Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. HER2/neu как мишень в противоопухолевой терапии 12
1.1.1. Роль HER2/neu в развитии опухолей 12
1.1.2. Механизм действия трастузумаба 12
1.1.3. Терапия трастузумабом 13
1.1.4. Терапия комбинаций трастузумаба и химиопрепаратов 13
1.2. Получение рекомбинантных антител 13
1.2.1. Гибридомные технологии 13
1.2.2. Химерные АТ 15
1.2.3. Гуманизированные АТ 16
1.2.4. Системы экспрессии мАт 18
1.3. Получение рекомбинантных белков из растительного источника 23
1.4. Растительные системы экспрессии мАт 25
1.4.1.Технологии стабильной экспрессии рекомбинантных белков 27
1.4.2. Транзиентная экспрессия рекомбинантных белков 28
1.4.3. Количество и качество получаемого белка 34
1.4.4. Проблемы гликозилирования 34
1.4.5. Получение терапевтических рекомбинантных белков из трансгенных растений 38
1.5. Преимущества и недостатки растений как платформы для получения фармацевтических рекомбинантных белков 40
1.6. Заключение 43
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Векторные конструкции 45
2.2. Nicotiana benthamiana L. – Табак Австралийский 45
2.3. Среды для культивирования бактерий 45
2.4. Агроинфекция 46
2.5. Экстракция целевого белка из листьев Nicotiana benthamiana 46
2.6. Скрининг белка 47
2.6.1. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ) 47
2.6.2. Иммуноферментный анализ (ИФА) 48
2.6.3. Исследование аффинности к экстрациллюлярному домену HER2/neu методом ELISA 49
2.6.4. Исследование анти-HER2 фитоантител методом двумерного белкового электрофореза 49
2.6.5. Вестерн-блоттинг 50
2.6.6. Мечение антител FITC 51
2.6.7. Проточная цитофлуориметрия 52
2.7. Очистка целевого белка, полученного из растительного источника 53
2.8. Гель-фильтрационная хроматография белка 54
2.9. Контроль на наличие эндотоксинов методом ЛАЛ-теста 54
2.10. Определение пирогенности анти-HER2 фитоантител на кроликах 57
2.11. Иммуноцитохимический анализ гиперэкспрессии антигена HER2 с помощью анти-HER2 фитоантител 57
2.12. Концентрирование проб, содержащих белок 59
2.13. Статистическая обработка результатов 59
Глава 3. Результаты собственных исследований 60
3.1. Получение и очистка анти-HER2-фитоантител 60
3.1.1. Наработка растительного материала 60
3.1.2. Экстракция и первичная очистка анти-HER2 фитоантител 62
3.1.3. Разработка протоколов хроматографической очистки анти-HER2 фитоантител 67
3.2. Анализ биохимических свойств анти-HER2 фитоантител 75
3.2.1 Анализ электрофоретической подвижности в ПААГ 75
3.2.2 Анализ электрофоретической подвижности анти-HER2 фитоантител методом двумерного белкового электрофореза 78
3.2.3 Анализ специфической активности анти-HER2 фитоантител in vitro 80
3.2.4 Сравнение эффективности специфического связывания анти-HER2 фитоантител и трастузумаба с антигеном HER2 81
3.2.5. Анализ эффективности связывания анти-HER2 фитоантител с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора HER2 86
3.3. Анализ пирогенности полученных анти-HER2 фитоантител 91
3.4. Заключение 92
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 94
Выводы 106
Список сокращений 107
Список литературы 109
Приложение 128
- Системы экспрессии мАт
- Контроль на наличие эндотоксинов методом ЛАЛ-теста
- Разработка протоколов хроматографической очистки анти-HER2 фитоантител
- Анализ эффективности связывания анти-HER2 фитоантител с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора HER2
Системы экспрессии мАт
В настоящее время доступно несколько систем экспрессии для получения рекомбинантных антител и фрагментов антител, таких как бактерии, дрожжи, растения, клетки насекомых и клетки млекопитающих [62].
Первая успешная экспрессия функционального Fab-фрагмента антитела в E. coli, описана в 1988 году [130]. Экспрессия рекомбинантных фрагментов антител часто приводит к образованию нерастворимых телец включения, которые содержат несобранный белок [139]. Это вызывает необходимость введения стадии рефолдинга для восстановления активности белка. Однако стадия рефолдинга в настоящее время крайне неэффективна и в некоторых случаях потери белка составляют около 90% [108].
Недавно удалось успешно экспрессировать агликозилированые полноразмерные IgG в E.coli [130]. Связывающие свойства восстановленных антител, были полностью сохранены, однако набор эффекторных функций, связанных с Fc-доменом, был потерян [43].
На сегодняшний день бактериальная система не позволяет экспрессировать полноразмерные функциональные антитела, также эта система неспособна выполнять посттрансляционные модификации белков, что имеет важное значение для функций белка. Кроме того, рекомбинантные белки, продуцируемые в E. coli, всегда загрязнены эндотоксинами, которые вызывают ответные иммунные реакции при введении в организм человека [43].
Дрожжевые системы используют для производства рекомбинантных белков, которые не могут быть экспрессированы в E.coli из-за проблем, связанных с фолдингом или гликозилированием [130]. Дрожжи обеспечивают правильное сворачивания гетерологичных белков, а также могут секретировать правильно сложенные и активные белки в среду. Это позволяет легко очистить белок от исходного материала. В отличие от систем экспрессии на основе клеток млекопитающих, дрожжи быстро растут на простых питательных средах. Белки, которые накапливаются в виде нерастворимых телец включения в E.coli, часто экспрессируются в растворимом виде в дрожжах.
Однако дрожжи оказались не в состоянии правильно складывать и секретировать моноклональные антитела. Кроме того, некоторые дрожжи не могут гликозилировать белки или добавляют сахара, которые не встречаются в человеческих белках.
Несмотря на высокие издержки производства из-за дорогостоящих сред и культивирования, а также сложных технологий сегодня на фармацевтическом рынке 60-70% рекомбинантных белков получены из клеточных линий млекопитающих. Популярность этой системы экспрессии обусловлена их преимуществами фолдинга, секрецией рекомбинантного белка и наличием посттрансляционного аппарата. Это упрощает последующее медицинское применение, так как снижает риск иммунного ответа у пациентов [130]. Однако остается возможность вирусного заражения конечного продукта и высвобождения факторов с онкогенными или патогенным потенциалом [130].
Для получения рекомбинантных антител чаще всего используют клетки яичников китайского хомячка (СНО), клетки миеломы мыши NS0, клетки почки детеныша хомячка (ВНК), линии эмбриональных клеток почки человека НЕК-293 и линии клеток человеческой сетчатки PER.C6 (Круцелл, NL) [130]. Клетки CHO и NS0 трансфицируют генами или кДНК антител, кодирующими тяжелые и легкие цепи. Клетки яичников китайского хомячка (СНО) наиболее часто используются для создания полноразмерных антител [130, 139].
Следует отметить, что клетки млекопитающих имеют вариации в гликозилировании в зависимости от вида животных, из которых были получены клетки. Полученные антитела часто гетерогенно гликозилированы [62].
Тем не менее, использование клеток млекопитающих для экспрессии гетерологичных белков имеет ряд недостатков, таких как низкий выход продукта и скорость роста, риск вирусного заражения и потребность в сыворотке крови [139]. Кроме того, в настоящее время стандартный производственный процесс является трудоемким и занимает много времени.
Культуральные среды СНО могут содержать остатки клеток, липидов, ДНК, клеточные белки, вирусы и другие болезнетворные микроорганизмы, а также сывороточный альбумин, трансферрин и сыворотку. Клетки млекопитающих требуют питательные среды более сложные по составу, чем у бактерий или растений, при этом конечный продукт необходимо очистить от патогенов [93].
