Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Молекулярные маркеры онкогематологических заболеваний 14
1.1. Методы молекулярной диагностики онкогематологических заболеваний 14
1.2. Общие принципы молекулярной диагностики онкогематологических заболеваний 15
1.3. Аномалии хромосом при онкогематологических заболеваниях 22
1.3.1 Активация онкогенов в результате сближения с последовательностями других генов 24
1.3.2 Малигнизация при участии химерных генов 28
1.4. Прогностическое значение генетических дефектов при онкогематологических заболеваниях 35
1.4.1. Цитогенетические и молекулярно-генетические факторы прогноза острых миелобластных лейкозов 36
1.4.1.1 Цитогенетические факторы прогноза ОМЛ 39
1.4.1.2 Молекулярно-генетические факторы прогноза ОМЛ 41
1.4.2 Цитогенетические и молекулярно-генетические факторы прогноза острых лимфобластных лейкозов 47
1.5. Молекулярный патогенез и диагностика хронических миелопролиферативных заболеваний 58
1.5.1. Классические хронические миелопролиферативные заболевания 58
1.5.2. Молекулярный механизм эритропоэза 60
1.5.3 Молекулярный патогенез наследственных хМПЗ 64
1.5.4 Молекулярный патогенез классических Ph-негативных хМПЗ 65
1.5.5 Редкие варианты МПЗ 71
1.5.6. Химерные онкогены, образованные из генов, кодирующих тирозинкиназы 73
1.5.7. Молекулярная диагностика МПЗ 74
1.6. Молекулярный патогенез и диагностика хронического миелолейкоза .75
1.6.1 Ген BCR-ABL1 при хроническом миелолейкозе 75
1.6.2 Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза 77
1.7. Генетические аномалии при множественной миеломе 82
1.8. Молекулярные особенности медиастинальной лимфомы 85
1.9. Экспрессия гена WT1 при гемобластозах 88
1.10. Экспрессия раково-тестикулярных генов при гемобластозах 90
1.11. Стандартизация молекулярной диагностики онкогематологических заболеваний 98
Глава 2. Материалы и методы исследования 101
2.1 Характеристика больных 101
2.2 Методы исследования 105
2.2.1 Состав буферных растворов 105
2.2.2 Выделение ядерных клеток крови и костного мозга 106
2.2.3 Выделение фракции чистых гранулоцитов 107
2.2.4 Выделение РНК 107
2.2.5 Выделение геномной ДНК 108
2.2.6 Синтез олигонуклеотидов 108
2.2.7 Реакция обратной транскрипции. 109
2.2.8 Полимеразная цепная реакция 109
2.2.9 Выделение ПЦР-продуктов из гелей 110
2.2.10.1 Обработка данных ПЦР в реальном времени 111
2.2.10.2 Проверка воспроизводимости результата 112
2.2.10.3 Проверка специфичности работы систем 112
2.2.11 Секвенирование ДНК 112
2.2.12 Создание контрольных плазмид для ПЦР в реальном времени 113
2.2.13 Определение мутаций в гене BCR-ABL1 113
Глава 3. Результаты и обсуждение 116
3.1.1 Разработка тест-систем для анализа экспрессии химерных онкогенов – маркеров гемобластозов на основе ПЦР 116
3.1.2 Разработка тест-систем на основе ПЦР для определения мутаций, характерных для онкогематологических заболеваний 121
3.1.3 Разработка тест-систем для количественного анализа экспрессии химерных онкогенов – маркеров гемобластозов на основе ПЦР в реальном времени 123
3.1.4 Разработка тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения мутаций, в том числе для количественного расчета аллельной нагрузки мутантных генов 125
3.2.1 Стабильность положительных контролей (стандартов) 126
3.2.2 Воспроизводимая чувствительность тест-системы по контрольным плазмидам 128
3.2.3 Чувствительность метода по разведениям РНК 129
3.2.4 Чувствительность и воспроизводимость метода по разведениям клеточных линий 130
3.2.5 Стандартизация метода ПЦР в реальном времени, применяемого для молекулярного мониторинга экспрессии BCR-ABL1 132
3.2.6 Сравнение значений цитогенетического и молекулярного ответа 134
Заключение 205
Выводы 211
Список литературы 213
Список сокращений 264
Приложение 1. Праймеры и зонды, разработанные и использованные в данной работе 266
Приложение 2. Иструкция по применению набора для определения экспрессии химерного онкогена BCR-ABL1 p210 методом ОТ ПЦР. 269
Приложение 3. Иструкция по применению набора для определения экспрессии химерного онкогена BCR-ABL1 p210 методом ПЦР в реальном времени 273
- Малигнизация при участии химерных генов
- Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза
- Разработка тест-систем для анализа экспрессии химерных онкогенов – маркеров гемобластозов на основе ПЦР
- Сравнение значений цитогенетического и молекулярного ответа
Малигнизация при участии химерных генов
Первый документированный пример такого рода появился после клонирования точки разрыва из Филадельфийской хромосомы [152, 393]. При этой аномалии клеточный гомолог трансформирующего гена Абельсона c-ABL1 (9q24) слит с геном BCR t(22q11), образуя химерный ген BCR-ABL1, кодирующий белок с аномальной тирозинкиназной активностью [61].
