже наблюдалась позитивная экспрессия Hsp27.
Оценка взаимосвязи функционального состояния Hsp27 с уровнем экспрессии рецепторов к половым гормонам (ER, PR) и пролиферативной активностью опухоли (Ki-67) в зависимости от Her2/neu статуса рака молочной железы
Полученные нами данные позволили установить, что для опухолей ИКНТ с Her2/neu-негативным и Her2/neu-позитивным статусом наибольшее значение в прогрессии заболевания имеет уровень ядерных функциональных форм Hsp27. Эти данные согласуются с тем, что в ядрах опухолевых клеток РМЖ Hsp27 может стимулировать активность прометастатических генов (Snail, Twist) [86,296], регулировать функциональную активность факторов транскрипции (STAT3, NF-kB) [296,344] и др. Например, Cordonnier T. и др. (2015 г.) показали, что Hsp27 является обязательным фактором для EGF (epidermal growth factor) индуцированной миграции клеток, инвазии, активности MMP, а также для экспрессии маркеров эпителиально-мезенхимального перехода, таких как фибронектин, виментин. Установлено, что Hsp27 стимулирует активность транскрипционных факторов Snail и Slug к репрессии Е-кадгерина на клетках и индуцирует их к эпителиально-мезенхимальному переходу. Показано, что подавление экспрессии Hsp27 уменьшает EGF-зависимое фосфорилирование катенина по тирозину 142 и 654, усиливает убиквитинирование -катенина и его деградацию, предотвращает ядерную транслокацию -катенина и связывание с промотором Slug. Эти данные свидетельствуют о том, что Hsp27 требуется для EGF-опосредованного эпителиально-мезенхимального перехода через модуляцию -катенин/Slug сигнального пути [86]. По данным Shiota M. и др. (2013 г.) ингибирование Hsp27 взаимосвязано со снижением Il-6-зависимого фосфорилирования STAT3, его ядерной транслокацией, что является обязательным для модуляции STAT3/Twiat сигнализации. Известно, что Twist является негативныем фактором транскрипции по отношению к E-кадгерину, наличие которого определяет эпителиально-мезенхимальный переход. Кроме того, использование антисмыслового олигонуклеотида к Hsp27 (OXG-427, Apatorsen) уменьшает количество циркулирующих опухолевых клеток у пациентов с метастатическим раком предстательной железы в фазе I клинических испытаний [296]. В данном случае Hsp27 взаимосвязан с уменьшением межклеточной адгезии (снижение экспрессии Е-кадгерина), повышением активности генов ответственных за мезенхимальный фенотип эпителиоцитов (виментина, фибронектина) [308]. Фосфопротеин Hsp27 также может стабилизировать, транспортировать в ядро и повышать транскрипционную активность регуляторных протеинов, например, андрогенового рецептора [193,369]. Показано, как в опухолевой линии рака молочной железы MCF-7 р-Hsp27 усиливает ядерную транслокацию P53 и экспрессию генов (р21, MDM2), модулируя выживание клеток [352]. Gurgis F.M. и др. (2014 г.) обнаружили, что в опухолевых клетках фосфорилирование Hsp27 связано с ремоделированием актиновых нитей необходимых для проинвазивных и прометастатических свойств опухолей [136,252]. Xu L. и др. установили, что фосфорилирование Hsp27 взаимосвязано с TGF-индуцированной активацией ММР2 [349], тогда как торможение фосфорилирования белка уменьшает миграцию клеток РМЖ [295].
Для опухолей РМЖ с неамплифицированной экспрессией Her2/neu на мембране опухолевых клеток лимфогенное метастазирование сопровождалось увеличением нефосфорилированной формы Hsp27 в цитоплазме. Вероятно, Hsp27 в цитоплазме опухолевых клеток с фенотипом «Her2d» не только участвует в стабилизации рецептора Her2/neu на мембране, а также модулирует его активность и поддержание важных для выживания клеток и прогрессии опухолевого процесса внутриклеточных сигналов. Согласно литературным данным, цитозольная нефосфорилированная форма шаперона может активировать протеины, которые играют ключевую роль в инвазии и метастазировании опухолевых клеток (MMPs [296], Akt [350,362], -катенин [86], виментин [296], белок плотных контактов ZO-1 [296]). Кроме того, в цитоплазме клеток Hsp27 повышает активность регуляторов транскрипции YAP1 и TAZ, которые стимулируют экспрессию прометастатических генов (STAT3, TGF- и др.) [132,327]. В последнее время появились данные, что Hsp27 в опухолевых клектах РМЖ и легких нарушает сигнальный каскад Hippo, за счет убиквитин-зависимой протеосомальной деградации опухолевого супрессора MST1 (mammalian STE20-like kinase 1). Снижение MST1 повышает активность регуляторов транскрипции YAP1 (yes-associated protein 1) и TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif), которые в ядрах опухолевых клеток стимулируют экспрессию прометастатических генов и онкогенный сигналинг TGF-/Smad, Wnt/-catenin, ILK (integrin-linked kinase) [327]. В цитоплазме опухолевых клеток Hsp27 ингибирует компоненты митохондриального пути клеточной гибели посредством предотвращения выхода цитохрома с, Smac [22], инактивирует проапоптотический белок Bax [145], каспазу-3 [245]. Показано, что фактор транскрипции NF-kB находится в цитоплазме в виде комплекса с одним из членов семейства ингибиторных белков I-kB. Hsp27 стимулирует протеосомальную деградацию I-kB, активируя NF-kB. Активная форма NF-kB содействует опухолевому процессу из-за своей способности защищать опухолевые клетки от апоптоза. В том числе NF-B регулирует экспрессию нескольких генов (МMP, IL-8, VEGF и CXCR4), вовлеченных в распространение опухоли и метастазирование [149,156]. Нельзя обойти и тот факт, что гиперэкспрессия Hsp27 локализованного в цитоплазме может быть признаком, ассоциированным с увеличением уровня шаперона во внеклеточном пространстве. Данное предположение основано на способности Hsp27 секретироваться во внеклеточное пространство через везикулярные транспортные системы (лизосомы, экзосомы) и путем прямой транслокации через плазматическую мембрану [43]. В настоящее время известно, что внеклеточный Hsp27 может участвовать в прогрессии опухолевых заболеваний, так как стимулирует экспрессию макрофагами противовоспалительный цитокин IL-10 [281] и регулирует клеточную миграцию повышая экспрессию ICAM-1 [166] и VEGF [213] в клетках эндотелия сосудов.
По результатам проведенного исследования нами была разработана математическая модель, позволяющая определить вероятность наличия метастазов в региональных лимфотических узлах при ИКНТ. Данная модель включает следующие параметры: наличие экспрессии нефосфорилированной формы Hsp27 в ядре опухолевых клеток, состояние менструальной функции пациенток, размер первичной опухоли и степень ее злокачественности, имеет высокую степень достоверности (X2=34,3; р=0,00000). Чувствительность 100%, специфичность 90%.
Таким образом, наличие разноплановых данных о прогностическом значении экспрессии Hsp27 в опухолевых клетках рака молочной железы между отдельными исследованиями может быть связано с различными факторами (размер выборки, методологический подход, гистологический тип опухоли, внутриопухолевая гетерогенность), в том числе с отсутствием информации о функциональном состоянии шаперона. Учитывая ряд факторов, мы показали, что высокая ценность Hsp27, как маркера ассоциированного с лимфогенным метастазированем, определяется комплексной оценкой наличия его ядерной локализации, что ранее было не изучено, с клинико-морфологическими показателями при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы.