Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1. Эволюция формирования подходов к скринингу колоректального рака 11
1.2. Инструментальные эндоскопические и лучевые методы диагностики КРР. 15
1.3. Лабораторные методы для выявления колоректального рака 23
ГЛАВА II. Материалы и методы 49
11.1. Общая характеристика больных 49
11.2. Методики измерения маркеров 59
11.3. Методы статистической обработки результатов 64
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований и их обсуждение 65
111.1. Исследование диагностической чувствительности и специфичности 5-ти разных копро-маркёров 65
111.2. Сравнение диагностической чувствительности и специфичности всех копро-маркёров, включённых в исследование 121
Заключение 134
Выводы 142
Практические рекомендации 143
Список литературы 144
- Инструментальные эндоскопические и лучевые методы диагностики КРР.
- Лабораторные методы для выявления колоректального рака
- Методы статистической обработки результатов
- Сравнение диагностической чувствительности и специфичности всех копро-маркёров, включённых в исследование
Введение к работе
Актуальность темы
В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями мужского
населения России рак ободочной кишки занимает 5-ое место, а рак прямой кишки – 6-е; а
женского - 4-ое и 7-е соответственно (А.Д. Каприн и соавт., 2014). Заболеваемость за
десятилетний период (2002-2012 гг) имеет выраженную тенденцию к увеличению: на
16,0% - для рака ободочной кишки и на 10,0% - для рака прямой кишки. Смертность за
2002-2012 гг также выросла - на 15,2%. Очевидно, что выживаемость при
колоректальном раке (КРР) определяется стадией опухолевого процесса. В то же время, среди впервые выявленных доля больных с 3-4 стадиями составляет сегодня более 60% (А.Д. Каприн и соавт., 2014). Таким образом, на первый план выдвигается необходимость разработки и внедрения в клиническую практику методологии выявления группы риска развития и наличия этого патологического процесса.
Традиционным для раннего/активного выявления КРР является метод определения
скрытой крови в кале – гемокульттест (gFOBT – guaiac fecal occult-blood test), основанный
на гваяковой реакции или модернизированный Грегерсеном аналог гемокульттеста -
бензидиновая проба. Принцип анализа в этих биохимических тестах основан на оценке
псевдопероксидазной активности гемоглобина в кале. Значимость описанного подхода в
выявлении КРР подтверждена в нескольких рандомизированных контролируемых
скрининговых исследованиях (Faivre J. et al., 2004; et al., 2013). Однако ряд авторов установили недостаточную чувствительность gFOBT (менее 30% для КРР и 15% - для аденом) и много ложноположительных результатов, что в определенной мере ограничивает его применение в клинике. Кроме того, метод считается «некомфортным» для пациетов, т.к. требует ограничений в питании при подготовке к анализу, а при получении положительного результата – 2-3-х кратного повторения.
Большой кластер исследований на пути создания программ активного выявления КРР и предраковых заболеваний толстой и прямой кишки связан с эндоскопическими и лучевыми методами (фиброколоноскопия, сигмоидоскопия, ирригография с двойным контрастированием), «виртуальная колоноскопия» с 2D- и 3D-моделированием et al., 2003, R.E. et al., 2012).
Список сокращений:
gFOBT – guaiac fecal occult-blood test, hHb – гемоглобин человека (h-human), Hp – гаптоглобин, hHb/Hp – комплекс hHb с Hp, Q-FIT (iFOBT, FIT) - immunochemical fecal occult-blood test, fTu M2-PK -опухолевая форма пируваткиназы М2-типа (f - fecal – исследуется в кале), ДУ – дискриминационный уровень, ЖКТ – желудочно-кишечный тракт, КРР – колоректальный рак, НЯК – неспецифический язвенный колит, РЖ – рак желудка, ЭТ – экспресс-тест.
4 Однако проведение систематических обследований населения эндоскопическими методами (как первый этап в активном выявлении КРР) пока не представляется возможным (и не только в России) ввиду экономических соображений. Кроме того, показано, что частота так называемых «интервальных» КРР - в течение года после такого обследования - лишь в 2 раза меньше, чем в общей популяции (Sanduleanu S. et al., 2012; H. et al., 2013).
Параллельно на протяжении последних 20-ти лет не угасал интерес к разработке более чувствительных и специфичных методов выявления скрытой крови и новых опухолеассоциированных маркеров в кале. В частности, был разработан иммуноферментный метод (ІГОВТ - immunochemical fecal occult-blood test или FIT - fecal immunochemical test) обнаружения в кале скрытой крови по гемоглобину человека (hНb), лишнный основных недостатков традиционных биохимических методов. В частности, данный метод не требует от пациента соблюдения предварительной диеты вследствие использования в тесте специфических моноклональных антител к гемоглобину человека.