В настоящее время известно, что малигнизация при участии химерных генов происходит по крайней мере не реже, чем путем активации онкогенов в результате сближения с другими генами.
Транслокации, сопровождающиеся образованием химерных генов, часто затрагивают гены транскрипционных факторов. Например, гены таких ДНК связывающих белков, как PBX при транслокации t(1;19) у больных пре-В-ОЛЛ [190] или ETO (MTG8) при t(8;21) у больных ОМЛ [453]. Однако транскрипционные факторы - не единственные белки, которые могут принимать участие в образовании слитых химерных белков и последующем развитии злокачественной опухоли. При Т-клеточной лимфоме химерный ген, экспрессия которого лежит в основе этой болезни, образуется при слиянии части гена интерлейкина-2 (IL-2) и части гена BCM, которая соответствует трансмембранному домену белка BCM [213].
Интересны случаи слияния киназных доменов и ядерных белков. Например, при транслокации t(5;12) ген киназы рецептора PDGF-beta PDGFRb из 5 хромосомы сливается с геном транскрипционным фактора TEL из 12 хромосомы, принадлежащим ETS-семейству белков, что влечет за собой развитие хронического миеломоноцитарного лейкоза [141]. В случае транслокации t(2;5), выявляемой при анапластической Т-крупно-клеточной лимфоме (АККЛ), ген тирозинкиназы ALK (2p23) сливается с геном NPM1 ядерного белка нуклеофозмина (5q35) [272]. При АККЛ с геном ALK могут сливаться с образованием химерных онкогенов и другие гены, в том числе гены немышечного тропомиозина (TPM3, 1q25 и TPM4 19p13.1) [210], 5 -конец гена формилтрансферазы/IMP циклогидролазы (ATIC, 2q35) [259], ген TFG из локуса 3q21 в трех вариантах в зависимости от длины плеча (короткий, длинный, экстрадлинный), ген тяжелых цепей клатрина (CLTC, 17q23) [236], ген MSN (Xq11-12), ген тяжелой цепи миозина (MYH9, 22q11.2) [215] и партнерный ген олигомеризации АЛК лимфомы на 17 хромосоме (ALO17, 17q25) [81]. Химерные белки, появляющиеся в результате этих транслокаций, могут иметь нормальное соответствие среди семейства LIM-белков, например, киназа-LIM-белок (ген LIMK) [264].
Транслокация t(15;17)(q21;q11-22) при остром промиелоцитарном лейкозе приводит к появлению туморогенного химерного белка, составленного сразу из двух транскрипционных факторов. Эта транслокация вовлекает ген рецептора альфа-ретиноевой кислоты (RARа) и у большинства больных наблюдается хороший ответ при лечении allrans-изомером ретиноевой кислоты (ATRA). Точки разрыва при этой транслокации всегда оказываются в гене RARа и в гене, называемом PML (от "promyelocytic leukemia") [214, 218]. RARа - это ядерный рецепторный белок, который присоединяет в качестве лиганда ретиноевую кислоту, а также связывается с ДНК при помощи домена "цинковых пальцев", активируя ряд репортерных генов. В норме белок RARа инициирует транскрипцию путем взаимодействия с кофакторными белками, регулируя экспрессию целого ряда генов, участвующих в миелоидной дифференцировке (гены циклинов, циклин-зависимых киназ, G-CSF, IL1, IL8, рецепторов CSF). В отсутствии ретиноевой кислоты белок RARа связывается с корепрессорами N-CoR, SMRT, PRAME и этот комплекс подавляет экспрессию ряда генов, в том числе ингибитора гистон-деацетилазы (HDAC1). В результате происходит реактивация HDAC1, которая гидролизует связи ацильных групп с гистонами, и это ведет к уплотнению хроматина. Транскрипция генов, расположенных в участках конденсированного хроматина, подавляется. При связывании белком RARа ретиноевой кислоты или ATRA происходит освобождение корепрессоров и связывание коактиваторов, ацетилирование белков-гистонов и активация транскрипции генов, отвечающих за дифференцировку клеток.
