Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Опухолевые стволовые клетки, их свойства и роль в опухолевой прогрессии 9
1.1.1. Свойства и основанные на них методы выявления ОСК 9
1.2. ОСК и микроокружение 17
1.3. Способы элиминации ОСК 19
1.4. Механизмы, приводящие к приобретению и поддержанию свойств ОСК... 23
1.4.1. Эпителиально-мезенхимальный переход 24
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 36
2.2. Эукариотические клеточные линии 36
2.3. Инфекция опухолевых клеток 36
2.4. Анализ экспрессии генов 37
2.5. Вестерн-блот гибридизация 38
2.6. Иммунофлуоресцентный анализ 40
2.7. Клеточные эксперименты in vitro 41
2.8. Цитофлуориметрический анализ 41
2.9. Определение уровня активности TCF/LEF 2.10. Определение уровня активности каспаз 42
2.11. Эксперименты на бестимусных мышах 43
2.12. Иммуногистохимический анализ препаратов тканей опухолей 44
2.13. Статистическая обработка 45
ГЛАВА 3. Результаты исследования 46
3.1. Влияние изменения экспрессии Е-кадгерина на формирование фенотипа ОСК 46
3.1.1. Получение клеточных сублиний с различным уровнем экспрессии Е-кадгерина 46
3.1.2. Определение минимальной прививочной дозы клеток А549 и НСТ116, исследование скорости роста in vivo и in vitro 51
3.1.3. Влияние изменения уровня Е-кадгерина в линии А549 на метастазирования опухолей 55
3.1.4. Влияние изменений экспрессии Е-кадгерина на долю ОСК в клеточных линиях А549 и НСТ116 56
3.1.5. Влияние изменения уровня Е-кадгерина в линиях НСТ116 и А549 на активацию Wnt/-катенин сигнального каскада и профиль экспрессии маркеров стволовых клеток 58
3.2. Влияние подавления экспрессии Notch1 на формирование фенотипа ОСК 61
3.2.1. Получение клеточных сублиний А549 и НСТ116 с подавленной экспрессией Notch1 61
3.2.2. Влияние подавления экспрессии Notch1 на ЭМП 62
3.2.3. Определение минимальной прививочной дозы клеток А549 и НСТ116, исследование скорости роста in vivo и in vitro 64
3.2.4. Влияние подавления экспрессии Notch1 на долю ОСК в клеточных линиях А549 и НСТ116 и на профиль экспрессии маркеров стволовых клеток 67
3.3. Влияние подавления экспрессии рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 на формирование фенотипа ОСК 71
3.3.1. Получение клеточных сублиний с подавленной экспрессией рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 71
3.3.2. Выявление причины гибели опухолевых клеток при подавлении экспрессии рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 73
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 75
4.1. Роль экспрессии Е-кадгерина в формировании фенотипа ОСК 75
4.2. Роль экспрессии Notch1 в формировании фенотипа ОСК 78
4.3. Роль экспрессии рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 в формировании фенотипа ОСК 80
Заключение 82
Выводы 83
Список сокращений 84
Список литературы 86
- ОСК и микроокружение
- Вестерн-блот гибридизация
- Влияние изменения уровня Е-кадгерина в линии А549 на метастазирования опухолей
- Влияние подавления экспрессии рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 на формирование фенотипа ОСК
ОСК и микроокружение
Анализ туморогенности
В популяции трансформированных клеток присутствуют ОСК, которые можно выделить из общей популяции и инъецировать иммунодефицитным животным, для формирования ксенотрансплантата (рис. 1). Инъекция ОСК приводит к возникновению опухолей у мышей, тогда как инъекция жизнеспособных, но не обладающих свойствами ОСК опухолевых клеток, не приводит к развитию опухоли. Для того чтобы определить, сохраняется ли в полученной опухоли гетерогенность клеточного состава, необходимо выделить из ксенографта ОСК и снова инъецировать вторичному реципиенту. Истинные ОСК сформируют опухоль у вторичного реципиента [100].
Способность к самообновлению и асимметричному делению ОСК, как и нормальные стволовые клетки взрослого организма, способны к самовоспроизведению и асимметричному делению. Стоит подчеркнуть, что самовоспроизведение и пролиферация – это различные процессы. Самовоспроизведение подразумевает способность ОСК поддерживать постоянную численность путём чередования симметричного и асимметричного делений, образуя две ОСК или одну ОСК и одну клетку, не обладающую способностью к самообновлению, и проходящую некоторые этапы дифференцировки. Однако, несмотря на способность к самообновлению ОСК большую часть времени не вступают в пролиферацию. Известно, что для ОСК характерна большая длительность клеточного цикла по сравнению с пролиферирующими клетками [11].
Лекарственная устойчивость ОСК являются причиной устойчивости к лечению и рецидивирования злокачественных новообразований человека. Главным механизмом повышенной лекарственной устойчивости ОСК является увеличение экспрессии в этих клетках АВС-транспортёров. Белки АВС-транспортёров - члены большого суперсемейства белков АВС, предотвращающих накопление ксенобиотиков и токсичных веществ в нормальной клетке. Среди большого числа описанных АВС-транспортёров лишь несколько экспрессируются в ОСК: Multidrug resistance 1 (MDR1) или P-гликопротеин, Multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1) и breast cancer resistance protein (BCRP). Данные белки различны по структуре и по субстратной специфичности [3]. Другим механизмом повышенной устойчивости ОСК к воздействию химических агентов является повышенная активность фермента альдегиддегидрогеназы 1 (ALDH1), обеспечивающей устойчивость к некоторым химитерапевтическим препаратам, например оксазафоринам [138]. ALDH1 обеспечивает детоксикацию клетки, участвует в превращении витамина А в ретиноевую кислоту в печени. Предполагается, что сигнальный путь с участием ретиноевой кислоты – это один из возможных механизмов защиты от окислительного стресса в нормальных СК. Для трансформированных клеток различных этиологий с увеличенной активностью фермента ALDH1 описана повышенная туморогенность и профиль поверхностных антигенов, характерных для ОСК, в настоящее время активность ALDH1 используют в качестве самостоятельного маркера ОСК [19]. Кроме того, для ОСК описано повышение активности системы антиоксидантной защиты, что также способствует повышенной устойчивости к химическим воздействиям [34].
Тест на исключение липофильных красителей Стволовые клетки активно выбрасывают липофильные красители, такие как Hoechst 33342 и родамин, за счёт повышенного уровня экспрессии ABC транспортеров. После инкубации с флуоресцентными красителями и сортировки флуоресцентно-активированных клеток можно выделить субпопуляцию неокрашенных клеток, которые можно считать стволовыми.
В качестве контроля используют клетки, окрашенные после обработки ингибиторами ABC-транспортеров. Наиболее часто используемый ингибитор – верапамил, который воздействует на Р-гликопротеин семейства АВС-транспортеров. Реже используют фумитреморгин С, который ингибирует BCRP-транспортер. Клетки, которые содержат флуоресцентный краситель, считаются терминально дифференцированными (в контексте опухоли) и неспособными к самообновлению [35].
Экспрессия альдегиддегидрогеназы
Считается, что повышенный уровень активности альдегиддегидрогеназы 1 (ALDH1) может использоваться для выделения стволовых клеток как в нормальных, так и в опухолевых тканях [52].
Профиль поверхностных антигенов
ОСК новообразований различной этиологии отличаются профилем экспрессии поверхностных антигенов. Более того, эти молекулы могут оказывать непосредственное влияние на те или иные свойства ОСК. Так, известно, что поверхностные маркёры CD44, CD133 и EpCam необходимы для формирования сферических колоний в неприкреплённых условиях [129]. А EpCam как в виде интактного полипептида, так и в виде фрагментов с или без соответствующих лигандов может мигрировать в ядро клетки, где он играет роль транскрипционного активатора для ряда генов, например, циклина D1 [87]. Ниже приведены наиболее известные и часто встречаемые маркеры ОСК различных этиологий.
CD133 (проминин-1) – это пента-мембранный гликопротеин, взаимодействующий с холестерином и, возможно, участвующий в поддержании структуры мембраны и ее липидного состава. Показано, что он локализуется в выпячиваниях мембраны эпителиальных клеток [30]. CD133 был впервые описан как маркер нейральных стволовых клеток, он также считается маркером нейроэпителиальных клеток-предшественниц. Данный маркер используется для идентификации ОСК в злокачественных опухолях мозга, предстательной железы, печени, толстой кишки, яичника, поджелудочной железы и др. (Таблица 1). Показано, что опухоли с большой популяцией CD133+ клеток обладают лекарственной устойчивостью и неблагоприятным прогнозом развития [38].
Вестерн-блот гибридизация
Определение скорости роста клеточных культур
Клетки НСТ116 и А549 рассевали в 6-луночные плашки по 25 и 50 тысяч соответственно. Для определения скорости роста проводили подсчёт количества клеток в камере Горяева каждые 48 часов в течение 8 дней.
Определение миграционной активности клеток в камере Бойдена
В лунки 6-луночной плашки, содержащей среду DMEM (HyClone), 7% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone), вставляли камеры Бойдена (диаметр пор 8мкм), на фильтр которой сеяли клетки НСТ116 и А549 (5104). Инкубировали 24 часа при 37С и 5% содержанием СО2. Клетки, оставшиеся сверху на фильтре, убирали ватной палочкой, мигрировавшие клетки фиксировали в течение 15 минут в метаноле, окрашивали трипановым синим. Миграционную активность определяли подсчётом клеток на нижней поверхности фильтра в 5 полях зрения при увеличении 100.
Определение колониеобразования в полужидкой среде
Раствор 2,6% метилцеллюлозы (Fluka), приготовленный на дистиллированной воде, смешивали с 2х средой DMEM (содержащей 20% сыворотку и антибиотик) в пропорции 1:1. К смеси добавляли по 200 клеток в объеме 1 мл, тщательно перемешивали и разливали по 5 мл на 6 см чашки Петри с покрытием, неадгезивным для эукариотических клеток. Спустя две недели в чашки добавляли водный раствор кристаллического фиолетового для окраски колоний и переносили в холодильник на 10 часов. Количество и размер колоний оценивали с помощью программы Total Lab ver. 2.0, модуль Colony Counter (Nonlinear Dynamics). клеток/мл ресуспендировали в теплом растворе HBSS c добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки сначала инкубировали с 1 мг/мл красителя Rhodamine123 (R8004, Sigma), затем добавляли 10 мг/мл красителя Propidium Iodide (P4170, Sigma). Окрашивание Rhodamine123 детектировали с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), фильтры 530/30 (BP) для красителя Rhodamine123 и 630/22 BP для красителя Propidium Iodide. В каждом эксперименте оценивали 107 событий. Дальнейший анализ проводили с помощью программ BD FACSDiva Software (BD Biosciences) and WinMDI (by Joseph Trotter, La Jolla, CA, USA).
Для определения TCF/LEF-транскрипционной активности использовали коммерчески-доступную люциферазную лентивирусную TCF/LEF-зависимую репортерную конструкцию (Cignal Lenti TCF/LEF Reporter (luc) Kit: CLS-018L, Qiagen) и систему Steady-Glo Luciferase Assay System (E2510, Promega). Метод основан на том, что под промотор исследуемого гена встраивается фермент люцифераза, который экспрессируется вместе с исследуемым геном и при взаимодействии с люминогенным субстратом испускает люминесценцию. Клетки инфицировались вирусом, содержащим репортерную конструкцию, культивировались в течение 72 часов, а затем 25103 клеток лизировали в 100 мкл буфера Steady-Glo (E2510, Promega), инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Люминесценцию при помощи люминометра (Analog Device), полученные значения нормализовали относительно содержания общего количества белка в образцах.
Для определения активности каспазы-3 и каспазы-7 была использована система Caspase-Glo 3/7 (Promega), для определения активности каспазы-9 использована система Caspase-Glo 9 (Promega). Метод основан на реакции расщепления каспазами люминогенного субстрата и взаимодействия с люциферазой . 25103 клеток лизировали в 100 мкл Caspase-Glo буфера, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Активность каспаз измеряли при помощи люминометра (Analog Device), полученные значения нормализовали относительно содержания общего количества белка в образцах.
Анализ темпов роста подкожных ксенографтов у бестимусных мышей Для опыта использовали бестимусных мыши линии D2J (по 10 животных в каждой экспериментальной группе) в возрасте 8-10 недель. Каждому животному подкожно прививали по 2 опухоли (106 клеток, суспендированных в 100мкл физиологического раствора). Размер опухолей измеряли каждые 3 дня, и их объем высчитывали по формуле: (ширина)(длина)0.5. Продолжительность эксперимента составила 3-4 недели для ксенографтов НСТ116 и 5-6 недель для ксенографтов А549, после чего ткани развившихся опухолей использовали для иммуногистохимического окрашивания.
Анализ туморогенности
Для приготовления клеточной суспензии для инъекции использовали субконфлюентный монослой. Клетки после суспендирования в физиологическом растворе, считали в камере Горяева и готовили суспензии клеток с концентрацией 107/мл, 0,75х107/мл, 0,5х107/мл, 0,25х107/мл для линии А549 и 2х107/мл, 107/мл,
0,75х107/мл, 0,5х107/мл для линии HCT116. Бестимусным мышам линии D2J (по 10 животных в каждой экспериментальной группе) в возрасте 8-10 недель вводили подкожно полученные суспензии опухолевых клеток в четырех различных концентрациях, после чего на 7 день определяли наличие опухоли.
Прививка клеток в среднюю долю правого легкого бестимусных мышей
Для опыта использовали бестимусных мышей возрасте 10-12 недель по 10 животных в каждой экспериментальной группе. Клетки А549 (106, разведенные в 20 мкл физиологического раствора) вводили при помощи инсулинового шприца с длиной иглы 5 мм (Рис. 7). Продолжительность опыта составляла 4-6 недель. Рисунок 7 — Внутрилёгочная прививка опухолевых клеток бестимусным мышам. Прививка производилась поперёк грудной клетки с правой стороны выше рёберной дуги (А) в верхней точке рёберно-ключичной перпендикулярной линии (Б).
Приготовление препаратов и последующее окрашивание
Опухолевые ткани были извлечены из мышей, промыты охлажденным PBS, зафиксированы в 4% параформальдегиде (BioOptica) в течение 24 часов и заключены в парафин. Срезы толщиной 5мкм подвергали депарафинированию – проводке через 5 спиртов по 5 минут в каждом (2 раза о-ксилол, 3 раза 96% этанол). Далее срезы обрабатывали в буфере для демаскировки антигена pH6.0 (Dako) при 940С в течение 40 минут. Активность эндогенной пероксидазы ингибировали 3% Н2О2 при комнатной температуре в течение 10 мин. После этого срезы инкубировали с первичными антителами крысы к CD34 (см. Табл 3) при комнатной температуре в течение часа, дважды отмывали, инкубировали со вторичными антителами, меченными биотином, при комнатной температуре в течение 30 мин, затем срезы инкубировали 15 мин со стрептавидин-HRP-проявочной системой (Dako). Визуализацию окрашивания проводили, используя систему DAB+ (Dako), согласно стандартному протоколу фирмы. После этого препараты окрашивали гематоксилином и заключали (Glycergel, Dako).
Влияние изменения уровня Е-кадгерина в линии А549 на метастазирования опухолей
Так как мы наблюдали транслокацию -катенина в ядро при подавлении экспрессии Е-кадгерина (рис 11, А), мы проверили, будет ли при этом активироваться сигнальный путь Wnt/-катенин. Мы обнаружили многократное увеличение экспрессии Wnt1, а также одного из эффекторов данного сигнального каскада – онкогена c-Myc (рис. 19, А) в обеих клеточных линиях.
Влияние изменения экспрессии Е-кадгерина на активацию Wnt/-катенин сигнального пути. А) Анализ экспрессии генов Wnt1 и c-Myc. мРНК -тубулина использовали в качестве контроля. Б) Анализ активности люциферазы в сублиниях А549 и НСТ116 с введенной репортерной конструкцией, экспрессирующей ген люциферазы под контролем промотора TCF/LEF. Различия между значениями контрольной (shGFP) и экспериментальных групп, достоверные по критерию Стьюдента (р0,05), отмечены звёздочкой.
Затем, с помощью люциферазного анализа TCF/LEF-репортёра мы показали, что подавление Е-кадгерина действительно приводит к увеличению TCF/LEF-зависимой транскрипционной активности (рис. 19, Б) и активации Wnt/-катенин сигнального каскада в клетках А549 и HCT116. Известно, что данный сигнальный каскад может регулировать в том числе и плюрипотентность стволовых клеток в ходе развития, поэтому мы проанализировали уровни мРНК некоторых генов плюрипотентности. Мы отметили увеличение экспрессии генов Нестин, OCT3/4, SOX2 в сублиниях клеток А549 и НСТ116 с подавленной продкуцией Е-кадгерина (рис. 20).
Таким образом, изменения экспрессии Е-кадгерина влияют на долю ОСК в популяциях клеток А549 и НСТ116, вероятно, за счет изменения активности сигнального пути Wnt/-катенин и экспрессии генов, играющих важную роль в поддержании плюрипотентности.
В начале данного раздела нами была сформулирована задача: изучить, как подавление экспрессии белка Notch1 влияет на долю ОСК в популяции клеток аденокарциномы лёгкого и аденокарциномы ободочной кишки человека. Для этого были созданы клеточные линии сублинии клеток А549 и НСТ116 с подавленной экспрессией Notch1.
Создание конструкции, экспрессирующей малую интерферирующую РНК гена Notch1 проводили как описано в разделе 4.1.1. Были выбраны 5 малых интерферирующих РНК гомологичных мРНК человеческого гена Notch1: №1 3 – GATGCCAAATGCCTGCCAGAA –5 (гомологичная 903-923 нуклеотидной последовательности мРНК гена Notch1), № 2 3 – CTTTGTTTCAGGTTCAGTATT–5 (8390-8410нт), № 3 3 – CGCTGCCTGGACAAGATCAAT –5 (1510-1530нт), № 4 3 – GCCGAACCAATACAACCCTCT –5 (6957-6977 нт), № 5 3 – CAAAGACATGACCAGTGGCTA –5 (2304-2324 нт), и протестированы на линии клеток A549 и НСТ116, наиболее эффективно подавляли экспрессию Notch1 две из них (№ 1, 2). Из двух полученных конструкций для дальнейших исследований была отобрана pLKO.1-shNotch1№1 – наиболее эффективно подавляющая экспрессию гена Notch1. Эффективность работы полученных конструкций мы проверили на уровне синтеза мРНК и белка методами ПЦР-анализа и вестерн-блот гибридизации (рис. 21).
Анализ уровня экспрессии Notch1 в полученных сублиниях клеток А549 и НСТ116.
А) Вестерн-блот анализ синтеза Notch1. Белок -тубулин использовали в качестве контроля. Б) ОТ-ПЦР анализ уровня мРНК Notch1 в опухолевых клетках. мРНК -тубулина использовали в качестве контроля. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов.