Далее был разработан иммуноферментный тест для выявления в кале комплекса hНb с гаптоглобином (hHb/Hp). Гаптоглобин (Hp) - глобулин плазмы крови, с высокой аффинностью связывающий свободный гемоглобин плазмы крови человека, ингибирующий его окислительную активность и предотвращающий потерю железа организмом через почки. Предполагается, что комплекс hHb/Hp (в отличие от hHb) более устойчив к действию пищеварительных протеолитических ферментов и, следовательно, ожидается, что он может выявлять гемоглобин при кровотечениях не только из нижних, но и из верхних отделов ЖКТ (Schirrmacher S. et al, 2003).
Одним из новых маркеров, для которого был разработан иммуноферментный метод выявления в кале, является димерная опухолевая форма пируваткиназы (РК - pyruvate kinase) М2-типа - одного из ключевых ферментов гликолиза, интенсивность которого в раковых клетках существенно выше, чем в нормальных (Eigenbrodt Е. et al, 1998; Mazurek S. et al., 2000). По данным исследований, проведнных в Германии, обнаружение в кале повышенных количеств fTu М2-РК характерно для злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (Hardt P.D. et al., 2003; Koss К. et al, 2008).
Таким образом, к настоящему моменту с одной стороны, очевидны перспективы исследования ряда ферментов и метаболитов в кале с целью выявления группы риска наличия КРР. А, с другой стороны, небольшое количество публикаций не позволяет пока составить представление о сравнении диагностической чувствительности иммуноферментных копро-маркров для КРР, предраковых заболеваний и других клинически значимых заболеваний ЖКТ. Это и обосновало цель и задачи настоящего исследования.
Цель
Сравнительное исследование диагностической значимости иммуноферментных копро-тестов в выявлении группы риска наличия КРР и некоторых других заболеваний органов пищеварительной системы, требующих дообследования.
Задачи исследования:
-
Оценить и сравнить диагностическую чувствительность 5-ти новых копро-тестов: (с использованием антител к разным эпитопам гемоглобина человека (hHb) - 3 теста, к комплексу гемоглобина человека с гаптоглобином (hHb/Hp) и к опухолевой форме пируваткиназы М2-типа (fTu M2-PK)) в отношении колоректального рака.
-
Исследовать диагностическую чувствительность 5-ти новых копро-тестов в отношении других заболеваний органов ЖКТ (рака пищевода, рака желудка, полипов толстой кишки и неспецифического язвенного колита).
-
Оценить уровни иммуноферментных копро-маркров у условно здоровых лиц.
-
Разработать концепцию использования новых иммуноферментных копро-тестов, выявляющих в кале hHb, hHb/Hp и fTu M2-PK при злокачественных новообразованиях органов ЖКТ и принципы интерпретации результатов.
Научная новизна
Впервые параллельно исследована диагностическая чувствительность и
специфичность 5-ти копро-тестов: 3-х тест-систем, выявляющих в кале hHb, а также hHb/Hp и fTu M2-PK у одних и тех же категорий больных со злокачественными заболеваниями ЖКТ (колоректальный рак, рак пищевода и рак желудка), неопухолевыми заболеваниями (неспецифический язвенный колит и полипы толстой кишки) и условно здоровых лиц. Показана высокая диагностическая чувствительность 3-х тест-систем, выявляющих в кале hHb, а также hHb/Hp и fTu M2-РК, в отношении колоректального рака, рака желудка, неспецифического язвенного колита.
Установлено, что тест-системы для копро-маркров hHb/Hp и hHb (Q-FIT) в равной мере дают возможность выявить кровотечение как из верхних, так и из нижних отделов ЖКТ. Коэффициент корреляции Спирмена для этих 2-х маркеров равен 0,9, что свидетельствует об их взаимозаменяемости и не позволяет с помощью этих двух тест-систем дифференцировать кровотечения из верхних и из нижних отделов ЖКТ.
Установлено, тест-система для выявления гемоглобина человека в кале (Q-FIT) регистрирует повышенное количество гемоглобина в равной мере при поздних (Т3, Т4) и при ранних (Т1, Т2) стадиях КРР и рака желудка.
6 Установлено, что сочетание копро-маркров - hHb (Q-FIT) и fTu M2-PK обладает наивысшей диагностической чувствительностью в выявлении групп риска наличия КРР (93,3%) и других клинически значимых заболеваний ЖКТ (рак желудка - 69,0%, неспецифический язвенный колит - 78,6%).
