Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Стероидные гормоны и их физиологическая роль в развитии молочной железы 14
1.1.1. Роль эстрогенов в развитии молочной железы 14
1.1.2. Структура рецепторов эстрогенов 14
1.1.3. Механизмы действия стероидных гормонов 16
1.2. Развитие злокачественных опухолей РМЖ 18
1.2.1. Гормональная резистентность 19
1.2.2. Механизмы гормональной резистентности РМЖ 20
1.3. Виды межклеточных взаимодействий и развитие молочной железы 24
1.3.1. Паракринная регуляция 25
1.3.2. Паракринная регуляция и развитие РМЖ 25
1.3.3. Щелевые контакты 27
1.3.4. Роль щелевых контактов в развитии РМЖ 29
1.3.5. Экзосомы как тип межклеточных взаимодействий 30
1.3.6. Участие экзосом в развитии РМЖ 32
1.4. Межклеточные взаимодействия и развитие гормональной резистентности 34
1.4.1. Паракринная коммуникация, как элемент в процессе развития гормональной резистентности 34
1.4.2. Гормональная резистентность и щелевые контакты 35
1.4.3. Экзосомы и их роль в ответе на антиэстрогены 36
1.5. Межклеточные взаимодействия и эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) 37
1.5.1. ЭМП и опухолевый рост 37
1.5.2. Межклеточные сообщения, ЭМП и гормональная резистентность 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Клеточные культуры 40
2.2. Получение GFP-позитивных сублиний 40
2.3. Клонирование и выведение MCF-7/clone R субпопуляции 41
2.4. Культивирование клеток на культуральных вставках 41
2.5. Определение количества клеток с помощью камеры Горяева 42
2.6. MTT-тест 42
2.7. Выделение экзосом из культуральной среды 42
2.8. Верификация экзосом методом ПЭМ 43
2.9. Получение экстрактов экзосом/клеток и SDS-электрофорез в ПААГ 43
2.10. Иммуноблоттинг 44
2.11. Транзиторная трансфекция 44
2.12. Репортерный анализ 45
2.13. Детекция физиологической активности экзосом 46
2.14. Анализ микроРНК в препаратах экзосом 47
2.15. Статистическая обработка результатов 47
2.16. Список использованных реактивов 47
2.17. Список оборудования 49
ГЛАВА 3. Результаты 50
3.1. Межклеточные взаимодействия и развитие гормональной резистентности рака молочной железы 50
3.1.1. Разработка экспериментальной модели приобретенной гормональной резистентности клеток РМЖ 50
3.1.2. Получение стабильного GFP-позитивного клона гормоннезависимой сублинии MCF-7/T и гормончувствительной MCF-7 52
3.1.3. Влияние совместного культивирования гормончувствительных и резистентных клеток на уровень гормонального ответа. 54
3.1.4. Кондиционированная среда и эффект приобретенной резистентности
3.2. Сравнительный анализ действия ингибиторов сигнальных путей на горизонтальный путь передачи гормональной резистентности 58
3.3. Роль экзосом в развитии приобретенной гормональной резистентности рака молочной железы
3.3.1. Получение и верификация препаратов экзосом 60
3.3.2. Экзосомы и развитие приобретенной гормональной резистентности 62
3.3.3. Сравнительный анализ экзосом родительских и гормонрезистентных клеток 64
3.4. Исследование общих характеристик белкового спектра в резистентных клонах клеток 66
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 69
4.1. Межклеточные взаимодействия и развитие гормональной резистентности рака молочной железы 69
4.2. Роль экзосом в развитии приобретенной гормональной резистентности рака молочной железы 71
4.3. Характеристики белкового спектра в резистентных клонах клеток 72
Заключение 74
Выводы 76
Список литературы 77
- Роль эстрогенов в развитии молочной железы
- Клонирование и выведение MCF-7/clone R субпопуляции
- Сравнительный анализ действия ингибиторов сигнальных путей на горизонтальный путь передачи гормональной резистентности
- Роль экзосом в развитии приобретенной гормональной резистентности рака молочной железы
Роль эстрогенов в развитии молочной железы
Все члены подсемейства NR3 сходны по своей структуре и состоят из 5 доменов (Рис.1): 1. Аминоконцевой домен А/B может функционировать в качестве гормон-независимого активатора транскрипции и содержит сигнал ядерной локализации (NLS). Его структура зависит от типа рецептора. 2. Высоко консервативный С домен, содержащий ДНК-связывающий домен (DBD), также отвечающий за ядерную локализацию. 3. Шарнирная область, D домен, соединяет С домен с карбоксильной концевой группой E/F домена. 4. E домен, включающий домен связывания рецептор-специфического лиганда (LBD) и домен димерзации (DD). Связывание домена с гормоном приводит к конформационным изменениям, запускающие механизмы транскрипции. 5. F домен является вариабельной частью рецептора и возможно, определяет различие в ответах рецепторов эстрогенов на эстрадиол и другие специфические модуляторы.
