Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Механизм действия стероидных гормонов 12
1.2. Пути развития гормональной резистентности РМЖ 20
1.2.1. Потеря рецептора эстрогена 20
1.2.2. Лиганд-независимая активация рецептора эстрогена 22
1.2.3. Митогенные сигнальные пути, поддерживающие рост РМЖ в отсутствие эстрогенов 26
1.3. Терапия эстрогензависимого и эстрогеннезависимого РМЖ 32
1.4. PAKs - важные регуляторы ключевых функций клеток 34
1.4.1. Структура семейства РАК-киназ 35
1.4.2. Механизмы регуляция РАК1 36
1.4.3. Эффекторы РАК 1 40
1.4.4. Особенности экспрессии РАК1 в опухолях молочной железы 43
1.5. Роль РАК1 в регуляции гормональной чувствительности РМЖ 45
1.5.1. Развитие гормональной резистентности РМЖ и РАК1 45
1.5.2. Рецепторные тирозинкиназы и РАК1 в регуляции гормональной чувствительности РМЖ 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 49
2.1. Культивирование клеток 49
2.2. Транзиторная трансфекция экспрессионных и репортерных плазмидных конструкций 49 2.3. Репортерный анализ 51
2.4. Получение клеточных экстрактов для SDS-электрофореза в полиакриламидном геле 52
2.5. Иммуноблоттинг 53
2.6. Определение скорости роста клеток МТТ-тестом 54
2.7. Определение метилирования гена в культуре клеток 54
2.7.1. Выделение геномной ДНК 54
2.7.2. Определение метилирования гена 55
2.8. Статистическая обработка результатов 57
2.9. Список использованных реактивов 57
2.10. Оборудование и приборы 59
ГЛАВА 3. Результаты 60
3.1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы 60
3.1.1. Определение содержания РАК1 методом иммуноблотинга 60
3.1.2. Изучение зависимости экспрессии РАК1 от плотности клеточной культуры 61
3.1.3. Влияние ингибитора протеосомной деградации MG-132 на содержание РАЮ 62
3.2. Роль РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы 63
3.2.1. Влияние РАЮ нарост клеток 63
3.2.2. Влияние РАЮ на активность митогенных сигнальных путей 64
3.2.3. Роль а-Ріх, ко-активатора РАЮ, в регуляции активности клеточных сигнальных белков 68
3.2.4. Влияние РАЮ на активность рецептора эстрогенов в клетках эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 72
3.3. РАЮ и выживаемость клеток: роль РАЮ в регуляции роста клеток в условиях гипоксии 75
3.3.1. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF 7иНВЬ-100 75
3.3.2. Роль РАК1 в адаптации клеток MCF-7 к гипоксии 76
3.4. Метилирование РАК1 и его роль в регуляции дифференциальной экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы 80
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 86
4.1. Экспрессия РАК1 в различных линиях РМЖ 86
4.2. РАК1 в стимуляции митогенных путей в клетках РМЖ 87
4.3. РАК1 и выживаемость клеток 89
4.4. Метилирование PARI 90
Заключение 92
Выводы 94
Список использованной литературы
- Лиганд-независимая активация рецептора эстрогена
- Получение клеточных экстрактов для SDS-электрофореза в полиакриламидном геле
- Определение содержания РАК1 методом иммуноблотинга
- РАК1 и выживаемость клеток
Введение к работе
Актуальность проблемы
На сегодняшний день содержание рецепторов эстрогенов (ER) относится к основным критериям определения чувствительности больных раком молочной железы (РМЖ) к гормональным противоопухолевым препаратам [М.А. Красильников, 2004, N. Normanno et al., 2005, R. Clarke et al., 2003, V.C. Jordan, 2003, E.C. Герштейн и др., 2005, B.E. Henderson et al., 2003]. Основной причиной снижения эффективности гормональной терапии РМЖ является переход опухолевых клеток от эстрогензависимого к эстрогеннезависимому росту, что может быть обусловлено как уменьшением содержания рецептора эстрогена, так и рядом других факторов, таких как нарушение баланса между белками-активаторами и супрессорами ER, лиганд-независимая активация ER, а также стимуляция митогенных сигнальных путей, идущих в обход ER и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. Среди последних ведущее значение принадлежит рецепторным тирозинкиназам. До сих пор остается неясным, какие из эффекторов тирозинкиназ являются ключевыми для поддержания эстрогеннезависимого роста и могут ли они играть самостоятельную роль в развитии гормональной резистентности РМЖ.