Практическая значимость работы
По результатам исследования 5-ти тест-систем для 3-х копро-маркров у больных и доноров, выбрано сочетание из 2-х копро-маркров: hHb (тест-система Q-FIT) и опухолевая форма пируваткиназы (fTu M2-PK), для которых превышение ДУ хотя бы одного из них свидетельствует о принадлежности обследуемого к группе риска наличия клинически значимого патологического процесса в ЖКТ, включая КРР, рак пищевода, рак желудка, неспецифический язвенный колит.
Публикации и апробация диссертации
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 27 ноября 2014 г. на
межотделенческой конференции МНИОИ им. П.А. Герцена – филиала ФГБУ «ФМИЦ
имени П.А. Герцена» Министерства здравоохранения РФ. Результаты настоящего
исследования доложены на конкурсе молодых учных, в рамках VI Международной
конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (10-11 ноября 2009 г.,
Москва), на VII Научно-практической конференции с международным участием
«Молекулярная медицина и биобезопасность» (27-28 октября 2010 г.), на VII
региональной конференции молодых учных-онкологов, посвящнной памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (27 апреля 2012 года, г. Томск). По теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 10 тезисов докладов, издано 1 пособие для врачей.
Структура и объм диссертации
Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Глава «Список литературы» содержит 151 источник, из которых 26 отечественных и 125 зарубежных. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 43 таблицами.
Инструментальные эндоскопические и лучевые методы диагностики КРР.
Целесообразность проведения скрининга для выявления КРР продиктована его лидирующим местом, как в структуре заболеваемости, так и смертности в мире, в т.ч. и в России [8,9,37,80,112,145] . При этом доля III – IV стадии заболевания среди первичных больных КРР остается высокой, приближаясь к 60%, а доля активно выявленных случаев имеет тенденцию к снижению: 2,7% против 3,0% при раке ободочной кишки и 7,4% против 7,7% -при раке прямой кишки (2012 г. в сравнении с 2013 г.) [9]. Риск развития КРР в течение всей жизни составляет у мужчин 6,02%, а у женщин – около 5,77%, и вероятность заболеваемости КРР значительно возрастает после 50 лет [14].
Пятилетняя выживаемость больных в значительной мере определяется стадией болезни на момент постановки диагноза [14,18,25]. Так, при локальной форме рака она составляет 92%, при раке с регионарными метастазами – 64%, при раке с отдаленными метастазами – 7%. В 41% случаев диагностика рака происходит на стадии неинвазивного рака, в 35% - при наличии метастазов в регионарных лимфатических узлах, в 16% - с отдаленными метастазами [18]. В западных странах структура выявляемости КРР по стадиям сходная. Так, в США у 37% первичных больных КРР выявляется без метастазов, у 28% - с регионарными метастазами и у 35% - с отдаленными [14,37,112]. Таким образом, поиск путей активного выявления рака и предраковых заболеваний толстой кишки остается весьма актуальной проблемой и диктует необходимость разработки и внедрения в клиническую практику методов скринингогвого типа.
Рак ободочной и рак прямой кишок часто объединяют общим названием «колоректальный рак» по причине наличия множества общих анатомических и морфологических черт. В подавляющем большинстве (более 90%) злокачественные опухоли толстой кишки – это различные виды аденокарцином [25]. Карциноидные опухоли, которые развиваются из гормонопродуцирующих клеток кишки, стромальные опухоли - из соединительной ткани и мышечных слоев стенки толстой и прямой кишок, а также лимфомы - опухоли из клеток иммунной системы, встречаются существенно реже [25].
Учитывая рост заболеваемости раком, Всемирная ассамблея здравоохранения на 58-ой сессии, проходившей в мае 2005 года в Женеве, приняла резолюцию о разработке стратегий профилактики рака и борьбы с ним [2]. Было отмечено, что во многих странах, существуют или разрабатываются программы по борьбе с раком (в частности с КРР), однако все еще имеется значительный разрыв между накопленными знаниями и их применением на практике. Актуальность проблемы подтверждают посвященные скринингу КРР программные доклады на 3-й международной конференции в Дублине (J. Faiver Screening for colorectal cancer: who, when, how?) в 2001г., на 14-й Европейской гастроэнтерологической неделе (UEGW) в Берлине в 2006г., в Сан Диего, на съезде Всемирной организации эндоскопистов (WEO) в 2012 году [52,140].