Наиболее мощным эндогенным активатором ER, вырабатываемым в организме женщины, является 17-эстрадиол (Е2). В отношении ERR лиганды не обнаружены и их относят к орфанным рецепторам, тем не менее функционирующим как транскрипционные факторы [174]. Эффект эстрогенов зависит от соотношения между ER и ER, обладающих во многом противоположной активностью [45]. Известно, что ER и ER кодируются отдельными генами (Esr1 и Esr2 соответственно), расположенными на разных хромосомах [77]. В нормальных тканях молочной железы экспрессируются оба рецептора, но конкретная их локализация изучена недостаточно. Есть данные, что ER локализованы преимущественно во внутреннем слое эпителиальных клеток, выстилающих ацинусы и дольковые протоки, а также в миоэпителиальных клетках внешнего слоя дольковых протоков. ER же были обнаружены в стромальных, эпителиальных клетках в ацинусах и протоках [107]. Несмотря на то, что ER присутствует не во всех тканях молочной железы, он вносит более значительный вклад в развитие молочных желез млекопитающих, чем ER, эти данные были получены из экспериментов на мышах. У мышей с нокаутом гена ER было отмечено только рудиментарные молочные железы, не способные к лактации. У мышей с нокаутом гена ER молочные железы развивались нормально [186]. Функциональные особенности ER в настоящее время исследованы недостаточно и являются предметом дискуссий [21, 100] .
Большой прорыв в области изучения механизмов гормонального ответа был сделан в конце 1950-х годов, когда Е. Jensen с соавт. предложил двухступенчатую модель взаимодействия гормона с клеткой-мишенью [133]. Согласно этой модели, эстрадиол проникает в клетку и связывается со специфичным рецептором, находящимся в цитозоле клетки [73]. Данный рецептор впоследствии был назван рецептором эстрогена (ER). Однако, в 1993 году, почти три десятилетия спустя, в лаборатории D. Lubahn были созданы мыши с нокаутом гена ER. Такие особи отвечали на эстрадиол, так же как контрольные, что служило доказательством существования обходных путей реализации гормонального ответа без участия ER - что и было подтверждено позднее открытием ER [114].
На сегодняшний день существует общепринятая схема механизма действия стероидных гормонов, и в частности эстрогенов [76]. Действие эстрогенов может осуществляться несколькими путями (Рис.2) Первый путь - классический геномный, заключается в прямом связывании лиганда с рецептором, транслокацией рецептора в ядро и взаимодействии этого комплекса с эстроген-чувствительным элементом в промоторе определенного гена [82]. Второй путь -неклассический, подразумевает взаимодействие комплекса лиганд-рецептор с другими транскрипционными факторами (такими как белки семейств Ap-1 и Sp1, NFkB [117]. Третий путь - негеномный - реализуется через активацию лигандом трансмембранного белка GPR30, который запускает сигнальные каскады с помощью вторичных мессенджеров. Это приводит к быстрой физиологической реакции без привлечения генной регуляции [33, 153]. Четвертый путь — лиганд-независимый - может запускаться в случае, когда ER является элементом других сигнальных путей, например, тирозинкиназных рецепторов, таких как EGFR ( Epidermal Growth Factor Receptor), VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor), IGFR ( Insulin-like Growth Factor 1 Receptor) [3, 96, 101]. Активированные киназы фосфорилируют рецептор эстрогена, инициируют его димеризацию, что приводит к регулированию транскрипции генов и активизации вторичных мессенджеров [22, 95] Рисунок 2 — Сигнальные пути рецепторов эстрогенов [122].