Трансфекция клеток приводит к высокой неоднородности клонов, что вызывает необходимость проводить повторные процедуры скрининга для определения высокопродуктивных клонов [139]. Прежде чем запускать крупномасштабное производство сначала проводят оценку клона и оптимизацию условий культивирования in vitro в лабораторных биореакторах. Поэтому масштабируемость процесса также является очень сложной задачей [139]. Другим недостатком, связанным с масштабируемостью культур клеток млекопитающих, является их чувствительность к механическим повреждениям, что создает дополнительные трудности для эффективной аэрации в крупных биореакторах. Все вышеперечисленные факторы определяют высокую стоимость конечного продукта.
Альтернативным подходом является использование системы экспрессии на основе трансгенных животных, продуцирующих рекомбинантные белки в молоко или другие жидкости организма.
С помощью трансгенных технологий гены антител человека были введены в организм иммунодефицитных штаммов мышей (XenoMouse, HuMab мыши, Transchromo мыши), не имеющих своих собственных локусов иммуноглобулинов. Эти мыши могут быть иммунизированы специфическими антигенами, после чего их В-клетки начинают синтезировать интактные человеческие антитела [103].
Большинство мАт, полученных из трансгенных мышей, имеют аффинность, сопоставимую с аффинностью мАт, полученных из диких мышей. Использование трансгенных мышей как экспрессионной платформы ограничено коротким периодом жизни животного.
А также человеческие антитела, полученные из мышей, отличаются от нативных антител человека гликозилированием [74]. В настоящее время не было сообщений об иммунных ответах на введение таких антител в ходе клинических испытаний [103].
Таким же методом были получены трансгенные телята, содержащие человеческие искусственно введенные хромосомы со всей последовательностью НС и LC цепей человеческого иммуноглобулина, которые экспрессировали функциональные человеческие иммуноглобулины [130].
Большинство традиционных видов сельскохозяйственных животных также рассматривались в качестве платформы для экспрессии рекомбинантных белков [93]. Тем не менее, из-за сложного химического состава крови очистка целевого белка требует использования дорогих и сложных процедур. Кроме того, кровь не может быть использована в качестве места накопления биологически активных белков, не создавая серьезных проблем со здоровьем для трансгенного животного.
Рекомбинантные белки были экспрессированы в молочных железах животных, таких как мыши, кролики, козы, овцы и коровы. Естественные секреторные свойства этой железы позволяют получать биологически активные и правильно собранные антитела с меньшим риском токсического действия для трансгенного животного [93]. Однако существуют некоторые опасения, связанные с потенциальной иммуногенностью антител, которая может быть вызвана различными моделями гликозилирования, характерными для белков организма-хозяина [130].
Контроль на наличие эндотоксинов методом ЛАЛ-теста
Метод контроля качества по определению содержания эндотоксинов с субстанции рекомбинантных анти-HER2 фитоантител построен на основании известного метода гель-тромб теста (ЛАЛ-тест) (ГФ XII, ч. 1, с. 128).
Стеклянная и пластиковая посуда, используемая в ЛАЛ-тесте, не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должна оказывать влияния на ход реакции. Для проведения процедуры депирогенизации применяется нагревание при температуре 250оC не менее 30 мин.
Растворяли лиофильное содержимое одного флакона с препаратом добавлением 7,0 мл воды для ЛАЛ-теста (основной испытуемый раствор). Полученный раствор разводили апирогенным 50 мМ TRIS буфером, рН 7,4.
В качестве положительного контроля готовили второй образец этого раствора с добавлением контрольного стандарта эндотоксина в концентрации 0,5 ЕЭ/мл (CSE; калиброван по отношению к эталонному стандарту эндотоксина ЕС 6 (RSE)).
Растворы: контрольный стандарт эндотоксина (6 концентраций в диапазоне от 0,005 до 50 ЕЭ/мл) и нулевой контрольный раствор (отрицательный контроль) использовали для построения стандартной кривой.
Растворение и хранение ЛАЛ-реактива и основного раствора стандарта эндотоксина осуществляли согласно инструкции фирмы-производителя.
Приготовление стандартных растворов эндотоксина: после энергичного перемешивания основного раствора стандарта эндотоксина готовили подходящую серию разведений этого раствора, используя воду для ЛАЛ-теста.