Белок PML тоже может связываться с ДНК при помощи домена "цинковых пальцев", кроме того, он содержит потенциальный мотив bZIP ("лейциновая молния"). Этот белок является супрессором опухолевого роста, относится к семейству белков TRIM (triplicate motif family). Фосфорилированный белок PML локализуется в нуклеарных тельцах (внутриядерные белковые структуры, число и размеры которых различны для разных клеточных типов, количество прямо пропорционально интенсивности синтеза белков и обратно пропорционально уровню дифференцированности клетки) [149]. Экспрессия гена PML зависит от стадий клеточного цикла. Белковый продукт этого гена участвует в реализации ответа гена р53 на онкогенные сигналы. Белок PML способен связываться с ДНК, что предполагает его роль в активации транскрипции ряда генов. Тем не менее, есть данные, что белок PML может и подавлять транскрипцию некоторых генов, например, гена множественной лекарственной устойчивости и фактора роста эндотелиальных клеток. В норме партнерами белка PML являются около 20 других белков, участвующих в формировании нуклеарных телец. Например, циклин D3, BAX, GADF, PLZF, а также ранние белки цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр, аденовируса, факторы репликации вируса простого герпеса.
Наиболее важным из двух химерных белков, возникающих в результате транслокации t(15;17), представляется PML-RARа, потому что этот белок имеет все важные функциональные домены как PML, так и RARа. В связи с этим белок PML-RARа способен связывать лиганд и димеризоваться, а также связываться как с партнерами RARа, так и с белками, образующими нуклеарные тельца (партнерами PML). Аномальный белок действует как ингибитор белков PML и RARa [149]. Другая транслокация при остром промиелоцитарном лейкозе t(11;17)(q23;q21) [67] - приводит к появлению химерного белка PLZF-RARа, в котором последовательности RARа слиты с N-концевой частью предполагаемого транскрипционного фактора PLZF (включая 2 из 8 его "цинковых пальцев").
Аналогичная ситуация наблюдается у больных пре-В-клеточным острым лейкозом (пре-В-ОЛЛ) при транслокации t(1;19). При этой транслокации N-концевая часть фактора транскрипции E2A сливается с ДНК-связывающим гомеодоменом транскрипционного фактора PBX [317], который замещает b-HLH район белка E2A. Такой слитый химерный белок превосходит PBX в способности активировать транскрипцию репортерных генов. Гены, с регуляторными участками которых может связываться гомеодомен от PBX, могут активироваться белком E2A-PBX и инициировать развитие опухоли.
Редкая транслокация t(17;19), встречающаяся у больных В-ОЛЛ, также вовлекает E2A в образование химерного гена, но в этом случае вторым участником оказывается ген HLF [179]. Продукт этого гена белок HLF имеет основный домен и лейциновую молнию" (bZIP). ДНК и белок-связывающий домен из HLF слит с частью белка E2A, которая и на этот раз сохраняет домен, отвечающий за активацию транскрипции. HLF способен и связываться с ДНК, и активировать транскрипцию сам по себе, однако в норме он не экспрессируется в лимфоидных клетках. Хромосомная транслокация помещает химерный ген E2A-HLF под контроль промотора E2A, который активен в лимфоидных клетках. Вероятно, E2A-HLF стимулирует экспрессию генов, подконтрольных HLF, что в случае лимфоидных клеток приводит к развитию опухоли.
У больных ОМЛ часто находят хромосомную транслокацию t(8;21)(q22;q22). Следствием этой транслокации является слитый белок AML1-ETO [245, 263, 287], составленный из последовательностей белка AML1 (21 хромосома) и ETO (eight twenty one, 8 хромосома). AML1 гомологичен одной из субъединиц мышиного белка PEBP2 (polyoma enchancer binding protein) и белку сегментации RUNT из Drosophila melanogaster. ETO не имеет большой гомологии с известными белками, но он содержит два ДНК связывающих мотива цинковых пальцев и несколько районов, обогащенных серином и пролином. AML1 и ETO, как полагают, являются факторами транскрипции. AML1 принимает участие в создании еще одного слитого онко-белка: AML1-EVI-1 [397]. Этот белок появляется при t(3;21), которую находят у некоторых больных ХМЛ в стадии бластного криза и у больных лейкозами, которые развиваются после миелодиспластического синдрома. Ген EVI-1, партнер AML1 при создании химеры AML1-EVI-1, в норме не экспрессируется в гематопоэтических клетках.