Несмотря на большой прогресс современной медицины, появление высокотехнологичных диагностических и лечебных методик, распространенность онкологических заболеваний во всем мире остается достаточно высокой. Эксперты ВОЗ отмечают высокие показатели заболеваемости и смертности населения от рака в слаборазвитых странах и некоторую тенденцию к снижению данных показателей в странах с высоким уровнем развития экономики и социальной структуры[5]. Снижение смертности от онкологических заболеваний, в частности РМЖ, в развитых странах обусловлено активным внедрением мер профилактики и ранней диагностики [59]. Однако, несмотря на значительный прогресс в лечение и диагностике, рак молочной железы остается самым распространенным заболеванием среди женщин и занимает второе место по смертности среди онкологических больных [165, 180].
На данный момент существует несколько методов терапии РМЖ: хирургическое лечение, химио-, радио- и/или гормональная терапия. Часто для лечения опухолей, содержащих рецепторы эстрогенов и прогестеронов, применяют гормональную терапию. Однако, в опухолевых клетках возможен запуск сигнальных путей, способных повышать их сопротивляемость цитостатическому действию препаратов, что снижает эффективность терапии[67, 162].
Клонирование и выведение MCF-7/clone R субпопуляции
В экспериментах использовали следующие плазмиды: плазмида ERE/Luc, содержавшая ген-репортер люциферазы под контролем эстроген-респонсивного элемента (ERE) (предоставлена Dr. G. Reid, European Molecular Biology Laboratory, Germany) [57]; плазмида E-cad/Luc, содержавшая ген-репортер люциферазы под контролем Snaill-чувствительного промотора (предоставлена Dr. Antonio Garca de Herreros, Department of Experimental Sciences, Universitat Pompeu Fabra; Spain) [184]; данная конструкция использовалась для определения трансрепрессорной активности Snail 1 [23]; репортерная конструкция, содержавшая ген люциферазы под контролем бета-катенин-чувствительного промотора (предоставлена В.Татарским, Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН, Россия).
Для контроля эффективности трансфекции в клетки вместе с репортерными плазмидами трансфецировали вектор для экспрессии -галактозидазы с последующим определением активности люциферазы и галактозидазы в каждом образце.
Для выделения плазмид использовали стандартный протокол трансформации в компетентные клетки E.Coli с селекцией по устойчивости к ампициллину с последующим выделением плазмидной ДНК с помощью готового набора («Promega», США) в соответствие с рекомендациями фирмы-производителя. Концентрация полученной ДНК измеряли на бескюветном спектрофотометре NanoVue (GE Healthcare, США).
Трансфецированные клетки отмывали физиологическом раствором (0,14 М NaCl; 10 мМ Tris-HCl рН7,5) и далее их лизировали на лунках буффером (50 мМ Tris-HCl (рН=7,5), 1 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1 мМ DTT, 1мМ PMSF, 0,1 мM Na-ортованадат и 1%-ный апротинин), инкубировали (30 минут, +4С). В полученных образцах определяли активность -галактозидазы и люциферазы.
Активность люциферазы измеряли на люминометре Infinite 200 PRO (Tecan, Швейцария) с помощью набора Luciferase Assay System (Promega, США) в соответствие с рекомендациями производителя. Активность -галактозидазы измеряли по стандартной методике, основанной на использовании субстрата - O-нитрофенил-b-D-галактопиранозидазы (ONPG), который под действием -галактозидазы распадается на галактозу и О-нитрофенол, окрашивающий раствор в желтый цвет; интенсивность окраски определяли спектрофотометрически при длине волны 420 нм. Все образцы наносили на 96-луночный планшет и инкубировали с раствором (ONPG, 0,1 М Na2HPO4, (pH=7,5), 1 М MgCl2, -меркаптоэтанол) в течение 40 минут при температуре 37С. Окраску проб измеряли на плашетном спектрофотометре Multiscan FC (ThermoScientific, США). Расчет активности люциферазы проводили в условных (относительных) единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактозидазы).
