Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Современные представления о патогенезе рака желудка и толстой кишки 13
1.1.1 Современные представления о патогенезе рака желудка 13
1.1.2 Современные представления о патогенезе рака толстой кишки
1.2 Молекулярные маркеры прогноза течения рака желудка и рака толстой кишки 27
1.3 Роль убиквитин-протеасомной системы в развитии рака желудка и колоректального рака 1.3.1 Характеристика убиквитин-протеасомной системы 30
1.3.2 Роль убиквитин-протеасомной системы в патогенезе рака желудка35
1.3.3 Роль убиквитин-протеасомной системы в патогенезе колоректального рака 40
1.4 Роль кальпаинов в развитии рака желудка и толстой кишки 44
1.4.1 Характеристика кальпаиновой системы 44
1.4.2 Роль кальпаинов в патогенезе рака желудка 47
1.4.3 Роль кальпаинов в патогенезе рака толстой кишки 48
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 51
2.1 Клиническая характеристика больных 51
2.2 Материал исследования 54
2.3 Методы исследования
2.3.1 Получение осветленных гомогенатов 54
2.3.2 Фракционирование протеасом 55
2.3.3 Определение активности протеасом 55
2.3.4 Электрофорез 56
2.3.5 Вестерн блоттинг 56
2.3.6 Определение активности кальпаинов з
2.3.9 Статистическая обработка результатов 57
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 60
3.1 Протеасомы и кальпаины в опухолевой и неизмененной ткани желудка и слизистой оболочке при атрофическом гастрите 61
3.1.1 Активность протеасом и их пулов в опухолевой и неизмененной ткани желудка и слизистой оболочке при атрофическом гастрите 61
3.1.2 Экспрессия субъединиц протеасом в опухоли желудка 66
3.1.3 Активность кальпаинов в опухолевой и неизмененной ткани желудка и слизистой оболочке при атрофическом гастрите
3.2 Прогностическая значимость показателей протеасомной системы у больных раком желудка 78
3.3 Определение прогноза исхода заболевания у больных раком желудка на основании показателей внутриклеточного протеолиза 83
3.4 Протеасомы и кальпаины в опухолевой и неизмененной ткани ободочной кишки
3.4.1 Активность протеасом и их пулов в опухолевой и неизмененной ткани ободочной кишки 88
3.4.2 Экспрессия субъединиц протеасом в опухоли ободочной кишки... 93
3.4.3 Активность кальпаинов в опухолевой и неизмененной ткани ободочной кишки
3.5 Прогностическая значимость показателей протеасомной системы у больных раком ободочной кишки 103
3.6 Определение риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки на основании показателей внутриклеточного протеолиза 108
3.7 Протеасомы и кальпаины в опухолевой и неизмененной ткани прямой кишки
3.7.1 Активность протеасом и их пулов в опухолевой и неизмененной ткани прямой кишки 114
3.7.2 Экспрессия субъединиц протеасом в опухоли прямой кишки 117
3.7.3 Активность кальпаинов в опухолевой и неизмененной ткани прямой кишки 121
3.8 Прогностическая значимость показателей протеасомной системы у больных раком прямой кишки 123
3.9 Определение риска развития отдаленных метастазов у больных раком прямой кишки на основании показателей внутриклеточного протеолиза. 125
Заключение 127
Выводы 134
Практические рекомендации 137
Список литературы 1
- Роль убиквитин-протеасомной системы в развитии рака желудка и колоректального рака
- Определение активности протеасом
- Экспрессия субъединиц протеасом в опухоли желудка
- Определение риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки на основании показателей внутриклеточного протеолиза
Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболеваемость злокачественными новообразованиями органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) сохраняет одно из ведущих мест в структуре онкологической патологии. Наиболее распространенными среди них являются рак желудка (РЖ) и колоректальный рак (КРР).
РЖ часто развивается на фоне патологических состояний (атрофический гастрит, полипы желудка) и предраковых изменений слизистой оболочки желудка, которые проявляются в дисплазии различной степени. Для РЖ характерно разнообразие гистологических типов, раннее метастазирование, а также высокая запущенность и смертность [Мартов СИ., 2010]. В структуре заболеваемости онкологической патологией его распространенность составляет 7,0% [Каприн А.Д., 2015].
К другим часто встречающимся злокачественным опухолям ЖКТ относится рак толстой кишки, заболеваемость которым неуклонно растет в последние десятилетия. Рак ободочной и прямой кишки в последнее время принято объединять в понятие КРР. В структуре онкологической патологии распространенность данного заболевания составляет 11,4% [Каприн А.Д., 2015].
Развитие фундаментальных представлений о патогенезе рака желудка и колоректального рака является актуальной проблемой современной онкологии. Решение данной проблемы позволит не только понять закономерности изменения клеточных процессов на молекулярном уровне при развитии опухолей, но и применить полученные знания для поиска новых маркеров прогрессирования заболевания, а также формирования адекватной лекарственной терапии онкологических заболеваний.