Одним из важнейших эффекторов тирозинкиназных рецепторов является РАК (р21-активированная киназа) 1 - серин-треониновая протеинкиназа, которая путем фософорилирования различных сигнальных белков участвует в регуляции ключевых функций клетки: роста, выживаемости, организации цитоскелета, клеточной подвижности [Z.S. Zhao, 2012]. Помимо этого, РАК1 фосфорилирует рецептор эстрогенов, причем независимо от лиганда, приводя тем самым к снижению гормональной зависимости ER-положительных клеток РМЖ [A. Ghosh et al., 2013, М. Kok et al., 2011, J. Bostner et al., 2010]. Об участии РАК в регуляции роста ER-негативного РМЖ известно значительно меньше, хотя о возможном включении РАК в эстрогеннезависимые сигнальные пути косвенно свидельствует описываемая в литературе повышенная экспрессия РАК1 в ER-негативных опухолях молочной железы.
Основной темой диссертации явилось исследование внутриклеточных сигнальных путей, ответственных за развитие гормональной резистентности злокачественных опухолей, в частности - изучение роли РАК-сигнального пути в регуляции и поддержании эстрогензависимого и эстрогеннезависимого роста опухолей молочной железы. Среди главных задач работы: исследование значения РАК для активации эстрогеннезависимых митогенных путей; изучение влияния гиперэкспресссии РАК на развитие гормональной
резистетности и анализ возможного механизма подавления РАК в эстрогеннезависимых опухолях.
Цель исследования
Целью данной работы явилось изучение молекулярного механизма действия протеинкиназы РАК1 и ее роли в регуляции роста эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы.
Задачи исследования
-
Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы; изучение зависимости экспрессии РАК-1 от стадии роста клеточной культуры;
-
Изучение роли РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы: влияние РАК1 на рост клеток и активность митогенных сигнальных путей: АР-1, бета-катенина и Snail 1; роль а-Ріх, ко-активатора РАК1, в регуляции активности клеточных сигнальных белков; влияние РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7;
3. РАК1 и выживаемость клеток: изучение роли РАК1 в регуляции роста клеток в
условиях гипоксии;
4. Анализ метилирования РАК1 и его роли в регуляции дифференциальной
экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака
молочной железы.
Научная новизна
В настоящей работе был проведен сравнительный анализ изменений экспрессии РАК1 в эстрогензависимых и эстрогеннезависимых опухолях; выявлены возможные эпигенетические причины сниженной экспрессии РАК1 в ER-позитивных клетках рака молочной железы; исследован механизм поддержания эстрогеннезависимого роста ER-негативных клеток, в том числе с участием ключевых транскрипционных факторов АР-1, бета-катенина/TCF и Snail 1; установлена роль Pix в регуляции эффектов РАК1; впервые продемонстрировано участие РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ в условиях гипоксии. Полученные данные свидетельствуют, что РАК1 является важным фактором, участвующим в поддержании эстрогеннезависимого роста РМЖ, и позволяют
рассматривать РАК1 в качестве перспективного объекта таргетной терапии рака молочной железы.
Практическая значимость работы
Были получены новые данные о роли РАК-сигнального пути в развитии и поддержании гормональной резистентности клеток рака молочной железы, что позволяет установить роль РАЮ и его эффекторов в регуляции эстрогеннезависимого роста клеток РМЖ, а также оценить перспективность таргетной терапии РМЖ, направленной на подавление РАК.
Апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 30 марта 2015 года на объединенной научной конференции лабораторий молекулярной эндокринологии, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов гибели опухолевых клеток, молекулярной биологии вирусов, биохимии опухолей, цитогенетики и отдела химического канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина».
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 286 источников.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОИ РФ соискателям учёной степени кандидата биологических наук.
Личный вклад автора
Автором самостоятельно проведен анализ отечественной и иностранной литературы по изучаемой теме, разработаны протоколы и проведены эксперименты, осуществлены анализ и интерпретация результатов исследования, статистическая обработка полученных данных, формулирование выводов и оформление диссертационной работы.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12. -«онкология», конкретно пунктам 2,3.