Скрининг (от англ. to screen – просеивать, отбирать) – массовое обследование лиц для выявления группы с высокой вероятностью наличия определенного заболевания при отсутствии его симптомов. Понятие «онкологический скрининг», введенное еще в 50-е годы, подразумевает развитие и внедрение в практическое здравоохранение методов активного выявления лиц с наиболее часто встречающимися злокачественными новообразованиями или факторами риска их развития [19]. Примером успешного скрининга может служить маммография, позволившая увеличить выявление рака молочной железы в ранних стадиях и снизить уровень смертности от него в развитых странах [60,119]. Началом скрининга считается опубликованная в 1941 году работа американского, физиолога и анатома G.N. Papanikolaou, использовавшего для изучения влагалищных мазков разработанную им методику полихромной окраски. А в монографии G.N. Papanikolaou и H.F.Traut (1943 г.) были описаны основные принципы цитологической диагностики рака шейки матки и постулаты диагностики, соответствующие современному смыслу скринингового мероприятия [12,139]. Сегодня считается, что массовый скрининг может быть основан, прежде всего, на применении чувствительных, низкозатратных, не требующих (на первом этапе) врачебного осмотра, методов.
Важная роль в активном выявлении больных КРР остается за профилактическими осмотрами. Однако сегодня в России показатель выявляемости при профосмотрах не превышает 1% [19]. Так, некоторое количество случаев «немых» злокачественных новообразований нижних отделов кишечника можно заподозрить при пальцевом исследовании прямой кишки, которое считается обязательным, но выполняется далеко не всеми врачами при первичном обращении пациента. Сбор анамнеза и анкетирование также имеют важное значение для формирования групп риска наличия КРР [19]. Профилактические осмотры ряд авторов предлагают дополнять эндоскопическими исследованиями [59,147]. Ввиду того, что группу высокого риска развития КРР составляют, прежде всего, лица с отягощенным семейным анамнезом (включая семейный аденоматозный полипоз), постановка на учет и мониторинг таких пациентов любым из скрининговых методов поможет обнаружить у них предраковое заболевание или КРР на ранних стадиях развития. Итоговым результатом в систематизации подходов к скринингу лиц с риском развития КРР и их мониторингу стала разработка Руководств с рекомендациями по применению тех или иных методов в зависимости от возраста и степени риска наличия злокачественного заболевания. Примером могут служить Руководства Всемирной гастроэнтерологической организации (WGO) [147].
Лабораторные методы для выявления колоректального рака
За период с 2006 г. по 2013г. в исследование были включены 486 человек 395 первичных больных с заболеваниями ЖКТ и 91 условно здоровый доброволец. Среди первичных больных с заболеваниями ЖКТ исследование выполнено у 180 больных КРР, 121 больного раком желудка (РЖ) и 10 больных раком пищевода (РП), 64 пациентов с неспецифическим язвенным колитом (НЯК) и 20 пациентов – с полипами толстой кишки (ПТК), находившихся на обследовании и лечении в МНИОИ им. П.А. Герцена – филиале ФГБУ «НМИРЦ имени П.А. Герцена» Минздрава России, федеральном государственном бюджетном учреждении "Государственный научный центр колопроктологии имени А.Н. Рыжих" Министерства здравоохранения Российской Федерации и поликлиники «Московской городской онкологической больницы №62 Департамента здравоохранения города Москвы» (Онкологическом диспансере №2).
Больные КРР составили целевую группу исследования, больные злокачественными опухолями РЖ и РП, а также больные НЯК и ПТК сформированы как группы сравнения.
Диагноз у пациентов установлен на основании данных комплексного клинического обследования. Критерием отбора онкологических больных являлся гистологически подтвержденный (после окончания обследования и лечения) диагноз КРР, РЖ, РП. Стадия опухолевого заболевания у пациентов установлена по системе TNM в 6-ой редакции (2002г.)
Распределение обследованных больных и здоровых лиц по полу представлено в таблице 1. В целом, сходное количество мужчин - 45,6% (222 больных) и женщин -54,4% (264 больных) вошли в исследование. Однако женщины преобладали в группе здоровых лиц (79,1%), а также среди больных НЯК (68,5%) и ПТК (60,0%); а в группах КРР, РЖ и РП было несколько больше мужчин: 57,5%, 53,7% и 60,0%, соответственно.
Во всех случаях при гистологическом исследовании опухоли установлена аденокарцинома, в том числе в 6 случаях – вариант слизистой аденокарциномы, в 4 случаях - в сочетании с перстневидно-клеточным раком (таблица 3).