Это транскрипционный фактор с двумя отдельными доменами цинковых пальцев, он стимулирует транскрипцию с промотора с-FOS и активность транскрипционного комплекса AP-1 (c-FOS входит в этот комплекс). Показано, что активация этого гена может приводить к нарушению нормального гемопоэза. Функциональный анализ белка AML1-EVI-1 позволил выявить двойственный характер его поведения. С одной стороны, он является супрессором AML1, поскольку конкурирует с последним за места связывания. С другой стороны, активирует AP-1, так как усиливает транскрипцию промотора с-FOS.
Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза
Филадельфийская хромосома (Ph ), которая возникает в результате реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11), является специфическим цитогенетическим маркером хронического миелолейкоза (ХМЛ) [96, 286, 344].
Классический цитогенетический анализ, который в большинстве случаев позволяет достоверно устанавливать диагноз ХМЛ по присутствию в анализируемом образце Ph -хромосомы, в условиях постоянного совершенствования терапии ХМЛ становится недостаточно чувствительным для оценки минимальной остаточной болезни. Затруднения при стандартном цитогенетическом анализе связаны еще и с тем, что около 5% ХМЛ даже в дебюте заболевания не имеют классической Ph -хромосомы, которая изменяется до неузнаваемости в результате сложной генетической перестройки с участием дополнительных хромосом, однако химерный онкоген BCR-ABL1 у таких больных экспрессируется и может быть выявлен методами молекулярно-биологического анализа [252, 436]. При этом Ph -хромосома является генетической аномалией, наиболее полно проанализированной на молекулярном уровне, поэтому применение молекулярных методов для качественной и количественной диагностики этого маркера опирается на надежный теоретический фундамент.
В конце 80-х – начале 90-х годов минувшего века успех в лечении ХМЛ был связан с применением трансплантации костного мозга (ТКМ) и широким вовлечением в терапевтическую практику препаратов интерферона-альфа (IFN-) [8, 9]. Это позволило добиться у многих больных если не полной элиминации опухолевого клона, то значительного уменьшения количества опухолевых клеток в костном мозге и периферической крови. Именно в это время впервые стал острым вопрос о разработке высокочувствительных методов молекулярной диагностики ХМЛ, позволяющих выявлять единичные лейкозные клетки. В этот период для молекулярной диагностики ХМЛ стали применять метод блот гибридизации по Саузерну [260]. Для использования в качестве зондов были клонированы специфические последовательности, комплементарные определенным участкам гена BCR области M-bcr, которая чаще всего при ХМЛ вовлечена в генетическую перестройку. Обычно использовали 2 зонда: 5 -зонд содержал экзон b1 области M-bcr с последовательностями примыкающих к этому экзону интронов, а 3 -зонд – большую часть третьего интрона M-bcr. Метод блот-гибридизации обладает более высокой чувствительностью в сравнении с цитогенетическим анализом, и в описываемый период он очень широко применялся во всем мире для молекулярной диагностики ХМЛ. Применение для блот-гибридизации пары разных зондов позволило разделить больных ХМЛ на 2 типа согласно вариантам геномных точек разрыва в области M-bcr: «5 » – когда точка разрыва оказывалась между экзонами b2 и b3 и «3 » – когда точка разрыва попадала между экзонами b3 и b4 или b4 и b5. Применение метода блот-гибридизации для диагностики ХМЛ позволило изучить клинические особенности этого заболевания у пациентов, относящихся к 5 и 3 – типам точек разрыва. Ряд авторов утверждал, что при 3 варианте точек разрыва наблюдалась более короткая хроническая фаза ХМЛ, другие авторы не нашли никаких достоверных различий в продолжительности жизни и хронической фазы между этими вариантами транслокации t(9;22).