Для детекции физиологической активности экзосом использовался прижизненный краситель CellTracker Red CMTPX (ThermoScientific, США). Препараты экзосом, полученные путем ультрацентрифугирования, инкубировали в бессывороточной среде DMEM 30 минут с конечной концентрацией красителя 20М. Далее экзосомы дважды отмывались в PBS 70 минут при 100000g на ультрацентрифуге. После чего суспендировались c клетками в питательной среде DMEM, содержавшей 5% сыворотки и инкубировались в стандартных условиях 6 часов. Физиологическая активность экзосом определялась по интенсивности флуоресценции клеток на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 ZEISS (Carl Zeiss, Германия). 2.14. Анализ микроРНК в препаратах экзосом
Эксперименты проводились совместно с Р. Б. Самсоновым и А. В. Малек на базе ФГБУ «НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург.
Для анализа микроРНК использовался метод ионного полупроводникового секвенирования (Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM)) (ThermoScientific, США). МикроРНК экстрагировали из экзосом набором Exiqon miRNA (Exiqon, Дания) в соответствии с рекомендациями производителя. Очищенную микроРНК хранили при -70 C.
Из полученных образцов микроРНК методом обратный транскрипции получали кДНК и конструировали библиотеку с использованием фирменного набора реагентов Ion Total RNA-Seq Kit v2 (ThermoScientific, США). Каждый шаблон библиотеки был аплифицирован с помощью эмульсионной ПЦР на ионных шариках (Ion Sphere Particles — ISP) с использованием набора Ion One Touch с 200 шаблонами (ThermoScientific, США) в Ion One Touch 2 по протоколу изготовителя. Для обогащения шариков с ампликонами использовались шарики Dynabeads MyOne Strepavidin C1 (ThermoScientific, США). Затем ISP наносили на чип Ion 318 и секвенировали на PGM (ThermoScientific, США).
Сравнительный анализ действия ингибиторов сигнальных путей на горизонтальный путь передачи гормональной резистентности
В какой мере экзосомы могут стимулировать развитие гормональной резистентности - для ответа на этот вопрос мы исследовали влияние препаратов экзосом, выделенных из резистентных клеток MCF-7/Т, на чувствительность к тамоксифену родительских клеток MCF-7. В качестве контроля использовали экзосомы, выделенные из клеток MCF-7. При регулярном добавлении (в течение 10 сут) к клеткам MCF-7 экзосом, полученных от резистентных клеток MCF-7/Т, наблюдается тенденция к снижению чувствительности клеток MCF-7 к тамоксифену (сублиния MCF-7/ R-exo). В то же время экзосомы, полученные от родительских клеток MCF-7, не обладают такой активностью, и их добавление не приводит к изменению гормональной чувствительности клеток (сублиния MCF-7/
Более того, при переводе в бесстероидную среду клетки MCF-7/R-exo демонстрировали относительно более высокую скорость роста по сравнению с клетками MCF-7/С-exo, свидетельствующую о приобретении клетками MCF-7/R-exo способности к эстрогеннезависимому росту (Рис. 18).
В целом, полученные результаты свидетельствуют, что экзосомы могут рассматриваться в качестве факторов, участвующих в «горизонтальном» пути передачи гормональной резистентности от резистентных к родительским клеткам РМЖ.