В 44,4% случаев выявлена умеренно дифференцированная (G2) аденокарцинома (здесь и далее - УДК) – 80 больных КРР, в 15,6% (28 больных) – ВДК (G1), в 4,4% (8 больных) – НДК (G3) – табл. 3.
Гистопатологическая характеристика колоректального рака Морфологический тип Количество случаев от общего числа больных КРР (%) Аденокарцинома- высоко дифференцированная (G1)- умеренно дифференцированная (G2)- низко дифференцированная (G3)- без указания степени дифференцировки 171(95,0%)28(15,6%)80(44,4%)8(4,4%) 55(30,6%) Аденокарцинома с перстневидно-клеточным компонентом- низкодифференцированная (G3)- без указания степени дифференцировки 3(1,7%) 1(0,5%) 2(1,2%) Слизистая аденокарцинома- низкодифференцированная (G3)- без указания степени дифференцировки 5(2,7%) 1(0,5%) 4(2,2%)
Слизистая аденокарцинома с перстневидно-клеточным компонентом 1(0,6%) Всего: 180 (100%) В 77,8% случаев (140 больных) злокачественное новообразование было локализовано в прямой кишке (табл. 4). В значительно меньшем количестве – в левых отделах толстой кишки - 17,2%, правых – 3,9% и у двух больных – в поперечноободочном (1,1%).
Всего: 180 59,9 (27-81) Возраст пациентов с КРР, включенных в исследование, варьировал от 27 до 81 года, в среднем составлял 59,9 лет. Средний возраст больных и диапазон вариации показателя были сравнимы при всех стадиях заболевания (табл. 5).
Поскольку рекомендуется начинать обследование контингента на наличие КРР с 50 лет, то в данном исследовании больные КРР также были разделены на группы: 49 лет и 50 лет. Лица в возрасте до 49 лет в группе больных КРР составляли 16,7% (30 из 180 больных), а в возрасте 50 лет и старше – 83,3% (150 человек). Распределение больных КРР по возрасту и полу соответственно стадии заболевания представлено в таблице 6.
Гистопатологическая характеристика опухолей в группе больных РЖ приведена в таблице 9. Во всех случаях у пациентов при гистологическом исследовании диагностированы различные варианты аденокарциномы желудка (АК). В 25,6% случаях выявлена тубулярная АК: высокодифференцированная карцинома (ВДК, степень дифференцировки G1) - в 10,8% случаев, умереннодифференцированная карицнома (УДК, степень дифференцировки G2) – в 14,8% случаев. В трети случаев выявлено сочетание АК с перстневидно-клеточным раком (30,6%), причём в большинстве этих случаев (30 из 37 случаев) опухоли имели низкую степень дифференцировки, а новообразования данного типа преобладали при III и IV стадии заболевания (26 из 37 случаев). Таблица 9 Гистопатологическая характеристика опухолей в группе больных РЖ
Морфологический тип опухоли Число обследованных I II III IV45 7 9 0 11 0153 (100%) 26 20 30 Тубулярная АК 31(25,6%) 14 2 8 Низко дифференцированная АК (G3) 17(14,0%) 3 3 2 Муцинозная АК 1(0,8%) 0 0 1 Перстневидноклеточная АК 23(19,0%) 4 4 4 Перстневидноклеточный рак + коллоидный рак 1(0,8%) 0 1 0 АК+Перстневидноклеточный рак 37(30,6%) 3 8 11 Нет данных 11(9,2%) 2 2 4 Распределение больных РП (10 пациентов) по стадиям заболевания представлено в таблице 10. Больные с I и II стадиями заболевания составили 70,0% от их общего числа в данной группе, 30,0% случаев составили больные с III стадией РП.
В группу больных НЯК (64 человека) вошли пациенты с острым течением процесса (ОЯК) – 13 случаев (20,3%) и хроническим (ХЯК) – 51 случай (79,7%). Средний возраст больных НЯК составил 38,8 (17-75) лет.
В подгруппе ОЯК у 3 пациентов установлено среднетяжёлое течение заболевания, у 4 пациентов – тяжелое. В 6 случаях тяжесть течения ОЯК в клинической документации – без уточнения.
Среди больных ХЯК чаще всего встречалось тотальное поражение толстой кишки (68,6% от всех больных ХЯК). По течению заболевания преобладали случаи хронического непрерывного процесса (45,1%) над случаями ремиссии (23,5%) и случаями хронического рецидивирующого заболевания (9,8%). Тяжесть заболевания была расценена как лёгкая, средняя и тяжёлая в 1,9%, 35,3% и 19,6% случаев, соответственно. В 22 случаях тяжесть течения заболевания в клинической документации – без уточнения.