Внедрение в начале 90-х метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для молекулярной диагностики ХМЛ позволило более корректно разделить больных на группы, поскольку основным критерием для такого разделения стала не зона, в которую попадают геномные точки разрыва, а конечный результат молекулярной перестройки при t(9;22) – тип экспрессии химерного онкогена BCR-ABL1 [344]. При этом стали выявлять при ХМЛ основные варианты этого онкогена b2a2 и b3a2, а также e1a2. Вскоре во многом благодаря именно этой методике были обнаружены при ХМЛ и при Ph -положительном остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) более редко встречающиеся транскрипционные варианты химерного онкогена BCR-ABL1: e1a3, b2a3, b3a3, e6a2, e19a2 [348]. Анализ интрон/экзонной структуры нормальных генов BCR и ABL1 позволяет выявить значительное число потенциальных соединений экзонов BCR с экзонами ABL1 с сохранением рамки считывания. Экзоны BCR e1, e6, e12(b1), e13(b2), e14(b3), e19(c3) и e20(c4) могут слиться «в рамку» с экзонами гена ABL1 a2, a3 и a7 (однако в месте слияния e12 и a7 должен возникнуть стоп-кодон). Некоторые из этих комбинаций действительно встречаются, а остальные теоретически возможны. Кроме того, экзоны BCR e2, e3, e4, e5, e7, e8, e10, e11, e15, e16, e17 и e22 могли бы слиться «в рамку» с экзонами ABL1 a4, a8, a9, a10 и a11; экзоны BCR e9 и e21 – с a5 и a6 ABL1. Изучение искусственных мутантных форм BCR-ABL1 показало, что для проявления его трансформирующей активности необходим SH2 домен ABL1, который закодирован в экзонах a3 и a4. Следовательно, маловероятно, что будут обнаружены в качестве единственного маркера ХМЛ какие-либо варианты химерного гена BCR-ABL1 без этих экзонов.
Метод ПЦР для диагностики ХМЛ очень быстро завоевал всеобщее признание и вскоре вытеснил метод блот-гибридизации. Однако интерес к изучению геномных точек разрыва сохранялся, поскольку существовала надежда на то, что анализ их тонкой молекулярной структуры позволить вскрыть молекулярные механизмы, посредством которых осуществляется транслокация t(9;22). Для исследования геномных точек разрыва при ХМЛ применяли как создание и скрининг библиотек генов, так и более быстрые методы прогулок по хромосомам, основанные на ПЦР. К сожалению, изучение рядом лабораторий первичной последовательности нескольких десятков разных геномных точек разрыва химерного онкогена BCR-ABL1 от больных ХМЛ пока не позволило выявить никакой характерной молекулярной структуры, общей для всех проанализированных сайтов разрыва—слияния ДНК генов BCR и ABL1. Высказано предположение, что варианты транслокации t(9;22), приводящие к появлению химерного онкогена BCR-ABL1 типов b3a2 и b3a3, могут осуществляться за счет гомологичной рекомбинации между Alu-повторами, которые расположены в первом интроне гена ABL1, и повтором из того же семейства, лежащим в интроне между экзонами b3 и b4 области M-bcr [394]. Установление структуры геномной точки разрыва гена BCR-ABL1 у конкретного больного ХМЛ позволяет разработать индивидуальную систему молекулярной диагностики, при помощи которой у этого больного на уровне геномной ДНК можно выявлять с высокой чувствительностью и специфичностью остаточные опухолевые клетки и проводить оценку их количества [393, 407]. Однако самое широкое применение для молекулярной диагностики ХМЛ получила ПЦР-амплификация, субстратом которой является не геномная ДНК больного, а тотальная РНК, выделенная из клеток костного мозга или периферической крови. Метод, известный как обратно-транскриптазная – полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) достаточно прост и воспроизводим, позволяет выявлять различные транскрипционные варианты гена BCR-ABL1 и при этом он обладает такой высокой чувствительностью, что с его помощью можно обнаруживать одну опухолевую клетку среди 100 000–1 000 000 анализируемых клеток [131].