Среди протеолитических систем организма, играющих роль в патогенезе онкологических заболеваний, наибольшую значимость приобретают протеасомная и кальпаиновая системы. Роль протеасом в клетке разнообразна и многогранна. Они осуществляют протеолиз около 80% цитозольных, ядерных белков [Шарова Н.П., 2011]. Внушительное число ключевых регуляторных белков клетки элиминируется или процессируется протеасомой. Среди них циклины, ингибиторы циклин-зависимых киназ, фосфатазы, киназы, факторы транскрипции и трансляции. Такая важная биологическая роль протеасомной системы подразумевает, что она неминуемо должна быть вовлечена в патофизиологические процессы, результатом которых является развитие аутоиммунных, воспалительных, вирусных, нейродегенеративных и онкологических заболеваний [Сорокин А.В., 2009; Цимоха А.С., 2010]. Вероятно, протеасомная система играет неотъемлемую роль в механизмах развития злокачественных образований ЖКТ. В этой связи представляется важным изучение внутриклеточных протеиназ. Изменение активности и субъединичного состава протеасом в разные периоды развития опухоли может быть уникальной характеристикой различных стадий заболевания. В настоящее
время проведено лишь частичное исследование протеасом опухолей ЖКТ [Arlt A.,2009;NakataW.,2011].
Кроме протеасомной системы к внутриклеточным протеолитическим системам относится кальпаиновая система [Немова Н.Н., 2010]. Физиологические функции кальпаиновой системы являются многообразными и до конца не изученными. Кальпаины выполняют функцию «модернизации» цитоскелета, протеолитической модификации молекул передачи сигнала, ферментов, белков клеточного цикла, апоптоза и других. Тот факт, что кальпаины расщепляют полипептиды в небольшом числе сайтов, оставляя большие часто каталитически активные фрагменты, указывает на то, что у кальпаинов есть регулирующая или сигнальная функция в клетках [Goll D.E., 2003]. В этой связи, изучение роли кальпаиновой системы в развитии и прогрессировании рака желудка и колоректального рака является весьма актуальным. Вопрос о значении кальпаиновой системы в развитии и прогрессировании опухолей ЖКТ, а также в прогнозе течения заболевания злокачественными новообразованиями в настоящее время остается открытым.
Однако особенности функционирования внутриклеточных
протеолитических систем в ткани РЖ и КРР в зависимости от клинико-морфологических параметров заболевания и его исхода не изучены, что затрудняет оценку роли данных протеолитических систем в опухолевой прогрессии. Изучение состояния протеасомной и кальпаиновой систем представляется актуальным и может послужить основой для разработки маркеров, позволяющих прогнозировать течение РЖ и КРР.
Цель исследования: изучение связи функционирования протеасом и кальпаинов с клинико-морфологическими параметрами заболевания и прогнозом рака желудка и колоректального рака.
Задачи исследования
-
Провести сравнительный анализ активности протеасом, их пулов, субъединичного состава и активности кальпаинов в опухоли желудка, неизмененной ткани, слизистой оболочке при атрофическом гастрите.
-
Провести сравнительный анализ активности протеасом, их пулов, субъединичного состава и активности кальпаинов в образцах опухолей толстой кишки в сравнении с соответствующими гистологически неизмененными тканями.
-
Сопоставить активность протеасом, их пулов, экспрессию субъединиц протеасом, а также общую кальпаиновую активность со стадией заболевания и дифференцировкой изучаемых опухолей.
4. Оценить прогностическую значимость показателей протеасомной
системы и активности кальпаинов в отношении 2-летней общей и
безметастатической выживаемости больных раком желудка и колоректальным
раком.
5. Разработать способы прогнозирования исхода заболевания при раке
желудка и отдаленного метастазирования при раке толстой кишки.
Научная новизна
Впервые при раке желудка показано увеличение химотрипсинподобной
активности протеасом при лимфогенном метастазировании и выявлено
уменьшение активности 26 S и 20 S пулов протеасом в
низкодифференцированных опухолях по сравнению с
умереннодифференцированными новообразованиями. В опухоли желудка показано увеличение экспрессии тотального пула протеасом и экспрессии субъединиц LMP7, LMP2, РА28Р и Rpt6 по сравнению с неизмененной тканью. Также впервые показано увеличение общей кальпаиновои активности при раке желудка по сравнению с неизмененной тканью, слизистой оболочкой при атрофическом гастрите, а также нормальной слизистой желудка.