В группе больных полипами толстой кишки средний возраст пациентов составил 53,4 лет. В большинстве случаев (90%) при эндоскопическом обследовании пациентов были выявлены единичные полипы, а в остальных – множественне. В трёх случаях из двадцати при гистологическом исследовании выявлены ворсинчатые аденомы с умеренной степенью дисплазии, а остальные полипы не имели какой-либо степени озлокачествления.
Основную группу сравнения составили условно здоровые лица, добровольцы (91 человек), не имевшие острых или хронических заболеваний кишечника в анамнезе. В таблице 11 представлено распределение обследованных здоровых лиц по полу и возрасту. Женщины в данной группе значительно преобладали над мужчинами (79,1% vs 20,9%). Число мужчин и женщин в обеих возрастных группах было одинаковым.
Методы статистической обработки результатов
У первичных больных КРР получены следующие результаты. При КРР средний уровень hHb (317,1±56,8 мкг/мл) и медиана показателя (40 мкг/мл) более чем на два порядка превышали соответствующие величны в группе здоровых лиц (отличия статистически достоверны, р 0,001), а максимальные зарегистрированные значения оказались более чем в 1000 раз выше, чем у здоровых лиц. В то же время среди больных КРР были и случаи, когда hHb не превышал верхнюю границу нормы. В целом он оказался повышенным у 89,5% случаев КРР.
Сходные данные получены у больных ЯК: при хроническом течении медиана концентрации hHb (33,0 мкг/мл) и максимальные значения (3461,0 мкг/мл) были близкими к таковым при КРР. В целом это тест оказался положительным у 75,5% больных с ХЯК. При ОЯК значение медианы hHb в кале почти вчетверо превышали таковые при первичном КРР и ХЯК - 140,6 мкг/мл. А доля случаев превышения ДУ составила 92,3%. При хроническом течении средние уровни hHb и максимальные значения были близкими к таковым при КРР (383,2±109,1 мкг/мл). При ОЯК средние значения hHb в кале почти вдвое превышали таковые при первичном КРР и ХЯК - 694,4±281,3 мкг/мл.
Т.о. по значениям медианы hHb и по доле случаев с повышенным ДУ в группах больных НЯК и первичным КРР получены сходные результаты. Иные данные получены при полипах толстой кишки. Значение медианы hHb в кале в этой группе не превышало верхнюю границу нормы (0,6 мкг/мл) и оказалось примерно равным таковому в группе здоровых лиц (отличия статистически недостоверны; р=0,062 - по критерию Манна-Уитни и р=0,064 - по %2-критерию Пирсона), а максимальное зарегистрированное значение (45,8 мкг/мл) и доля случаев превышения ДУ (20,0%) были существенно ниже, чем при первичном КРР (89,5%).
Очевидно, что источником hHb в кале могут быть скрытые кровотечения и из верхних отделов ЖКТ. Возможность выявления этого hHb в кале определяется чувствительностью к протеолитическим ферментам ЖКТ эпитопа молекулы hHb, выявляемого конкретной тест-системой (методом). В связи с этим, в исследование были включены больные раком желудка (РЖ) и раком пищевода (РП), составившие группу сравнения к целевой группе больных КРР.
При РЖ средний уровень hHb (Q-FIT) более чем в 30 раз превосходил верхнюю границу нормы (78,7±40,7 мкг/мл), причём показатель медианы оказался равным значению верхней границы нормы (2,0 мкг/мл). У отдельных больных зарегистрированы такие же высокие значения, как при КРР (максимальное значение 3582,0 мкг/мл), и этот маркёр в целом оказался положительным у половины больных РЖ (50,4%). При РП также встречались случаи повышения hHb в кале. Они составили 20,0% от всех новообразований пищевода, а максимальные зарегистрированные значения лишь несколько превосходили верхнюю границу нормы (2,7 мкг/мл), а значение медианы оказалось в нормальном диапазоне (1,0 мкг/мл).
Т.о., повышенные уровни hHb в кале (скрытые кровотечения) выявлены методом Q-FIT при КРР и ОЯК в примерно 90%. При РЖ этот маркёр оказался положительным в половине случаев, а при полипах толстой кишки – лишь у каждого пятого больного.