Определение максимально допустимого разведения:
Максимально допустимое разведение (МДР) – это разведение образца, при котором может быть обнаружен предел содержания эндотоксина. Для определения МДР используют следующую формулу:
МДР = (предел содержания эндотоксина х концентрация испытуемого раствора)/
Предел содержания эндотоксина: предел содержания эндотоксина для активных веществ, вводимых парентерально, определенных на основании дозы, равен К/ М, где:
К = пороговая пирогенная доза эндотоксина на килограмм массы тела;
М = максимальная рекомендуемая болюсная доза препарата на килограмм массы тела или максимальная суммарная доза, вводимая в течение одного часа.
= маркированная чувствительность лизата в методике гель-тромб тест (МЕ/мл).
Проведение определения
Готовили растворы А, В, С и D, как показано в таблице 4, и использовали испытуемые растворы при разведении меньшем МДР при отсутствии любых способных к обнаружению эндотоксинов.
Раствор А - раствор исследуемого препарата, свободный от подлежащихобнаружению эндотоксиновРаствор В = Тест на мешающие факторыРаствор С = Контроль чувствительности лизатаРаствор D - Отрицательный контроль (вода для ЛАЛ-теста)
Определяли геометрическое среднее концентраций конечной точки растворов В и С путем расчета среднего логарифмов концентраций 4 серий разведения, беря антилогарифм этого значения по формуле: геометрическое среднее концентраций конечной точки=antilog(l/f), где l= сумма логарифмов концентраций конечной точки, используемой серии разведений, f = число повторов.
Разработка протоколов хроматографической очистки анти-HER2 фитоантител
Следующим этапом работы было максимальное концентрирование анти-HER2 фитоантитела с наименьшими потерями и очищение их от практически всех неспецифических белков. Для этого был разработан протокол метода аффинной хроматографии. Колонки HiTrap MabSelect SuRe 5мл (GE Healthcare) промывали и уравновешивали колоночным буфером, затем наносили предварительно очищенный фильтр-картриджами экстракт. После этого колонку промывали 50мл колоночного буфера и проводили элюцию анти-HER2 фитоантител 0,1 М раствором глицина HCL, рН=2,9.
Для оценки эффективности фиксации анти-HER2 фитоантител на сорбенте собирали фракции на выходе. показатель оптической плотности градиент элюирующего буфера показатель электрической проводимости
На хроматограмме (рис. 11) показано, что с помощью аффинной хроматографии происходит почти полная очистка белка от сопутствующих примесей и мельчайших частиц растений. На рисунке 12 видно, что после переосаждения сульфатом аммония элюат фитоантител представлен в виде неоднородного пика.
Показано, что при использовании фильтр-картриджей элюат целевого белка более однородный, но все еще содержит небольшое количество примесей фрагментов антител (рис. 13).
Показатель оптической плотности градиент элюирующего буфера показатель электрической проводимости
На хроматограмме (рис. 14) показано, что после стадии рН-шифтинга с последующей фильтрацией элюат анти-HER2 фитоантител представляет собой чистый гомогенный белковый раствор. На этом этапе происходило концентрирование целевого белка, объем пробы с 800 мл уменьшался до 8-10 мл. При этом потери анти-HER2 фитоантител были минимальны и составляли 1-5% от общего количества белка.
Для подтверждения правильности и структурной целостности антител, а также наличия примесей проводили исследование элюата с хроматографической колонки методом электрофореза в ПААГ в редуцирующих и нередуцирующих условиях. Анализ концентрации целевого белка проводили методом ИФА.
Следующим этапом очистки стало максимальное удаление загрязняющих компонентов очищаемых анти-HER2 фитоантител, не являющихся агрегатами целевого белка, таких как белковые примеси, сходные по размеру с целевым белком, и полисахаридные загрязнения. Для этого был разработан протокол ионообменной хроматографии с использованием сорбента Q-сефароза FF (фирмы GE Healthcare).