При раке ободочной кишки впервые выявлено увеличение активности протеасом и их пулов, а также экспрессии иммунных (LMP7, LMP2) субъединиц протеасом в опухоли по сравнению с неизмененной тканью. При локорегионарном метастазировании зарегистрировано увеличение активности 26 S и 20 S пулов по сравнению с группой больных, не имеющих метастазов в лимфоузлы. При наличии отдаленных метастазов, напротив, увеличивается тотальная активность протеасом, что может служить прогностически неблагоприятным фактором течения рака ободочной кишки. Впервые показано, что при наличии отдаленных метастазов снижена экспрессия LMP2 субъединицы протеасом по сравнению с группой больных без отдаленных метастазов. При раке ободочной кишки зарегистрировано увеличение общей кальпаиновои активности как при развитии метастазов в регионарных лимфоузлах, так и при отдаленных метастазах, что также является важным прогностическим фактором.
В отличие от рака ободочной кишки, в опухоли прямой кишки не установлено увеличения протеасомной активности по сравнению с неизмененной тканью. При этом зарегистрировано увеличение общей кальпаиновои активности в опухоли. Кроме того, при раке прямой кишки впервые показано увеличение экспрессии активаторной РА28Р, регуляторной Rpt6 и иммунной LMP2 субъединиц протеасом, по сравнению с неизмененной тканью.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные данные фундаментального характера раскрывают роль протеасомной и кальпаиновои систем в прогрессировании рака желудка и толстой кишки и могут служить основой для дальнейшего изучения патогенеза злокачественных новообразований. Полученные результаты, характеризующие значимое увеличение активности протеасом и кальпаинов при раке желудка, по сравнению с неизмененной тканью, слизистой оболочкой при атрофическом гастрите показывают важную роль данных протеолитических систем в патогенезе рака желудка. Представленные в работе результаты характеризуют зависимость протеасомной и кальпаиновои систем от клинико-морфологических параметров рака желудка и толстой кишки, что также
свидетельствует об участии изучаемых протеолитических систем в разных этапах патогенеза данных заболеваний.
Результаты исследования могут послужить дополнительными критериями прогноза течения рака желудка и толстой кишки. Выявлено, что тотальная активность протеасом и активность 20S пула протеасом, а также экспрессия LMP7 и РА28Р субъединиц протеасом являются значимыми факторами в отношении 2-летней безметастатической выживаемости больных раком желудка, а содержание Rpt6 субъединицы протеасом - 2-летней общей выживаемости.
При раке ободочной кишки зафиксировано, что тотальная активность протеасом и общая кальпаиновая активность в опухолевой и неизмененной ткани ободочной кишки, являются значимыми факторами в отношении 2-летней безметастатической выживаемости больных.
Созданы математические модели прогноза исхода заболевания у больных раком желудка и оценки риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки.
Положения, выносимые на защиту
-
Активность протеасом и их пулов, а также кальпаиновая активность значительно выше в опухоли желудка по сравнению с неизмененной тканью, а также слизистой оболочкой при атрофическом гастрите и нормальной слизистой. Протеасомная и кальпаиновая активность значительно выше в опухоли ободочной кишки по сравнению с неизмененной тканью. Напротив, в опухоли прямой кишки значимое увеличение наблюдалось лишь для кальпаиновой активности. Изменение активности протеасом сопровождалось изменением их субъединичного состава.
-
Химотрипсинподобная активность протеасом и их субъединичный состав, а также активность кальпаинов при раке желудка зависит от местной распространенности опухоли, наличия регионарных метастазов, а также степени гистологической дифференцировки опухоли. При раке ободочной кишки активность протеасом зависит от наличия отдаленных метастазов.
3. Активность протеасом, их субъединичный состав и активность кальпаинов могут служить важными прогностическими факторами в отношении 2-летней безметастатической выживаемости больных раком желудка и раком ободочной кишки. Кроме того, активность 20S пула протеасом, а также экспрессия LMP7 и РА28Р субъединиц протеасом служат значимыми факторами в отношении 2-летней безметастатической выживаемости, а содержание Rpt6 субъединицы протеасом - 2-летней общей выживаемости больных раком желудка.
Апробация работы Основные результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни биохимии в СПбГМУ», (Санкт-Петербург, 2011) и на VII - IX Региональных конференциях молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные
вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012-2014).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, отражающих основные ее положения, в том числе 3 статьи в рецензируемых отечественных журналах, рекомендованных ВАК.
Внедрение результатов исследования
Основные положения и результаты диссертационной работы нашли практическое применение в работе торакоабдоминального отделения Томского НИИ онкологии. Теоретические и практические положения, развиваемые в диссертационной работе, используются в учебном процессе на кафедре биохимии и молекулярной биологии для студентов медико-биологического факультета, а также на кафедре онкологии, для студентов лечебного и педиатрического факультетов Сибирского государственного медицинского университета.
Личный вклад автора
Анализ литературы по теме диссертации, планирование исследования, определение цели и задач, выбор методов исследования, проведение исследования настоящей работы, статистический анализ результатов и написание диссертации выполнены лично автором.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и иллюстрирована 34 рисунками. Библиография включает 152 литературных источника, из которых 49 отечественных и 103 иностранных.