Появление в арсенале гематологов ингибиторов тирозинкиназной активности, специфически подавляющих функцию химерного онкогена BCR-ABL1, привело к настоящей революции в лечении ХМЛ [107, 313]. Необходимость в чувствительных и надежных методах количественной оценки остаточных опухолевых клеток стала еще более насущной. Стандартный цитогенетический анализ пополнился методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), чувствительность которого приблизилась к той, которая достижима при использовании ПЦР, а специфичность иногда оказывается даже выше, чем при ПЦР. Метод FISH сочетает в себе возможности и преимущества как молекулярно-биологического, так и визуального микроскопического анализа. Но ПЦР-анализ был также усовершенствован, и с появлением специального оборудования появилась возможность проводить так называемую ПЦР в реальном времени. Появление этого метода позволило превратить молекулярную диагностику ХМЛ из манипуляции, граничащей с искусством, в средство рутинного лабораторного анализа. При этом появилась возможность значительно упростить имеющиеся на сегодняшний день протоколы обследования больных ХМЛ в полной ремиссии. Кроме того, в рамках этого метода возникает возможность стандартизировать молекулярное лабораторное исследование, что позволяет сравнивать и унифицировать схемы лечения ХМЛ с применением ингибиторов тирозинкиназ во всем мире. При помощи ПЦР в реальном времени количество транскрипта гена BCR-ABL1 можно оценить как абсолютно, установив количесто матрицы в анализируемом образце, так и по отношению к уровню экспрессии контрольного гена (GADPH, B2M, ABL1, BCR, GUS) [131].
Разработка тест-систем для анализа экспрессии химерных онкогенов – маркеров гемобластозов на основе ПЦР
Известно несколько десятков хромосомных аномалий, характерных для определенных типов лейкозов, цитогенетический анализ давно стал обязательным компонентом диагностики. В последнее время стала известна и молекулярная основа многих из этих хромосомных изменений, изучена первичная последовательность и структура точек разрыва генов, вовлеченные в специфические транслокации, делеции и инверсии. Цитогенетическое исследование является стандартным методом выявления хромосомных аномалий при лейкозах и широко используется для диагностики. Этот метод имеет ряд ограничений - обязательное наличие достаточного количества клеток в митозе, определение только сравнительно крупных хромосомных нарушений. Существует более совершенный вариант цитогенетического анализа – флюоресцентная гибридизация in situ (FISH), но и он имеет погрешность до 16%, обусловленную случайным наложением сигнала. Метод обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) позволяет определять экспрессию химерных онкогенов на молекулярном уровне, на уровне м-РНК. Метод ОТ-ПЦР имеет более высокую чувствительность, чем стандартный цитогенетический анализ – одна злокачественная клетка на 104 -106 здоровых, позволяет определять хромосомные микроперестройки, учитывать различные варианты транскриптов и сплайсинга при одной и той же транслокации. Задачей нашей работы была разработка оригинальных тест-систем для определения методом ОТ-ПЦР экспрессии наиболее распространенных химерных онкогенов при ХМЛ, ОМЛ и ОЛЛ и применение их для диагностики и мониторинга лейкозов.
Для разработки тест-систем были выбраны 11 наиболее распространенных при лейкозах хромосомных нарушений, при этом учитывались наиболее часто встречающиеся варианты точек разрыва в слитых генах. Информация о генных последовательностях и структуре была получена в GeneBank, праймеры подбирались с использованием программ Vector NT и Blast. Были также подобраны праймеры и разработаны тест-системы для генов домашнего хозяйства – ABL1, бета-актина и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GAPHD). В ряде случаев использовались системы праймеров, предложенные BIOMED-1 и. BIOMED-2 [376]. Для отладки тест-систем, диагностики и мониторинга использовались периферическая кровь и костный мозг больных гемобластозами РОНЦ им. Н.Н.Блохина, ГНЦ МЗ РФ, гематологических отделений РДКБ, института педиатрии, Морозовской детской клинической больницы, ГВКГ им. Бурденко, клинической больницы им. Боткина и других клиник, в том числе из разных городов России. Выделение тотальной РНК из клеток костного мозга и периферической крови проводилось при помощи фенольно-хлороформной экстракции. В реакции обратной транскрипции применяли обратную транскриптазу M-MLV и ингибитор РНКаз (Promega), гексамеры и специфические обратные праймеры, для каждой реакции использовалось 1-10 мкг РНК. Двухстадийная (nested) ПЦР проводилась на основе разработанных тест-систем «Онкоскрин» для определения экспрессии химерных онкогенов. Основными условиями, которым должна удовлетворять тест-система, были достаточно высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов. Для каждой тест-системы подбирались оптимальные условия проведения ПЦР - состав реакционной смеси, температурные и временные параметры реакции, дальнейшая работа проводилась согласно предложенным в инструкции условиям. В качестве положительных контролей использовались кДНК и ПЦР амплификаты, полученные от позитивных больных, кДНК клеток линии К562, фрагменты ДНК, клонированные в векторе pGEM в клетках E.coli. Детекция результатов осуществлялась путем электрофореза продуктов ПЦР в 6% полиакриламидном геле.