Колонки HiTrap Q FF 5мл (GE Healthcare) промывали и уравновешивали колоночным буфером, затем наносили пробу анти-HER2 фитоантител, очищенных с помощью аффинной хроматографии. После этого колонку промывали 50мл колоночного буфера и проводили элюцию анти-HER2 фитоантител раствором снятия.
Для подтверждения правильности и структурной целостности антител проводили исследование элюатов с хроматографических колонок методом электрофореза в ПААГ в редуцирующих и нередуцирующих условиях. Для анализа концентрации целевого белка проводили ИФА.
На рисунке 15 показано, что сначала с колонки смывались примеси, а целевой белок элюировался с колонки одним пиком при повышении концентрации соли до 0,3 М NaCL. При этом оставшаяся часть примесей оставалась на сорбенте и удалялась повышением концентрации соли до 1 М NaCL на стадии отмывки колонки.
На финальной стадии очистки анти-HER2 фитоантител применяли гель фильтрационную хроматографию. Элюат наносили на колонку Superdex 200 16/60 (фирмы GE Healthcare). Характеристики данного сорбента наиболее оптимально позволяли доочистить субстанцию от неспецифических низкомолекулярных примесей, а также позволяли снизить присутствие димеризованных и олигомеризованных форм белка до допустимых уровней. Гель-фильтрационная хроматография позволяла разделить молекулы раствора по молекулярному весу. Этот метод являлся финальной стадией очистки целевого белка, при этом одновременно осуществлялся перевод полученных анти-HER2 фитоантител в буфер для хранения. Также были проведены работы по подбору оптимальной рецептуры для буфера хранения.
На представленной хроматограмме видно, что на финальной стадии очистки целевой белок представлял собой максимально очищенный белковый раствор (рис. 16). В результате гель-фильтрационной хроматографии количество димеризованных форм антител не превышало 1,5-2%, что подтверждалось результатами электрофоретического разделения белков в ПААГ и методом Вестерн-блотт.
Из всего элюированного белка в дальнейшую работу выбирались фракции, соответствующие мономерной форме мАт.
На каждом этапе экстракции и очистки анти-HER2 антител отбирали пробы для проведения качественного и количественного анализа.
Анализ эффективности связывания анти-HER2 фитоантител с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора HER2
Следующей задачей работы стал анализ связывания полученных анти-HER2 фитоантител с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора HER2. Для этого была разработана методика анализа конкуриующего взаимодействия с антигеном HER2 между анти-HER2 фитоантителами и трастузумабом. Эксперимент осуществляли методом проточной цитометрии с использованием клеток, несущих гиперэкспрессию HER2 – SK-BR-3. Оценивалось связывание меченых анти-HER2 антител с клетками SK-BR-3, обработанными анти-HER2 фитоантителами и трастузумабом.
Для этого клетки SK-BR-3 предварительно обрабатывали анти-HER2 фитоантителами либо трастузумабом, после чего инкубировали обработанные клетки с FITC-меченными образцами анти-HER2 фитоантител и трастузумаба различной концентрации.
Далее был поставлен аналогичный эксперимент с расширенным диапазоном концентраций антител.
Полученные результаты показали, что при инкубации клеток SK-BR-3 как с анти-HER2 фитоантителами, так и с трастузумабом происходила практически полная забивка рецепторов HER2 на поверхности клеток.
В результате проведенных экспериментов был показан низкий процент связывания FITC-меченных анти-HER2 фитоантител с рецепторами HER2 на поверхности клеток SK-BR-3, обработанных тратузумабом (от 0,2% до 13,3%), в зависимости от концентрации антител. Аналогично показан низкий процент связывания FITC-меченного трастузумаба с рецепторами HER2 на поверхности клеток SK-BR-3, обработанных анти-HER2 фитоантителами (от 0,8% до 13,8%), в зависимости от концентрации антител. Результат идентичен с данными, полученными при исследовании трастузумаба. Это свидетельствует о том, что образцы анти-HER2 фитоантител связываются с тем же доменом антигена HER2 на поверхности клеток рака молочной железы SK-BR-3, что и препарат сравнения–трастузумаб (табл. 9, 10).