Роль убиквитин-протеасомной системы в развитии рака желудка и колоректального рака
Известно, что повышенный риск возникновения РЖ может быть обусловлен чрезмерным потреблением солёной, жареной, консервированной (в том числе маринованной) пищи; использованием продуктов, заражённых микотоксинами; злоупотреблением алкоголем и курением. Кроме того, установлено, что в регионах с кислой и богатой органическими веществами почвой показатели заболеваемости РЖ выше [13, 32]. В некоторых эпидемиологических исследованиях продемонстрирована обратная связь между потреблением свежих овощей и фруктов, микроэлементов и некоторых витаминов (в частности, Е и С) и частотой развития РЖ. К числу промышленных факторов риска относят производство резины, асбеста, винилхлорида, минеральных масел, хрома и др. [48].
Особое внимание в патогенезе РЖ в настоящее время уделяют генетическим факторам. К доминантным онкогенам относят: гены факторов роста (TGFa, TGF3, VEGF); гены серин/треонин киназ (RAF/MIL, MOS, BCR); гены ядерных транскрипционных факторов (FRA1, FRA2, REL). Канцерогенный эффект доминантных онкогенов связан с гиперпродукцией кодируемых белков. Рефлюкс дуоденального содержимого, бактерии, аутоиммунные процессы, раздражающие пищевые продукты, обусловливающие синтез нитрозосоединений, способствуют разрушению слизистого барьера, развитию воспаления, некрозу регенерировавшей слизистой оболочки. Эти изменения могут приводить к снижению желудочной секреции. В таких условиях возрастает канцерогенное воздействие нитрозосоединений, приводящее к нарастанию атипических реакций с переходом их в преинвазивный и далее в инвазивный рак [11].
Основным предраковым заболеванием считают хронический гастрит (до 90% случаев), в том числе в оперированном желудке. Меньшее значение имеют аденомы (около 8%), гиперпластические полипы (до 3%) и язва желудка (менее 1%) [35].
При хроническом гастрите обнаруживаются дисрегенераторные изменения, которые, в свою очередь, провоцируют ускоренное перемещение клеток из генеративной зоны без полноценной дифференцировки в зоны расположения зрелых высокодифференцированных эпителиоцитов. В результате желудочные железы становятся функционально неполноценными. Таким образом, в метаплазированных железах происходит реорганизация эпителия со смещением зоны пролиферативного компартмента от перешейка желез к основанию и модификация стромальных клеток собственной пластинки слизистой, окружающих измененные железы, по кишечному типу [111].
Известно, что развитию опухоли предшествуют нарушение роста и дифференцировки клеток, и их злокачественное перерождение. Наряду с опасными для здоровья факторами окружающей среды (профессиональные, курение, алкоголизм, неправильное питание) в наше время важнейшим фактором риска канцерогенеза, заслуживающим особого внимания, признано хроническое носительство потенциально онкогенных инфекционных агентов (в частности, Helicobacter pylori (HP) и вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ)) [38]. Таким образом, не вызывает сомнений актуальность изучения роли вирусов и хронической хеликобактерной инфекции в канцерогенезе опухолей эпителиального происхождения. Хеликобактериоз является так называемой медленной инфекцией, что обусловлено длительной, практически пожизненной персистенцией возбудителя в организме человека, его способностью взаимодействовать с иммунной системой и адаптироваться к ее изменениям. Несмотря на то, что в настоящее время доказана роль HP в возникновении MALT-лимфом и РЖ [16, 22, 31], остается много неясных вопросов относительно не только роли этой бактерии в опухолевой трансформации, но и возможного влияния на механизмы опухолевой прогрессии [38].
Известно, что HP вызывает определенные нарушения в клеточном обновлении, приводящие к атрофии слизистой оболочки желудка, дисплазии, кишечной метаплазии - основным характеристикам предрака желудка. Показано, что около 80 % аденокарцином желудка связаны с НР ассоциированным хроническим гастритом, при этом развивается опухоль кишечного типа [8, 23]. Рак диффузного типа, по-видимому, не связан с НР инфекцией, поскольку расшифрована генетическая природа этого заболевания - мутация гена Е-кадгерина [19]. Е-кадгерин является представителем семейства трансмембранных гликопротеинов, осуществляющих адгезивные межклеточные контакты. Е-кадгерин, по-видимому, влияет на регуляцию экспрессии гена р53. Продемонстрировано, что мутации гена Е-кадгерина и разобщение межклеточных контактов вызывают уменьшение экспрессии гена и функциональной активности белка р53 [21].
Взаимоотношения HP и рака различных отделов желудка остаются недостаточно изученными. Существует предположение о том, что эрадикация возбудителя способствует повышению риска развития рака кардиального отдела желудка. Однако в целом показано, что при успешной эрадикации HP происходит значительное уменьшение нейтрофильной инфильтрации, обратное развитие атрофии слизистой оболочки желудка, регресс кишечной метаплазии и дисплазии (обычно легкой степени) преимущественно в теле желудка и только у части больных. Регрессии изменений слизистой оболочки желудка, вызванных HP, в антральном отделе желудка обычно не происходит [22,23,31].