Известно, что ЭМП может запускать Notch1, поэтому мы проанализировали как при его ингибировании изменяется уровень экспрессии Е-кадгерина и транскрипционных мишеней Notch1, ответственных за прохождение ЭМП. Оказалось, что в клетках с подавленным Notch1 незначительно увеличена экспрессия мРНК Е-кадгерина и снижен уровень экспрессии одного из индукторов ЭМП – фактора Twist1, транскрипционного репрессора Е-кадгерина (рис. 22). Также мы отметили снижение миграционной активности клеток при подавлении экспрессии Notch1 (рис. 23). Таким образом, полученные данные указывают частичную на реверсию ЭМП при снижении уровня Notch1. Однако, при проведении иммунофлуоресцентносго анализа (рис. 24) мы отметили, что в клетках с подавленной экспрессией Notch1 было снижено количество Е-кадгерина и ослаблены межклеточные контакты. Возможно, причина таких изменений в том, что для формирования полноценных межклеточных контаков необходима колоклизация в месте контакта и Е-кадгерина и Notch1, что при подавлении экспрессии последнего невозможно. Данное предположение требует дальнейшего изучения.
Влияние подавления экспрессии рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 на формирование фенотипа ОСК
Для получения ответа на поставленный вопрос мы создали сублинии клеток А549 и НСТ116 с подавленной экспрессией Notch1. Мы обнаружили, что при подавлении экспрессии Notch1 незначительно повышается экспрессия Е-кадгерина и снижается экспрессия Twist1, а также снижается подвижность клеток, что указывает на частичную реверсию ЭМП. Так как существует связь между прохождением ЭМП и приобретением опухолевыми клетками черт ОСК, мы предположили, что подавление экспрессии Notch1 будет сопровождаться снижением доли ОСК. Наше предположение подтвердилось: ингибирование Notch1 приводило к снижению доли ОСК по сравнению с контролем. Так, при анализе туморогенности и формировании колоний в непрекрепленных условиях мы наблюдали снижение количества ОСК в обеих линиях, однако в тесте с исключением красителя в отличии от А549 для линии НСТ116 экспрессией Notch1 не оказывала влияния на долю клекток, исклбчающих краситель. Возможно, в данной клеточной линии экспрессия АВС-транспортеров и лекарственная устойчивость находятся под контролем другого сигнального пути, например TAZ/YAP [32] и не зависит от экспресси Notch1. Таким образом, наши результаты согласуются с результатами других исследований, показывающих роль Notch1 в поддержании фенотипа ОСК, в том числе, и в клетках аденокарциномы легкого и аденокарциномы толстой кишки человека [48, 146, 101].
Помимо оценки туморогенности мы изучили влияние подавления экспрессии Notch1 на скорость роста клеток in vivo и in vitro: ксенографты, формируемые клетками сублиний с подавленной экспрессией Notch1 обладали меньшим финальным объемом по сравнению с ксенографтами контрольных линий; на скорость пролиферации in vitro подавление Notch1 влияния не оказывало. Поэтому мы изучили влияние подавления экспрессии Notch1 на васкуляризацию ксенографтов. Оказалось, что плотность кровеносных сосудов с просветом и крупных сосудов ( 100 мкм) снижалась при ингибировании Notch1, а количество мелких (неразвитых) сосудов достоверно не изменялось. По-видимому, в данном случае экспрессия Notch1 не влияет на закладку новых сосудов в опухоли, но необходима для их развития, так как известно, что данный сигнальный каскад принимает участие в ангиогенезе [156, 130]. Итак, при снижении экспрессии Notch1 не только уменьшается количество ОСК в популяции А549 и НСТ116, но и снижается васкуляризация опухоли, что затрудняет ее рост.