Как известно, одними из ключевых молекул, входящих в состав экзосом и участвующих в передаче генетической информации к клеткам-реципиентам, являются микроРНК. В наших экспериментах был проведен сравнительный анализ содержания некоторых микроРНК, участвующих в регуляции роста и выживаемости опухолевых клеток, в экзосомах клеток MCF-7 и MCF-7/Т. В результате проведенного секвенирования экзосомальной РНК было идентифицировано 30 микроРНК, содержание которых изменялось в экзосомах резистентных клеток, из них содержание 26 микроРНК увеличивалось и 4-х микроРНК - снижалось (табл.1). Среди идентифицированных микроРНК девять оказались ассоциированы (по литературным данным) с развитием гормональной резистентности (табл.1) [44, 47, 74, 129, 139, 143, 187]. Таблица 1 — МикроРНК, детектированные в экзосомах клеточных линий MCF-7 и MCF-7/T. Серым цветом помечены микроРНК, которые по литературным данным участвуют в реализации гормонального ответа. Жирным шрифтом выделены микроРНК, содержание которых снижалось в резистентных клетках. Ионное полупроводниковое секвенирование.
Мы рассчитываем, что продолжение этих исследований позволит более точно установить значение идентифицированных микроРНК в опосредованном экзосомами развитии гормональной резистентности.
Целью заключительного этапа работы явился сравнительный анализ некоторых из ключевых белков, участвующих в развитии гормональной резистентности, в исходной резистентной линии MCF-7/Т и резистентных клонах, полученных в результате ко-культивирования клеток с MCF-7/Т или с экзосомами MCF-7/Т. Ранее мы показали, что развитие гормональной резистентности клеток РМЖ ассоциировано с активацией белков эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), и продемонстрировали их непосредственное участие в поддержании эстроген-независимого роста клеток [18, 162]. В настоящих экспериментах мы проанализировали содержание и транскрипционную активность Snail1, одного из ключевых белков ЭМП, в резистентных линиях клеток, полученных из MCF-7. Эксперименты проводились на 4-х линиях клеток: эстрогензависимой MCF-7, эстрогеннезависимой MCF-7/Т и двух сублиниях, полученных после культивирования клеток MCF-7 с экзосомами - MCF-7/ С-exo (контрольные экзосомы) и MCF-7/ R-exo (резистентные экзосомы).
Как известно, под негативным контролем Snail1 находится Е-кадхерин, участвующий в организации межклеточных контактов, и снижение уровня Е-кадхерина провоцирует рост и метастазирование опухолей. В наших экспериментах для изучения сигнального пути Snail1/Е-кадхерин использовались: определение содержания этих белков методом иммуноблотинга; определение трансрепрессорной активности Snail1 методом репортерного анализа. Было обнаружено, что в резистентных сублиниях MCF-7/Т и MCF-7/ R-exo наблюдаются общие изменения Snail1-Е-кадхерин сигналинга: повышение содержания и трансрепрессорной активности Snail1 и параллельное снижение содержания Е-кадхерина (Рис.19).
Одновременно в исследованных линиях клеток проводилось определение содержания и транскрипционной активности рецептора эстрогенов. Результаты показали существенное снижение активности ERalpha в резистентных сублиниях клеток, свидетельствующее о сходном подавлении рецепторного аппарата в обоих типах клеток (Рис.20).
В целом, результаты представленных экспериментов позволяют заключить, что при горизонтальном распространении гормональной резистентности клетки с генерированной de novo резистентностью во многом приобретают особенности сигналинга клеток - доноров. В нашем случае это - подавление активности аппарата рецептора эстрогенов и активация Snail 1 сигналинга.
Роль экзосом в развитии приобретенной гормональной резистентности рака молочной железы
Клетки гормонрезистентной сублинии MCF-7/T были получены из клеток эстрогензависимой аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 в результате длительного культивирования (60 суток) в присутствии антиэстрогена тамоксифена. Было показано, что клетки линии MCF-7/T характеризуется сниженной чувствительностью к антиэстрогену тамоксифену. Результаты иммуноблоттинга и репортерного анализа показали, что активность ER и его содержание в клетках MCF-7/T снижены по сравнению с клетками MCF-7. Полученные данные согласуются с данными других исследователей, демонстрировавших снижение уровня ERalpha в клетках, устойчивых к тамоксифену [25, 87, 101].