Определение активности протеасом
Среди 46 больных с морфологически верифицированным диагнозом рак ободочной кишки низкая степень гистологической дифференцировки подтверждена в 8 образцах опухоли, умеренная - в 33, высокая - в 5 образцах. Среди 26 больных с морфологически верифицированным диагнозом рак прямой кишки низкая степень гистологической дифференцировки подтверждена в 3 образцах опухоли, умеренная - в 17, высокая - в 6 образцах.
Критериями исключения из исследования служили наличие тяжелой сопутствующей патологии, других диагностированных злокачественных новообразований, а также возраст старше 75 лет.
Сроки наблюдения за больными с диагнозом РЖ составили от 1 до 50 месяцев, среднее время наблюдения - 12 месяцев. У 15 больных за этот период развились отдаленные метастазы, 9 - умерло.
Сроки наблюдения за больными с диагнозом РТК составили от 1 до 50 месяцев, среднее время наблюдения - 13 месяцев. У 16 больных за этот период развились отдаленные метастазы, 3 - умерло.
Материалом для исследования служили образцы опухолевой и гистологически неизмененной ткани, взятой на расстоянии не менее 1 см от границы опухоли, полученные при выполнении радикального оперативного вмешательства. Образцы слизистой оболочки желудка у пациентов с атрофическим гастритом получали при выполнении видеогастроскопии с биопсией. Весь полученный материал имел гистологическую верификацию. Образцы тканей замораживали и хранили при -80С.
Фракционирование протеасом и выделение пулов проводили по методу Е.Б. Абрамовой с соавт. [25]. Все процедуры проводили при 4С. Белки осветленных гомогенатов фракционировали с помощью сульфата аммония в два этапа. Фракцию, обогащенную 26S протеасомами, получали добавлением сульфата аммония до 40% насыщения, фракцию 20S протеасом -добавлением сульфата аммония до 70% насыщения. Сульфат аммония до 40% насыщения вносили порциями до полного растворения соли, затем центрифугировали 20 минут при 10000g и 4С, осадок растворяли в 250 мкл 20 мМ трис-HCl буфера (рН=7,5), содержащем 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1мМ ЭДТА, 20% глицерин. К надосадочной жидкости добавляли сульфат аммония до 70% насыщения, далее процедуру высаливания повторяли.
Химотрипсинподобную активность тотального пула протеасом, активность 26S пула и альтернативных форм протеасом, определяли в осветленных гомогенатах опухолевой, и неизмененной ткани желудка и толстой кишки, а также ткани атрофического гастрита, по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma), утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом [152]. Для оценки активности примесных протеаз применяли специфический ингибитор протеасом -MG132 (Sigma). Реакционная смесь для определения активности тотального пула протеасом и пула 26S протеасом содержала 20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ АТФ. Реакционная смесь для определения активности пула 20 S протеасом имела такой же состав за исключением MgCl2 и АТФ. Реакцию проводили при 37 С в течение 20 мин. Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури.
Электрофоретическое разделение белков для последующего Вестерн-блоттинга проводили по Laemmli в 13% полиакриламидном геле. Пробы наносили в буфере, содержащем 0,0625М трис-HCl (рН 6,8), 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий.
После электрофореза осуществляли перенос полипептидов на PVDF-мембрану (Immobylon, Millipore, США). Иммунодетекцию проводили согласно протоколу для «SNAP i.d.» (Millipore, США) с первичными антителами к субъединицам а1а2аЗа5а6а7, LMP7, Rpt6, LMP2 и PA28J3 протеасом и к Р-актину, а также вторичными антителами goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) и goat ani-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, США) в разведениях, рекомендованных производителем. Затем мембрану подвергали обработке системой хемилюминесцентной детекции ECL (GE Healthcare, Великобритания). Плотность полос оценивали с помощью компьютерной программы «Image J». Стандартизация проводилась относительно Р-актина. Результаты выражали в процентах от содержания субъединиц протеасом в неизмененной ткани. 2.3.6 Определение активности кальпаинов
Определение активности кальпаинов проводили в осветленных гомогенатах по гидролизу Suc-LLVY-AMC. Реакционная смесь содержала 100 мМ Tris-HCl (рН 7,3), 145 mM NaCl, 1 мМ дитиотрейтола и 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, с добавлением 10 тМ СаСЬ. или без него с 30 мкМ ингибитора ALLN (N-ацетил-лейцин-лейцин-норлейциналь) (Sigma). Реакцию проводили в течение 30 мин при 20С. Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность кальпаинов выражали в единицах активности на 1 мг белка.
При статистической обработке полученных результатов использовались перечисленные ниже методы анализа. Критерий Шапиро-Уилка для оценки нормальности распределения выборки.