Лиганд-независимая активация рецептора эстрогена
Привлечение р23 приводит к формированию зрелого рецепторного комплекса, способного связываться с гормоном с высокой степенью аффинности и, также, характеризующегося присутствием в комплексе дополнительных белковых участников: шарнирный домен (Hinge Domain, HD последовательность сигнала ядерной локализации NLS, С-концевой домен (CD). Взаимодействие стероидного гормона с лиганд-связывающим доменом рецептора приводит к высвобождению Hsp90 и его кошаперонов и конформационной экспозиции элементов, необходимых для димеризации рецептора, его ядерной транслокации и связыванию с ДНК. Ранее для рецептора глюкокортикоидов (GR) был обнаружен регион в домене LBD длиной 114 аминокислотных остатков (550-653), необходимый для взаимодействия с Hsp90 [14]. Также оказалось, что данный регион включает консервативную и для других рецепторов стероидных гормонов последовательность (577-596), возможно определяющую стабильность комплекса рецептора с Hsp90 и его кошаперонами. В результате аналогичных исследований для рецептора прогестерона (PR) и рецептора эстрогена (ER) также было выявлено несолько участков LBD, ответственных за связывание с Hsp90. Однако для ER также была определена роль С-концевого региона (аминокислотные остатки 251-271), с которым связывается кошаперон FKBP52, что необходимо для более стабильного взаимодействия LBD с Hsp90 [13]. Связывание гормона с рецептором приводит к диссоциации последнего от белков теплового шока, его гомодимеризации, транслокации в ядро, где активированный рецептор связывается со специфическими последовательностями ДНК - гормон-респонсивными элементами, состоящие из инвертированных повторов, разделенных разным количеством нуклеотидом. Так например, известно, что рецепторы эстрогенов связываются с инвертированными повторами A/GGGTCA, разделенными тремя нуклеотидами, а рецепторы андрогенов, глюкокортикоидов и прогестинов - с инвертированными повторами AGA/GACA, также разделенными тремя нуклеотидами [15, 16]. Образовавшийся комплекс рецептор-ДНК рекрутирует значительное число других белков (транскрипционных сорегуляторов), что усиливает или ингибирует транскрипцию в мРНК ассоциированного гена-мишени [17]. Функции этих сорегуляторов включают перестройку хроматина, что делает ген более или менее доступным для траскрипции, а также подготовку к взаимодействию с другими регуляторными белками. Данные регуляторные молекулы могут выступать в качестве коактиваторов, которые обладают гистонацетилтрансферазной активностью, что ослабляет связь гистонов с ДНК, и способствует транскрипции генов, или в качестве корепрессоров с гистондезацетилазной активностью, что усиливает ассоциацию гистонов с ДНК, и, следовательно, подавляет транскрипцию гена. Ядерные рецепторы могут напрямую или опосредованно через другие белки связываться с корегуляторами, вовлекаясь во многие внутриклеточные сигнальные пути [18]. Наиболее распространенным механизмом действия рецепторов стероидных гормонов является прямое связывание ядерных рецепторов с гормон-респонсивными элементами, называемый трансактивация. Однако некоторые ядерные рецепторы не могут непосредственно связываться с ДНК, обладая трансрепрессорной активностью в отношение некоторых транскрипционных факторов. Так например, глюкокортикоидный рецептор GR ингибирует промотирующую транскрипционную активность АР-1 и NF-KB [19].
Для молочной железы основными стериодными гормонами, участвующими в регуляции ее роста, являются эстроген и прогестерон [20, 21]. Данные гормоны регулируют развитие молочной железы во время полового созревания, беременности, а также вовлечены в процессы инициации и прогрессии РМЖ.