Следующий этап исследования заключался в изучении роли межклеточных взаимодействий в развитии гормональной резистентности РМЖ. Для решения этой задачи была получена GFP-позитивная клеточная линия MCF-7/T/GFP/, в которой присутствие гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) позволяло отличить клетки гормонрезистентной линии от чувствительной MCF-7 при их совместном культивировании. По полученным данным, ко-культивирование двух клеточных линий, MCF-7 и MCF-7/T/GFP, в течение 10 суток приводило к снижению гормональной чувствительности у родительских клеток MCF-7, при этом уровень резистентности клеток MCF-7/T/GFP/ оставался неизменным. Полученные результаты были подтверждены в серии перекрестных экспериментов, где уже эстроген-зависимые клетки MCF-7, трансфецированные GFP, культивировали с MCF-7/T клетками - эксперименты выявили аналогичную тенденцию: развитие в результате ко-культивирования частичной резистентности к тамоксифену в родительских клетках MCF-7. Было установлено, что развившаяся в ходе совместного культивирования гормональная резистентность клеток MCF-7 сохраняется в течение длительного времени, не менее 80 суток после разделения клеточных культур и последующего культивирования клеток в стандартной среде.
Мы показали, что ингибитор PI3K вортманнин полностью блокирует распространение гормональной резистентности на родительские клетки MCF-7, что, безусловно, доказывает важность этого сигнального пути для развития гормональной резистентности. Следует отметить, что важная роль активации PI3K сигналинга в развитии гормональной резистентности опухолей неоднократно отмечалась в работах многих исследователей [68, 89].
Для изучения влияния разобщения клеточных культур на уровень гормональной зависимости были использованы специальные культуральные вставки с размером пор 0,22 микрона (Nunc Cell Culture Inserts), позволяющие раздельно культивировать две клеточные линии при сохранении общей среды. Было обнаружено, что при раздельном ко-культивировании родительских клеток MCF-7 и резистентной сублинии в течение 3, 7 и 14 суток чувствительность к тамоксифену родительских клеток MCF-7 практически не меняется.
Таким образом, взятые вместе, полученные результаты демонстрируют, что ко-культивирование гормоночувствительных и резистентных клеток рака молочной железы приводит к снижению гормональной зависимости чувствительных клеток. Решающим фактором в подобном «горизонтальном» пути передачи гормональной резистентности являются межклеточные взаимодействия, тогда как наличия общей культуральной среды оказывается явно недостаточно.
Задачей этого этапа исследования явилось изучение роли экзосом - везикул, секретируемых клетками в окружающую среду - в межклеточной коммуникации и распространении гормональной резистентности горизонтальным путем, от клетки к клетке. Препараты экзосом получали из гормоночувствительных клеток MCF-7 и резистентных клеток MCF-7/Т методом высокоскоростного центрифугирования и верифицировали с помощью иммуноблоттинга с антителами к специфическому маркеру экзосом – CD81 и методом просвечивающей электронной микроскопии.
Мы показали, что регулярное добавление (в течение 10 сут) к клеткам MCF 7 экзосом, полученных от резистентных клеток MCF-7/Т, приводит к развитию частичной резистентности клеток MCF-7 к тамоксифену (сублиния MCF-7/ R exo). В то же время экзосомы, полученные от родительских клеток MCF-7, не обладают такой активностью, и их добавление не приводит к изменению гормональной чувствительности клеток (сублиния MCF-7/ С-exo). В целом, представленные результаты свидетельствуют, что экзосомы могут рассматриваться в качестве факторов, участвующих в «горизонтальном» пути передачи гормональной резистентности от резистентных к родительским клеткам РМЖ. Следует подчеркнуть, что в научной печати имеются лишь единичные публикации, демонстрирующие возможность горизонтального распространения резистентности между опухолевыми клетками, причем преимущественно лекарственной, но не гормональной резистентности [20, 152, 156], и полученные нами данные позволяют существенно расширить представления о механизме развития гормональной резистентности.