На рисунке 1 полученные данные представлены в виде распределения случаев по уровню hHb в кале. Рис. 1. Распределение случаев по уровню hHb в кале, выявленного методом Q-FIT, в соответствующих группах пациентов и здоровых лиц
Более чем в 80% случаев при КРР и НЯК в стадии обострения, а также почти в половине случаев при хроническом НЯК уровень hHb в кале более чем в 10 раз превышал верхнюю границу нормы (2,0 мкг/мл). Повышенные значения показателя, соответствующие диапазону 2,0 - 20 мкг/мл, а также значения показателя в пределах нормы при данных заболеваниях встречались только в единичных случаях. В то же время, более чем в 80% случаев при РП или полипах кишки, а также у 95% здоровых людей, концентрации hHb в кале не превышали ДУ 2,0 мкг/мл. Распределение показателя по указанным интервалам вариации величин у больных РЖ «заняло» промежуточное положение (рис. 1).
Нами поставлена задача уточнения оптимального значения дискриминационного уровня маркёра hHb для оценки возможного увеличения его чувствительности в отношении выявления скрытых кровотечений у больных КРР без существенной потери специфичности. Задача обусловлена тем, что тест-система Q-FIT является новой и не апробирована в клинике в систематических исследованиях. Согласно рекомендации производителя тест системы (Q-FIT) величина верхней границы нормы (т.е. дискриминационного уровня) близка к 2,0 мкг/мл. Мы провели анализ собственных данных – уровней hHb, измеренных методом Q-FIT, у первичных больных КРР и у доноров при разных значениях ДУ. На рисунке 2 изображены соотношения показателей чувствительности в отношении скрытых кровотечений у больных КРР и специфичности (относительно доноров) маркёра (hHb) при различных ДУ (от 0,4 до 3,0 мкг/мл).
Сравнение диагностической чувствительности и специфичности всех копро-маркёров, включённых в исследование
В данном разделе результаты исследования всех копрологических маркёров в группах пациентов и здоровых лиц будут рассмотрены в сравнительном аспекте. В таблице 36 представлены сводные результаты оценки доли случаев повышения маркеров во всех обследованных группах. В таблицах 37 и 38 – результаты статистической обработки данных, отражающие достоверность отличий по данному параметру между группами пациентов и здоровых лиц, в таблице 38 - достоверность отличий по данному параметру результатов отдельно взятых тестов, по сравнению с тестом Q-FIT, который позволил обнаружить hHb (скрытую кровь) в кале при КРР в наибольшем относительном количестве случаев.
Как видно из таблицы 36, Q-FIT, выявляющий в кале гемоглобин человека, и hHb/Hp, выявляющий комплекс гемоглобина человека с гаптоглобином, обладают сходной диагностической чувствительностью у всех категорий больных с заболеваниями, локализующимися как в верхних, так и в нижних отделах ЖКТ. Однако чувствительность тест-системы hHb/Hp - несколько ниже у всех категорий обследованных. Максимальные различия в диагностической чувствительности hHb и hHb/Hp 10%.
Как видно из данных статистической обработки, представленных в таблице 37, повышенный уровень всех копрологических маркеров достоверно чаще, чем у здоровых лиц, встречается как при КРР, так и при НЯК. Содержание в кале маркеров hHb (Q-FIT), hHb/Hp и fTuM2-PK достоверно чаще, чем у здоровых лиц, повышено при РЖ. Кроме того, содержание в кале маркеров hHb/Hp и fTuM2-PK достоверно чаще превышает норму при полипах толстой кишки. Следует отметить, что повышенный уровень fTuM2-PK в кале достоверно чаще, чем у здоровых лиц, встречается при всех исследованных нами заболеваниях органов ЖКТ.
Результаты статистической обработки, представленные в таблице 38, демонстрируют, что, по сравнению с тестом Q-FIT, тест FOB Gold достоверно чаще дает отрицательный результат в отношении наличия hHb (скрытой крови) в кале при КРР, а повышенный уровень маркера fTuM2-PK достоверно реже определяется в кале при КРР, чем скрытая кровь по результатам теста Q-FIT. Тесты FOB Gold и ЭТ достоверно реже обнаруживают гемоглобин в кале при РЖ.
Предположение ряда авторов о том, что hHb/Hp будет иметь преимущество над hHb (Q-FIT) в диагностической чувствительности в отношении выявления скрытых кровотечений при заболеваниях верхних отделов ЖКТ (РЖ и РП) оказалось неверным. Об этом свидетельствуют как данные, приведённые в таблице 37, так и прямое сопоставление показателей этих копро-маркёров при КРР (рис. 11), РЖ и РП (рис. 12) и НЯК (рис. 13).