Самым важным из эстрогенов является эстрадиол (Е2), секретируемый яичниками от начала полового созревания до наступления менопаузы. Его уровень колеблется в течение менструального цикла, достигая пика непосредственно перед овуляцией, после которой эстрадиол в сочетании с прогестероном изменяет эндометрий матки для возможной имплантации оплодотворенной яйцеклетки. В период беременности в дополнение к яичникам эстрадиол секретируется также плацентой. Во время полового созревания, эстрадиол способствует росту и развитию молочных желез и окружающих тканей. В зрелом возрасте он способен усиливать пролиферацию и скорость деления клеток молочной железы, активируя сигнальные пути ERK, PI3K и STAT [22]. Так, было показано, что в ER-позитивных клетках рецептор эстрогена напрямую связывается с тирозинкиназой c-Src и другими цитоплазматическими сигнальными и адапторными молекулами: She, PI3K, MNAR, и р130 Cas. С помощью «knock-down» исследований было найдено, что в ответ на Е2 и на действие эпидермального фактора роста EGF, с участием c-Src происходит фосфорилирование по тирозину транскрипционного фактора STAT5, после чего последний транслоцируется в ядро для запуска транскрипции генов пролиферации клеток. Таким образом, существуют перекрестные связи между действием стероидных гормонов, в частности эстрогена Е2, и факторов роста, что может играть важную роль в возможном снижении устойчивости некоторых опухолей к эндокринной терапии.
Прогестерон секретируется яичниками во время менструального цикла после овуляции (лютеиновой фазы) в том случае, если яйцеклетка не оплодотворена, а также при наступлении беременности в течение первых нескольких недель яичниками, а затем в течение всего срока беременности в плаценте. Прогестерон регулирует развитие протоковой системы, альвеол, необходимых для секреции и доставки молока [23], а также осуществляет контроль за паракринными сигнальными путями через рецепторный активатор лиганда ядерного фактора к-В (RANKL). В середине и в конце беременности прогестерон подавляет секреторную активность через перекрестные PR -, пролактин/StatS - сигнальные пути. Потеря прогестеронвых рецепторов в первичной опухоли ассоциируется со снижением дифференцировки, более инвазивным фенотипом и плохим прогнозом.
Получение клеточных экстрактов для SDS-электрофореза в полиакриламидном геле
Клетки на стадии формирования 80% монослоя промывали и снимали с чашек в физиологическом растворе. Клетки центрифугировали 5 мин. при 3 тыс. об/мин, к осадкам добавляли лизирующий буфер в 2-х вариантах: - содержавший 50 мМ Tris-HCl (рН=7,5), 1 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 1%-ный NP-40, 1 мМ DTT, 1мМ PMSF, 0,1 мМ Na-ортованадат и 1%-ный апротинин (выделение цитоплазматической фракции). - содержавший 50 мМ Tris-HCl (рН=8,0), 10% глицерол, 0.1% Тритон Х-100, 100мкг/мл лизозима, 3 ед. ДНКазы, 2 мМ MgCl (выделение тотальной фракции белков). Образцы озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе Soniprep 150 plus (MSE, Великобритания) при амплитуде 2 и 5-7 циклах в зависимости от образца до полного исчезновения вязкости.
Полученные образцы оставляли на 30 мин на льду; затем центрифугировали в течение 15 минут при 13 тыс. об./мин. при температуре +4С. Концентрацию белка определяли в надосадочной жидкости по методу Бредфорда [272, 273] путем измерения оптической плотности при длине волны 595 нм на спектрофотометре Ultrospec 2100 (GE Healthcare, США) или Multiscan FC (ThermoScientific, США).
Электрофорез образцов, содержавших по 40-80 мкг белка, проводили в 10%-ном SDS-полиакриламидном геле в течение 5 ч при 90 В в элеткрофоретической камере miniVE или SE260 (GE Healthcare, США) согласно стандартному протоколу [274]. Затем белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры Hybond (GE Healthcare, США) методом электропереноса в системе для влажного переноса ТЕ22 (GE Healthcare, США) при 150 мА в течение 12 часов.