Критерий Манна-Уитни для оценки значимости различий между независимыми выборками при распределении, отличном от нормального. Критерий Краскела-Уоллиса с поправкой Бонферрони. Различия считались значимыми при р 0,05. Результаты в таблицах представлены в виде Me (ОьОз), где Me - медиана, Qi и ( - нижний и верхний квартили.
При проведении корреляционного анализа для оценки наличия и силы связи между изучаемыми признаками рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Прогностическая значимость признаков в отношении безметастатической и общей выживаемости у больных раком желудка, а также раком ободочной и прямой кишки оценена с помощью программы Survival Analysis, Statistica 6.0. Кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана-Майера. Для сравнения показателей выживаемости в группах был использован обобщенный критерий Гехана-Вилкоксона.
Для создания модели прогноза исхода у пациентов с диагнозом рак желудка и модели оценки риска развития отдаленных метастазов у пациентов с диагнозом рак ободочной кишки был использован дискриминантный анализ. Результатом дискриминантного анализа явились статистические модели, представленные набором линейных дискриминантных функций, определяющих границы принятия решения в пользу той или иной группы (класса).
Экспрессия субъединиц протеасом в опухоли желудка
На следующем этапе работы была оценена взаимосвязь показателей протеасомной и кальпаиновой систем в опухоли желудка. При проведении корреляционного анализа изучаемых показателей, выявлены следующие особенности функционирования систем протеолиза. На рисунке 9 представлена схема взаимного влияния пулов протеасом друг на друга, их вклад в общую активность ферментативного комплекса, а также взаимодействие с кальпаиновой системой и клинико-морфологическими параметрами при РЖ.
Активация протеасомной системы в опухоли желудка протекает с увеличением активности обоих пулов протеасом. Вклад в тотальную активность протеасом пулов 26S и 20S, учитывая коэффициенты корреляции (г = 0,7 и г = 0,6 соответственно), является значительным. Также выявлена взаимосвязь протеасомной и кальпаиновой систем. Так, общая кальпаиновая активность коррелирует как с тотальной активностью протеасом, так и с активностью 26S и 20S пулов (г = 0,4).
Известно, что влияние белков, участвующих в сборке протеасом и в контроле протеасом-зависимого протеолиза, обусловлено воздействием многих факторов и распространяется на оба пула протеасом [150]. Прямая корреляционная зависимость между тотальной активностью и активностью 26S и 20S пулов протеасом отражает изменение состояния протеасомной системы при развитии РЖ. Активация протеасомной системы с участием обоих пулов протеасом выявлена при развитии опухоли.
В литературе имеются данные, что протеасомная и кальпаиновая системы протеолиза тесно связаны друг с другом, для того чтобы структура белков была более восприимчива к протеасомному расщеплению на них сначала должны подействовать кальпаины [43].
Следует отметить, что активность 26S пула протеасом также имеет отрицательную корреляционную связь со степенью гистологической дифференцировки опухоли (г = -0,3). Кроме того, при проведении корреляционного анализа выявлена отрицательная корреляционная зависимость между химотрипсинподобной активностью 26S пула протеасом и экспрессией иммунной субъединицы LMP7 (г = -0,3).
Известно, что замена конститутивных субъединиц на иммунные приводит к изменению активности протеасом [134]. Также содержание LMP7 субъединицы протеасом связано с распространенностью первичной опухоли и наличием локорегионарных метастазов (г = -0,3 и г = -0,25, соответственно). Известно, что иммунные субъединицы, включая LMP7 субъединицу протеасом, играют роль в регуляции состояния иммунной системы, так как продуцируют античенные эпитопы для комплексов ги сто совместимости I класса [65]. Низкое содержание LMP7 субъединицы протеасом, вероятно, приводит к уменьшению пептидных антигенов и способствует формированию механизма «ухода от иммунного ответа».
Таким образом, протеасомы и кальпаины вовлечены в прогрессирование злокачественных опухолей желудка. Вероятно, кальпаины играют важную роль и на этапе канцерогенеза, о чем свидетельствует значительная разница их активности в опухоли желудка, по сравнению с неизмененной слизистой и слизистой оболочкой при атрофическом гастрите. Зависимость ряда показателей протеасомной системы и активности кальпаинов от процесса метастазирования позволяет предположить прогностическую значимость этих параметров при РЖ.
Для оценки прогностической значимости показателей протеасомной системы при РЖ проводился однофакторный анализ с помощью критерия Гехана-Вилкоксона. Изучались 2-летняя безметастатическая и общая выживаемость. Сроки наблюдения за больными составили от 1 до 50 месяцев, среднее время наблюдения - 12 месяцев. Показатели выживаемости оценивали с помощью построения кривых выживаемости по методу Каплана-Майера. Для сравнения показателей выживаемости в группах был использован обобщенный критерий Гехана-Вилкоксона. В исследование были включены такие параметры, как тотальная активность протеасом и активность их пулов, а также их субъединичный состав и общая кальпаиновая активность. Всего в анализ было включено 9 признаков, результаты которого представлены в таблице 9.