Для определения экспрессии химерных онкогенов на качественном уровне были разработаны системы двустадийной ПЦР. Были подобраны оптимальные соотношения компонентов реационных смесей. В Табл.4 (стр.118) представлен оптимальный вариант буфера, на основе которого были разработаны 10-кратные реакционные смеси для ПЦР1 и ПЦР2.
При разработке этого буфера был сделан вывод о необходимости использования источников исходных компонентов наивысшей химической квалификации, кроме того, оказалось целесообразным проводить сравнение качества реагентов от разных производителей. При равных заявляемых характеристиках реагентов от разных поставщиков эффективность ПЦР могла существенно различаться.
Было показано, что оптимальная концентрация каждого из праймеров в 10-кратной смеси ПЦР1 составляет 2 мкМ, а в смеси ПЦР2 – 4 мкМ. Последовательность праймеров представлена в Приложении 1 (стр.266).
В состав каждого набора для определения экспрессии химерных онкогенов методом гнездовой ПЦР с последующей визуализацией ампликонов при помощи электрофореза входили следующие компоненты
Контрольная кДНК каждого из химерных онкогенов была клонирована в составе вектора pGEM (Promega, США) в соответствие с рекомедациями производителя. Для каждого из наборов были соствлены инструкции, пример одной из них представлен в Приложении 2 (стр. 269).
Для определения чувствительности тест-систем использовали десятикратные разведения опухолевых клеток суспензиями нормальных клеток, десятикратные разведения кДНК и плазмидных контролей (Рис.6, стр.119).
Чувствительность для разных наборов составила от 1 до 5 копий матрицы в 1 мкл.
Для определения специфичности тест-систем использовали в качестве анализируемых образцов линии культивируемых опухолевых клеток и клеток костного мозга и крови больных лейкозами с разными вариантами транслокаций. Специфичность всех разработанных нами тест-систем составила 100%.
Нами были разработаны и успешно апробированы тест-системы на основе ОТ-ПЦР для определения экспрессии химерных онкогенов при гемобластозах. Созданы тест-системы для выявления наиболее распространенных хромосомных нарушений, характерных для различных типов лейкозов, при этом для каждой транслокации учитывались различные варианты точек разрыва и сплайсинга. Для t(9;22) - химерного онкогена BCR-ABL1 созданы системы для определения вариантов b3а2 и b2а2 (р210), характерных для ХМЛ и ОЛЛ, и варианта е1а2 (р190), характерного для ОЛЛ. Проанализировано свыше 3000 больных ХМЛ, 250 больных ОЛЛ, 450 больных ОМЛ (3-10 исследований на больного, срок наблюдения свыше 5 лет). Изучение экспрессии онкогена позволило осуществлять первичную диагностику ХМЛ, дифференцировать диагноз между ХМЛ, МДС, сублейкемическим миелозом и миелофиброзом, выявлять транслокацию у больных ОЛЛ и ОМЛ, контролировать состояние больных в процессе лечения, в том числе после пересадки костного мозга, изучать минимальную остаточную болезнь, предсказывать появление рецидивов. Для t(15;17) - химерного онкогена PML-RARA тест-система с 3 парами праймеров позволяет определять наиболее часто встречающиеся при ОПЛ варианты транскрипта bcr1 и bcr3. Исследовано 7 детей и 189 взрослых, в среднем по 8-10 определений для каждого больного, срок наблюдения - 5 лет. Определение транскрипта позволило подтвердить диагноз ОПЛ, наблюдать за больными на всех этапах лечения, осуществлять диагностику молекулярного рецидива при сохранении у пациентов клинико-гематологической ремиссии. Кроме того, нами созданы тест-системы для определения транскрипции диагностически значимых химерных онкогенов при следующих хромосомных нарушениях: t(8;21) – AML1-ETO, t(4;11) – MLL-AF4, t(9;11) – MLL-AF9, t(11;19) – MLL-ENL, t(1;19) – E2A-PBX1, t(12;21) – TEL-AML1, del1 – SILAL1, inv(16) – CBFB-MYH2, t(3;21) – AML1-EVI1. Эти хромосомные изменения характерны для определенных типов лейкозов и возрастных групп, являются критерием благоприятного или неблагноприятного прогноза течения заболевания, наличие этих маркеров позволяет выбрать адекватную схему лечения. На наличие этих нарушений нами обследовано свыше 700 больных ОЛЛ и ОМЛ.