Для иммуноблоттинга использовали антитела к РАК1, ERa (Cell Signaling Technology, США), HIF-1 (Santa Cruz, США). Для оценки эффективности нанесения экстрактов производили иммуноблоттинг с антителами к Р-актину и а-тубулину (Cell Signaling Technology, США). Для предотвращения неспецифической сорбции нитроцеллюлозную мембрану обрабатывали 5% раствором обезжиренного молока («Applichem», Германия) в TBST (25мМ Трис-НС1 рН7.4, 150мМ NaCl, 0.1% твин-20), затем инкубировали с первичными антителами в течение ночи при температуре +4С, отмывали 4 раза по 10 мин раствором TBST при комнатной температуре, инкубировали в течение 1 часа с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (GE Healthcare, США), в 5% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в TBST, отмывали аналогичным образом, затем наносили ECL-субстрат, содержащий перекись и люминол. Хемилюминесцентную реакцию регистрировали на ImageQuant Las 4000 (GE Healthcare, США). Полученные изображения обрабатывали с помощью компьютерной программы ImageQuant TL (GE Healthcare, США). Денситометрический анализ проводился с помощью программы Image J (NIH). 2.6. Определение скорости роста клеток МТТ-тестом
Для определения скорости роста клеток был использован МТТ-тест, основанный на утилизации живыми клетками МТТ-реагента (3-[4,5 диметилтиазол-2]-2,5-дифенилтетразол бромида) [275] с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого определяется спектрофотометрически при длине волны 570 нм. Вкратце, клетки отмывали PBS, в каждую лунку добавляли МТТ-реагент («Sigma-Aldrich», США), предварительно разведенный средой DMEM до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали в течение 40 мин при 37С, затем отбрасывали среду и клетки экстрагировали раствором диметилсульфоксида (ДМСО), оптическое поглощение образцов измеряли при 570 нм на спектрофотометре Multiscan FC (ThermoScientific, США) в 96-луночный планшетах. На основании полученных данных строили график зависимости оптической плотности экстракта от количества жизнеспособных клеток.
Клетки отмывали PBS, затем добавлялся 1 мл тризола, в котором клетки гомогенизировались путем многократного пипетирования, полученные гомогенизаты центрифугировались в течение 4 минут при 12000g и 4С, супернатант инкубировали 5 минут при комнатной температуре для полной диссоциации нуклеопротеинового комплекса. Затем к каждой пробирке добавлялось по 0,2 мл хлороформа, полученная смесь перемешивалась интенсивным встряхиванием в течение 15-20 секунд на вортексе, инкубировалась 3 минуты при комнатной температуре, затем центрифугировалась при 12000g и 4С в течение 15 минут до образования 3-х фаз: нижняя органическая фаза (содержащая белок), интерфаза (содержащая ДНК) и верхняя бесцветная фаза (содержащая РНК). Верхнюю бесцветную фазу убирали, а к оставшимся интерфазе и органической фазе добавляли 0,3 мл этанола или изоропилового спирта, перемешивали и инкубировали 3 минуты при комнатной температуре, затем снова центрифугировали на 2000g на +4С в течение 5 минут для осаждения ДНК. Органическую фазу убирали, а полученный осадок, содержащий ДНК, отмывали дважды раствором 0,1 М цитрата натрия в 10% этаноле (к каждому образцу добавлялся 1 мл раствора с последующими 30-минутной инкубацией, аккуратным перемешиванием и центрифугированием на 2000g на +4С в течение 5 минут), затем 75% этанолом (по 1,5 мл 75% этанола на образец, инкубация 15 минут при комнатной температуре, перемешивание и центрифугирование на 2000g на +4С, 5 минут). Полученный осадок ДНК высушивали в течение 3-5 минут на воздухе при комнатной температуре, затем ресуспендировали в 8 мМ NaOH до полного растворения и определяли концентрацию на бескюветном спектрофотометре NanoVue (GE Healthcare, США) на длине волны 280 нм.
Определение метилирования проводилось методом бисульфитного секвенирования, полученные данные подтверждались метилчувствительной ПНР [276, 277].
Бисульфитное секвенирование. Дизайн праймеров для исследования метилирования промоторной области гена PAKI был выполнен при помощи программы MethPrimer. В результате была подобрана следующая последовательность праймеров: прямой - gtagtttttttgttttgaggggag и обратный -ataaataaacccaaaccccca. Для проведения бисульфитной конверсии геномную ДНК денатурировали в присутствии NaOH (конечная концентрация 0,3 М) при температуре 65С в течение 15 мин. Модификацию ДНК осуществляли при помощи бисульфита натрия и гидрохинона в конечных концентрациях соответственно 2М и 0,5 М в течение 15 ч при температуре 55С. Модифицированную ДНК очищали на колонках Wizard DNA Clean-up system (Promega, США), по протоколу производителя. Реакционная смесь для ПЦР бисульфит-конвертированной матрицы, объемом 25 мкл, включала 2,5 мкл десятикратного буфера для ПЦР (50 мМ КС1, 10 мМ трис-HCl рН8,4), 4мМ MgCl2, по 200 мкМ dNTP, 10% ДМСО, 5% глицерина, 2% деионизованного формамида, 50 - 100 нг ДНК и 1 ед. термофильной ДНК-полимеразы. Смесь прогревали при температуре 95 С в течение 6 мин и проводили 33 цикла с параметрами: 94 С - 40 с, 59 С - 30 с, 72 С - 40 с. Финальную элонгацию проводили при температуре 72 С в течение 7 мин.