Известно, что для ОСК различных этиологий, например, некоторых типов рака толстой кишки [142], легких [155], РМЖ [33] и других сигнальный каскад Notch является одним из важнейших механизмов поддержания «стволовости», поэтому мы проанализировали, как уровень Notch1 влияет на экспрессию генов плюрипотентности Нестин, OCT3/4, SOX2 и онкоген с-Мус. Подавление экспрессии Notch1 в линии А549 приводило к небольшому снижению экспрессии транскрипционного фактора Oct 3/4 и SOX2, а для линии НСТ116 - к снижению экспрессии SOX2 и Нестина. Кроме того, снижение уровня Notch1 приводило к снижению экспрессии онкогена c-Myc. Таким образом, подавление экспрессии Notch1 способствует снижению уровня экспрессии ряда транскрипционных факторов, участвующих в поддержании плюрипотентности в ОСК рака легких и рака толстой кишки человека. Итак, мы заключили, что подавление экспрессии Notch1 приводит к реверсии ЭМП и, как следствие, к снижению доли ОСК в клетках А549 и НСТ116.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что подавление экспрессии фактора роста эндотелия сосудов VEGF-C в клетках А549 приводит к снижению экспрессии его рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3, частичной реверсии ЭМП, в частности, увеличению содержания Е-кадгерина в межклеточных контактах, уменьшению количества клеток, обладающих свойствами ОСК, а также к снижению метастазирования. В клинической практике применяются ингибиторы VEGF-C с различной селективностью для подавления ангио- и лимфангиогенеза в злокачественных опухолях [120], и возможно их использование для уменьшения популяции ОСК, однако такие ингибиторы обладают рядом побочных эффектов и наиболее перспективным представляется избирательное воздействие на рецепторы VEGF-C. Поэтому мы решили выяснить, как подавление экспрессии рецепторов VEGF-C – VEGFR-2 и VEGFR-3 – влияет на долю ОСК в популяции клеток А549 и НСТ116. Для этого нами были созданы клеточные линии А549 и НСТ116 с подавленной экспрессией данных рецепторов. Мы предполагали, что снижение экспрессии рецепторов, подобно ингибированию VEGF-C, приведет к большей выраженности межклеточных контактов и снижению доли ОСК в клетках А549 и НСТ116. Однако, подавление экспрессии обоих рецепторов ослабляло межклеточные контакты: при подавлении VEGFR-3 незначительно, а при подавлении VEGFR-2 ослабление было существенным. Оказалось, что подавление экспрессии VEGFR-2 значительно снижает количество Е-кадгерина в клетках А549 и НСТ116, что не согласовалось с нашими исходными предположениями и предыдущими результатами [75]. Для большинства злокачественных опухолей подавление экспрессии рецептора VEGFR-2, также, приводило к снижению скорости пролиферации и уменьшению выживаемости клеток [103, 63]. Однако, для некоторых клеточных линий, например, для карциномы яичника, показано, что подавление экспрессии VEGFR-2 приводило к утрате межклеточных контактов, приобретению клетками мезенхимального фенотипа [4]. К сожалению, нам не удалось более детально изучить полученные клеточные линии, так как к 9 дню все клетки погибали. Мы предположили, что подавление экспрессии рецепторов могло запускать апоптоз, однако активации каспаз 9, 7 и 3 мы не обнаружили, что позволило заключить, что клетки гибли не путем апоптоза. Возможно, механизмом клеточной смерти в данном случае является аутофагия или некроптоз (регулируемый некроз), что, безусловно, требует дальнейшего изучения. VEGFR-2 и VEGFR-3-сигналинг имеет огромное значение для жизнедеятельности трансформированной клетки, так как он задействован во множестве процессов, таких как пролиферация, выживание, устойчивость к химиотерапии и др. [36]. Поэтому нет ничего удивительного, что подавление экспрессии данных рецепторов приводило к гибели клеток. Таким образом, применение ингибиторов данных рецепторов представляется перспективным для клинического использования в качестве противоопухолевой терапии.