Коэффициент ранговой корреляции Спирмена для этих маркёров при КРР составил 0,6 (р=2,0 ), при РЖ – 0,7 (р=2,0), при НЯК – 0,9 (р= 2,0). Т.е. эти маркёры представляются не дополняющими, а взаимозаменяющими с небольшим преимуществом Q-FIT.
Следовательно, более подходящим в использовании для выявления группы риска наличия злокачественных новообразований ЖКТ является Q-FIT.
В этой работе нами были использованы 2 тест-системы для количественного определения hHb в кале традиционным «ручным» плашечным (Q-FIT) и полуавтоматическим (FOB Gold) методом, который был разработан существенно позже, а также тест-стстема для качественного экспресс определения скрытой крови в кале (ЭТ). Безусловно, работа с полуавтоматическим методом значительно упрощает и ускоряет выполнение анализов, а также снижает риск накопления ошибок, присущих многоэтапному «ручному» методу и, следовательно, FOB Gold, по определению, является более точным методом. К преимуществам ЭТ в сравнении с количественными методами выявления hHb в кале (т.е. в сравнении с Q-FIT и FOB Gold) можно отнести его простоту в использовании, а также то, что он может выполняться пациентом самостоятельно в домашних условиях.
При сопоставлении результатов анализов Q-FIT и FOB Gold выявлено, что доля случаев превышения ДУ Q-FIT на 20% больше, чем FOB Gold при КРР и на 30% - при РЖ (см. табл. 21). Аналогичный показатель ЭТ оказался сходным с таковым у FOB Gold при КРР и РЖ, что обусловлено, скорее всего, использованием в этих тест-системах антител к одному и тому же эпитопу гемоглобина человека.
Преимущества теста Q-FIT были подтверждены в ходе прямого сопоставления доли случаев превышения ДУ трёх тестов на скрытую кровь у одних и тех же больных КРР, РЖ и здоровых лиц.
Так, доля случаев превышения ДУ при КРР показателем теста Q-FIT оказалась на 20% выше, чем при использовании теста FOB Gold, а при РЖ разница оказалась даже более значительной – аналогичный показатель FOB Gold был почти на 50% ниже, чем у Q-FIT (табл. 39). Следует отметить, что в вошедшей в данное исследование выборке здоровых лиц (11 человек) в 18,2% случаев значения Q-FIT несколько превышали норму, что в процентном соотношении выше аналогичного показателя (4,7%) в общей группе обследованных здоровых лиц (85 человек). Это объясняется тем, что в данном исследовании в выборку вошли 2 из 4 случаев, в которых Q-FIT был выше нормы (табл. 36 vs 39).
Таким образом, Q-FIT в плашечном варианте является наилучшим из двух количественных тестов, а полуавтоматический FOB Gold пока не может быть рекомендован для клинического использования. Наиболее вероятной причиной низкого показателя доли случаев превышения ДУ FOB Gold является недостаточная экстракция hHb из кала, что связано с экстрагирующими свойствами буфера. Увеличение времени экстракции, а также снижение ДУ до величин, даже существенно снижающих специфичность, не приводят к значительному повышению чувствительности метода.
Качественный ЭТ, в сравнении с Q-FIT, также имеет более низкий показатель доли случаев превышения ДУ при КРР (78,3% vs 89,5%) и при РЖ (12,0% vs 50,4%). Это подтверждается и прямым сопоставлением данного параметра тестов на одних и тех же образцах кала больных КРР (75,0% vs 91,7%) и РЖ (13,2% vs 60,5%) - табл. 39. И если при КРР различия между Q-FIT и ЭТ недостоверны, то при РЖ эти отличия достигают статистически значимого уровня (табл. 39). Q-FIT по сравнению с FOB Gold и ЭТ в несколько большем проценте случаев выявляет повышенные уровни hHb (кровь в кале) при КРР, значительно чаще обнаруживает кровь в кале при РЖ (р 0,05). Однако тест в части исследованных случаев (18,2%) даёт ложноположительные результаты у здоровыз лиц.
Таким образом, из 4-х тестов, выявляющих в кале hHb: (Q-FIT, hHb/Hp, FOB Gold и ЭТ) Q-FIT оказался наилучшим по показателю доли случаев превышения ДУ, а, следовательно, и диагностической чувствительности в отношении выявления скрытых кровотечений при злокачественных новообразованиях органов ЖКТ и специфичности относительно здоровых лиц.
На следующем этапе мы сравнили по диагностической чувствительности и специфичности Q-FIT и ITu М2-РК - т.е. с маркёром, не связанным с hHb в кале, но ассоциированным с развитием злокачественного новообразования в ЖКТ, как показано выше.