Определение содержания РАК1 методом иммуноблотинга
В какой мере РАК1 участвует в поддержании роста клеток при гипоксии -для ответа на этот вопрос следующая серия экспериментов была проведена на клетках MCF-7, культивированных в условиях хронической гипоксии. Для моделирования условий хронической гипоксии клетки эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 культивировали в атмосфере с пониженным (до 1%) содержанием кислорода в течение 30 сут. Ранее мы продемонстрировали, что если острая, в течение 3 сут, гипоксия вызывает значительное торможение клеточной пролиферации, то на фоне хронической гипоксии торможение роста оказывается существенно меньшим. Полученная в условиях хронической гипоксии сублиния клеток получила название MCF-7/H; в предыдущих работах мы показали, что подобная толерантность к гипоксии может сохраняться в течение не менее 60 суток после возвращения клеток в среду с нормальным содержанием кислорода [281]. Все последующие эксперименты проводились на сублинии MCF-7/H, поддерживаемой после перевода в среду с нормальным содержанием кислорода не более 60 сут.
Анализ содержания РАК1 в клетках MCF-7 и MCF-7/H в условиях нормоксии выявил существенное повышение базального уровня РАК1 в клетках MCF-7/H (рис.28). Pakl
Сравнительный анализ содержания РАК1 в клетках MCF-7 и MCF-7/H. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в в линии MCF-7.
Мы показали, что трансфекция дикого варианта гена РАК1 в клетки MCF-7 сопровождалась развитием частичной толерантности к гипоксии, что подтверждало протективную роль РАК1 при гипоксии (рис.29).
Влияние трансфекции wPAKl на чувствительность к гипоксии клеток MCF-7. Результаты МТТ теста, проведенного через 3 суток роста в гипоксии с уровнем 02 не более 1%.
Для дальнейшего изучения механизма действия РАК1 при гипоксии исследовалось влияние РАК1 на активность HIF-1, одного из ключевых факторов, определяющих реакцию клеток на гипоксию. Было обнаружено, что трансфекция в клетки дикого варианта гена РАК1 приводит к увеличению транскрипционной активности HIF-1 на фоне острой гипоксии, демонстрируя участие РАК1 в активации HIF-1 -сигнальных путей (рис. 30).
Механизм активации РАК1 в клетках MCF-/H. Анализ скорости роста клеток в присутствии IPA-3, специфического ингибитора РАК1, показал, что его добавление приводит к выраженному снижению скорости роста клеток MCF-7/H, отличающихся повышенным базальным уровнем РАК1 (рис.31).
Рост клеток MCF-7/H в присутствии ІРА-3. Результаты МТТ теста. Анализ скорости роста клеток MCF-7/H в присутствии IPA-3 в условиях гипоксии выявил, что подавление РАК1 с помощью IPA-3 приводит к увеличению чувствительности клеток к гипоксии (рис. 32).
Следует отметить, что подобный протективный эффект РАК1 характерен и для клеток ER-негативного рака молочной железы. Так, ранее мы показали, что, как минимум, некоторые ER-негативные опухоли молочной железы отличаются повышенной конститутивной экспрессией РАК1 и высокочувствительны к антипролиферативному действию IPA-3 (см. рис. 10 и 13).
Таким образом, гиперэкспрессия РАК1, как приобретенная (в случае клеток MCF-7/H), так и конститутивная (в случаях ER-негативных опухолей) может выступать в роли одного из факторов, поддерживающих автономный рост и выживаемость клеток.