Общая кальпаиноваяактивность менее 61-1000 Ед/мг более 61-1000 Ед/мг 22 23 0,37 0,59 Проведенный анализ выживаемости показал, что статистически значимыми факторами в отношении 2-летней безметастатической выживаемости у больных РЖ являются тотальная активность протеасом и активность 20S пула протеасом, а также экспрессия LMP7 и PA28J3 субъединиц протеасом (рис. 10,11,12,13). В отношении 2-летней общей выживаемости - экспрессия субъединицы протеасом Rpt6 (рис. 14).
В исследовании зафиксировано, что уровень тотальной активности протеасом свыше 90-1000 Ед/мг белка и уровень активности 20S пула протеасом свыше 95-1000 Ед/мг белка в опухоли желудка являются неблагоприятными факторами прогноза в отношении безметастатической выживаемости при РЖ.
Показатели 2-летней общей выживаемости больных раком желудка в зависимости от экспрессии протеасомной субъединицы Rpt6. Полученные результаты являются новыми, и позволяют наряду со стандартными факторами прогноза использовать новые молекулярные маркеры прогноза течения РЖ. Совместное применение уже известных клинико-морфологических параметров РЖ с новыми молекулярными критериями, среди которых изменения активности и субъединичного состава протеасом позволят с большей долей вероятности и наиболее достоверно прогнозировать развитие и прогрессирование РЖ, что даст возможность прогнозировать метастазирование РЖ уже на стадии диагностики патологического процесса, и, следовательно, принимать необходимые меры для того чтобы его предотвратить.
Таким образом, при изучении прогностической значимости показателей протеасомной системы при РЖ, показано, что на безметастатическую выживаемость пациентов с диагнозом РЖ влияют тотальная активность и активность 20S пула протеасом, а также экспрессия LMP7 и PA28J3 субъединиц протеасом. Кроме того, на общую выживаемость больных РЖ, влияет содержание Rpt6 субъединицы протеасом.
Для оценки вклада протеасом и кальпаинов в течение РЖ у больных использовался метод дискриминантного анализа. В исследование вошло 45 больных РЖ, которым было проведено только хирургическое лечение.
Для построения модели прогноза исхода заболевания у больных раком желудка были включены следующие параметры: возраст пациентов, стадия Т, наличие метастазов в регионарные лимфоузлы, степень дифференцировки опухоли, общая кальпаиновая активность, тотальная активность протеасом, активность 26S и 20S пулов протеасом, содержание субъединиц протеасом: сумма a, LMP7, LMP2, РА28р, Rpt6.
Определение риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки на основании показателей внутриклеточного протеолиза
Проблема опухолей ЖКТ, важнейшими из которых являются РЖ и РТК в настоящее время является актуальной для ряда стран, к числу которых относится и Россия. Поскольку, большой процент данных заболеваний диагностируется на поздних стадиях процесса, важной является проблема выживаемости данных пациентов. Не смотря на современные понимание патогенеза злокачественных новообразований, молекулярные механизмы развития РЖ и РТК изучены не достаточно.
Известно, что протеасомная и кальпаиновая системы являются важнейшими системами протеолиза, регулирующими многие процессы, протекающие в клетке, включающие пролиферацию, апоптоз, регуляцию клеточного цикла, транскрипцию, неоангиогенез, функционирование иммунной системы.
Роль протеасомной и кальпаиновой систем в развитии таких злокачественных опухолей как рак молочной железы, эндометрия, почки, плоскоклеточных карцином головы и шеи весьма велика. В этой связи, изучение особенностей функционирования протеасомной и кальпаиновой систем при РЖ и РТК представляет большой интерес.
Изучение показателей протеасомной и кальпаиновой систем было проведено на опухолевой и неизмененной ткани желудка, ободочной и прямой кишки, и, следовательно, показана роль данных протеолитических систем в развитии и прогрессировании злокачественных новообразований ЖКТ на разных его участках, что в настоящее время является актуальным.
В работе показано усиление протеасом-зависимого протеолиза за счет увеличения активности протеасом и их пулов в опухоли желудка, по сравнению с неизмененной тканью и слизистой оболочной больных атрофическим гастритом и нормальной слизистой желудка. Повышение активности протеасом и их пулов происходило на фоне изменения их субъединичного состава.
Было произведено изучение показателей протеасомной системы в зависимости от клинико-морфологических параметров РЖ. Так, в группе больных со стадией заболевания T1-4N2M0 зарегистрировано значимое увеличение тотальной активности протеасом, по сравнению с группой больных со стадией процесса T1-4N0-1M0. Кроме того, наблюдалось снижение активности 26S и 20S пулов протеасом в группе больных с низко дифференцированной опухолью, по сравнению с группой больных с опухолью умеренной степени дифференцировки.