Сравнение значений цитогенетического и молекулярного ответа
Сравнение данных молекулярного и цитогенетического ответов проводилось на 274 образцах пациентов, у которых оба анализа были выполнены одновременно. Образцы были разделены на группы, соответствующие уровню цитогенетического ответа (ЦО). Группа с отсутствием ЦО составила 29 образцов, с минимальным ЦО – 16, с малым ЦО – 18, с частичным ЦО – 43, с ПЦО – 168 образцов.
Разброс значений экспрессии BCR-ABL1 в каждой группе был очень широким, но в целом он уменьшался по мере снижения процентного содержания Ph-позитивных клеток. Медиана экспрессии также уменьшалась, от 88,53 в группе с отсутствием ответа, до 0,07 в группе с ПЦО (Табл.10, стр.134).
При сравнительном анализе данных цитогенетического и молекулярного ответов мы показали, что существует корреляция между уровнями этих ответов. Тест ранговой корреляции Спирмена подтвердил наличие положительной корреляции между процентным содержанием Ph-позитивных клеток и уровнем экспрессии BCR-ABL1. Коэффициент корреляции составил 0,713 (p 0,0001).
Соотношение долей образцов с разным уровнем экспрессии BCR-ABL1, заметно отличалось в группах с разным ЦО. С уменьшением процентного содержания Ph-позитивных клеток, увеличивалась доля образцов с более слабым уровнем экспрессии (Рис. 13, стр.135).
Каждая группа с определенным уровнем цитогентического ответа неоднородна по структуре молекулярного ответа, в ней есть образцы с более высокой и более низкой экспрессией. В группах с отсутствием ЦО, с минимальным и малым ЦО преобладающими являются образцы с высокой экспрессией BCR-ABL1 – более 10%, которые составляют в этих группах 88,7%, 81,2% и 77,8% соответственно. В группе с частичным ЦО доля образцов с высокой экспрессией уже не является преобладающей и составляет 34,9%, а среди пациентов с ПЦО эта доля снижается до 8,9%. Образцы с экспрессией BCR-ABL1 менее 1% и с БМО появляются уже в группе пациентов с малым ЦО, в группе с частичным ЦО доля таких образцов увеличивается. В группе с частичным ЦО появляются и образцы с ПМО, т.е. с недететектируемой экспрессией BCR-ABL1. Таких пациентов было 4 из 43 пациентов в этой группе, у всех содержание Ph-позитивных клеток составляло 4-5%. Возможными объяснениями этого феномена является либо наличие другого типа транскрипта BCR-ABL1 (р190, р230), либо ингибирование экспрессии в клетках пациента. Группа пациентов с ПЦО наиболее неоднородна по составу образцов с разным уровнем МО. Более 50% в этой группе составляют образцы с БМО и еще около 25% - образцы с экспрессией от 0,1% до 1%. Образцы с экспрессией выше 1% составляют в этой группе немногим более 20% образцов.
Мы проанализировали взаимосвязь между цитогенетическим ответом в трех группах (отсутствие БЦО, ЧЦО и ПЦО) и распределением по уровню экспрессии BCR-ABL1 в каждой из них. При попарном сравнении групп по критерию Манн-Уитни было показано, что существуют значимые различия по медиане и среднему между этими группами (p 0,0001), т.е. эти группы не относятся к одной генеральной совокупности. По критерию Краскелла-Валлеса эти три группы также отличались друг от друга с высоким уровнем значимости (p 0,0001).
На основании этих же данных мы определили, что уровню экспрессия BCR-ABL1 1% в 91,4% случаев соответствует ПЦО, а уровню экспрессии от 1 до 10% в 82,4% случаев соответствует БЦО. Это вполне согласуется с данными, полученными Ross и соавторами в рамках исследования по сравнению параметров молекулярного и цитогенетического ответов [343].
Коэффициент корреляции Спирмена, полученный этими же исследователями при сопоставлении значений уровня экспрессии BCR-ABL1 и процентного содержания Ph-позитивных клеток, составил 0,765 (n=828; p 0,001), что ненамного отличается от коэффициента в нашем исследовании. Большая выборка, которой оперировали Ross и соавторы [343], несомненно, позволяет получить более точное и высокое значение этого коэффициента. Необходимо отметить, что у этих исследователей также наблюдались противоречивые данные, когда низким значениям экспрессии BCR-ABL1 соответствовали достаточно высокие значения содержания Ph-позитивных клеток, например значениям экспрессии BCR-ABL1, составляющим 2,3-6,7%, соответствовали значения содержания Ph-позитивных клеток 39-65%.