Метилирование РЛК1 и его роль в регуляции дифференциальной экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы
В качестве одного из вероятных путей регуляции РАК1 в клетках опухолей молочной железы мы исследовали возможность метилирования/деметилирования CpG-островка, расположенного в 5 -регуляторном регионе и определяющего эффективность экспрессии PAKl. Был проведен сравнительный анализ метилирования гена РАК1 в клетках MCF-7 и HBL-100 методом бисульфитного секвенирования ДНК, в основе которого лежит бисульфитная конверсия неметилированного цитозина в тимин, при этом метилированный цитозин конверсии не подвергается. Результаты показали высокий уровень метилирования PAKl в клетках MCF-7 и полное отсутствие метилирования в ER-негативных клетках HBL-100.
Параллельно был проведен анализ метилирования РАК1 методом метичувствительной ПНР. Метод метилчувствительной ПНР основан на использовании метилчувствительных рестрикционных нуклеаз, расщепляющих ДНК при отсутствии метилирования цитозинов в сайтах рестрикции. В случае метилированных цитозинов гидролиза ДНК не происходит и последующее использование гидролизованной ДНК в качестве матрицы для ПНР позволяет получать продукты только при наличии метилированных цитозинов. Вкратце, выделенные тризолом (LifeTechnologies, США) геномные ДНК из клеток MCF-7 и HBL-100 подвергали 12-часовой рестрикции метилчувствительными рестриктазами Hhal (ThermoScientific) и НраІІ (Сибэнзим) по сайтам GCGC и CCGG соответственно, содержащими неметилированный цитозин в CG-nape. После рестрикции с Hhal проводили ПЦР в присутствие пары праймеров 5 -регуляторной области гена PARI: прямой - ggcaggagggagaaagtgaag и обратный tccatgcagaaggaactgg; а после рестрикции с НраІІ в ПЦР использовали также независимую пару праймеров для внутреннего контроля ПЦР - фрагмент гена CUX1 (прямой - agggcctggacggggtcggac и обратный - agcccacacggaacaggagga). Продукты ПНР анализировали методом вертикального электрофореза в ПААГ с последующей окраской геля нитратом серебра или методом горизонтального электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием с последующей гель-документации полученных результатов на УФ-трансиллюминаторе с помомощью ImageQuant Las 4000 и анализом программой ImageQuant TL.
Подбор оптимального количества циклов. ПЦР-продукты длиной 543 п.о. промотерной части и области 1-го экзона гена РАК1 после электрофореза в агарозном геле.
В результате подбора условий ПЦР определили, что оптимальными для обеих пар являются: температура отжига - 62С (рис. 34), количество циклов ПЦР - 32 (рис. 35). В результате отработки рестрикции также выявили гиперметилирование промотерной части и области 1-го экзона гена РАК-1 в клетках MCF-7.
В соответствии с разработанными условиями проводили сравнительный анализ наличия или отсутствия продуктов ПЦР после обработки метилчувствительными рестриктазами Hhal и НраІІ, которые разрезают неметилированные последовательности GCGC и CCGG соответсвенно таким образом, что ПЦР не идет и продукт в геле не детектируется (рис. 36а,б ).
Полученные данные по 2-м независимым метил-чувстительным рестрикциям полностью подтвердили результаты бисульфитного секвенирования, продемонстрировав наличие метилированных участков промотора РАК1 в клетках MCF-7 и отсутствие их в клетках HBL-100.
РАК1 и выживаемость клеток
Выше отмечалось, что ER-негативные клетки РМЖ характеризуются высоким уровнем экспрессии РАК1 [247] и Snail 1 [260], в то время как ER-позитивные клетки, напротив, имеют низкий уровень экспресии этих белков. Вероятно, причина низкого уровня экспрессии Pakl и Snail 1 в ER-положительных клетках может быть связана с особенностями внутриклеточного сигналинга, ответственного за негативный контроль этих белков. Одним из таких механизмов негативной регуляции является способность рецептора эстрогена подавлять активность Snail 1 через ER-зависимую активацию специфического белка-супрессора Snail 1 -МТАЗ [282, 283].
В наших исследованиях мы продемонстрировали активацию рецептора эстрогенов под действием РАК1, что можно рассматривать в качестве одного из факторов, ограничивающих уровень Snail 1 в ER-позитивных клетках РМЖ.