Изменение активности протеасом и их пулов происходило совместно с изменением их субъединичного состава. В группе больных со стадией Т1-2N0-1M0 происходило значимое увеличение экспрессии LMP7 субъединицы протеасом, по сравнению с группой больных со стадией T4N1-3M0. Также при РЖ показана взаимосвязь экспрессии иммунных LMP7 и LMP2 и активаторой PA28J3 субъединиц протеасом в зависимости от наличия локорегионарных метастазов.
В исследовании оценена роль кальпаиновой системы в патогенезе и прогнозе РЖ. Выявлено достоверное увеличение общей кальпаиновой активности в опухоли желудка по сравнению с неизмененной тканью, а также слизистой оболочной больных атрофическим гастритом и нормальной слизистой желудка. Кроме того, в группе больных со стадией T2-4N3M0, показано значимое увеличение общей кальпаиновой активности по сравнению с группами больных со стадиями T1-4N0-1M0, T2-4N2M0.
При проведении анализа выживаемости выявлено, что статистически значимыми факторами в отношении 2-летней безметастатической выживаемости у больных РЖ являются тотальная активность протеасом и активность 20S пула протеасом, а также экспрессия LMP7 и PA28J3 субъединиц протеасом. В отношении 2-летней общей выживаемости -экспрессия субъединицы протеасом Rpt6.
Кроме того, построена модель определения прогноза неблагоприятного исхода у больных РЖ на основании показателей внутриклеточного протеолиза, работа которой подтверждена клиническими примерами. По результатам собственных исследований и данных литературы построена схема, отражающая вклад протеасом и кальпаинов в прогрессирование РЖ. Данная схема позволяет понять возможный механизм связи изучаемых показателей с патогенезом РЖ (рис. 33).
Кроме того, в литературе показано, что протеасомы участвуют в деградации белков семества HIF, при нарушении этого процесса наблюдается повышение экспрессии ангиогенных факторов и прогрессирование злокачественных новообразований [36, 59].
Также при увеличении протеасомной активности снижается степень дифференцировки опухоли желудка, а при уменьшении содержания LMP7 субъединицы протеасом показано увеличение распространенности первичной опухоли. По литературным данным установлено, что протеасомы участвуют в регуляции клеточного цикла, поскольку осуществляют деградацию циклинов. р27 является негативным регулятором клеточного деления, вследствие чего обладает свойствами супрессора опухолей [75]. Низкий уровень белка р27 ассоциирован с негативным прогнозом при РЖ [120]. Кроме того, показано, что для функционирования BCL6 при РЖ необходима его деградация с помощью убиквитин-протеасомного пути [60].
Изучение функционирования рака толстой кишки показало принципиальные различия в роли протеасом и кальпаинов для ободочной и прямой кишки. В опухоли ободочной кишки зарегистрировано значимое увеличение тотальной активности протеасом и активности их пулов по сравнению с неизмененной тканью.
Исследование показателей протеасомной и кальпаиновой систем было произведено в сравнении с клинико-морфологическими параметрами рака ободочной кишки. Так, активность 26S и 20S пулов протеасом имела значимое увеличение в группе больных со стадией T2-4N1-3M0, по сравнению с группой больных со стадией T2-4N0M0. Тотальная активность протеасом увеличивалась в группе больных со стадией T2-4N0-3M1, по сравнению с группой больных со стадией T2-4N0-3M0. Кроме того, в группе больных с низкодифференцированной опухолью выявлено повышение активности 20S пула протеасом, по сравнению с группой больных с опухолью высокой степени дифференцировки.
Повышение активности протеасом сопровождалось изменением их субъединичного состава. В группе больных со стадией T2N0-1M0 выявлено достоверное увеличение экспрессии тотального пула протеасом, определяемого по сумме а субъединиц (а1а2аЗа5а6а7) и иммунной LMP2 субъединицы протеасом по сравнению с группой больных со стадией T4N1-ЗМО. Кроме того, в группе больных со стадией T2-4N0-3M0 зарегистрировано значимое увеличение содержания LMP2 субъединицы протеасом, по сравнению с группой больных со стадией T2-4N0-3M1, что позволяет сделть предположение об участии иммунных форм протеасом в гематогенном метастазировании рака ободочной кишки.
В исследовании показано увеличение общей кальпаиновой активности в опухоли ободочной кишки по сравнению с неизмененной тканью. При изучении кальпаиновой активности в зависимости от наличия регионарных и отдаленных метастазов выявлено, что в группе больных со стадией T2-4N1-ЗМО активность протеасом увеличивалась по сравнению с группой больных со стадией T2-4N0M0. Кроме того, общая кальпаиновая активность достоверно увеличивалась в группе больных со стадией T2-4N0-3M1, по сравнению с группой больных со стадией T2-4N0-3M0. Вероятно, кальпаины играют важную роль как в лимфогенном, так и в отдаленном метастазировании рака ободочной кишки.