Участие РАК1 в поддержании роста клеток MCF-7 было продемонстрировано в экспериментах с IPA-3, специфическим ингибитором РАК1: оказалось, что добавление IPA-3 существенно снижает скорость роста клеток MCF-7. Для дальнейшего изучения протективной роли РАК1 и путей его физиологической регуляции в клетках РМЖ мы исследовали активность РАК1 в клетках MCF-7 в условиях гипоксии.
В какой мере РАК1 участвует в поддержании роста клеток при гипоксии -для ответа на этот вопрос следующая серия экспериментов была проведена на клетках MCF-7, культивированных в условиях хронической гипоксии. Для моделирования хронической гипоксии клетки MCF-7 культивировали в атмосфере с пониженным (до 1%) содержанием кислорода в течение 30 сут. Ранее было установлено, что если острая, в течение 3 сут, гипоксия вызывает значительное торможение клеточной пролиферации, то на фоне хронической гипоксии происходит частичное восстановление роста клеток. Полученная в условиях хронической гипоксии сублиния клеток получила название MCF-7/H; было показано, что подобная толерантность к гипоксии может сохраняться в течение не менее 60 суток после возвращения клеток в среду с нормальным содержанием кислорода [281]. Все последующие эксперименты проводились на сублинии MCF-7/H, поддерживаемой после перевода в среду с нормальным содержанием кислорода не более 60 сут.
Анализ содержания РАК1 в клетках MCF-7 и MCF-7/H в условиях нормоксии выявил существенное повышение базального уровня РАК1 в клетках MCF-7/H. Для дальнейшего изучения механизма действия РАК1 при гипоксии исследовалось влияние РАК1 на активность HIF-1, одного из ключевых факторов, определяющих реакцию клеток на гипоксию. Было обнаружено, что трансфекция в клетки дикого варианта гена РАК 1 приводит к увеличению транскрипционной активности HIF-1 на фоне острой гипоксии, демонстрируя участие РАК1 в активации HIF-1 -сигнальных путей.
Анализ скорости роста клеток в присутствии ІРА-3, специфического ингибитора РАК1, показал, что его добавление приводит к выраженному снижению скорости роста и увеличению чувствительности клеток к гипоксии.
Как уже отмечалось, подобный протективный эффект РАК1 характерен и для клеток ER-негативного рака молочной железы: так, исследованные нами ER-негативные опухоли молочной железы отличались повышенной конститутивной экспрессией РАК1 и высокой чувствительностью к антипролиферативному действию ІРА-3. Таким образом, гиперэкспрессия РАК1, как приобретенная (в случае клеток MCF-7/H), так и конститутивная (в случаях ER-негативных опухолей) может выступать в роли одного из факторов, поддерживающих автономный рост и выживаемость клеток.
В качестве одного из вероятных путей регуляции РАК1 в клетках опухолей молочной железы мы исследовали возможность метилирования/деметилирования специфических цитозин-гуанин богатых участков гена, располагающихся в 5 -регуляторных регионах [284-286] и определяющих эффективность экспрессии РАЮ.
Действительно, проведенный сравнительный анализ метилирования промотора гена РАК1 методом бисульфитного секвенирования ДНК показал высокий уровень метилирования в клетках MCF-7 и практически полное отсутствие метилирования промотора в ER-негативных клетках.
Параллельно был проведен анализ метилирования РАК1 методом метичувствительной ПНР. Полученные данные полностью подтвердили результаты бисульфитного секвенирования, продемонстрировав наличие метилированных участков промотора РАК1 в клетках MCF-7 и отсутствие их в клетках HBL-100.
Исследование метилирования РАК1 в клетках MCF-7/H не выявило существенных изменений в уровне метилирования РАК1 - несмотря на значительное увеличение содержания РАК1 в клетках MCF-7/H по сравнению с клетками MCF-7. Каков механизм активации РАК1 в случае клеток MCF-7/H -остается до конца непонятным, скорее всего подобная активация РАК1 может быть результатом действия определенных сигнальных белков - позитивных регуляторов РАК1. Мы предполагаем, что в качестве таких регуляторов могут выступать белки, ассоциированные с гипоксией, в том числе - HIF-1. Учитывая описанную выше активацию РАК1 в условиях гипоксии и, вместе с тем, способность РАК1 стимулировать активность HIF-1, можно предположить, что эти белки связаны положительными регуляторными связями, которые и обеспечивают конститутивное повышение их уровня при хронической гипоксии.