Содержание к диссертации
Введение 5
Обзор литературы 7
Основные особенности превращения нормальной клетки в опухолевую7
Ras-индуцируемые сигнальные пути 9
Суперсемейство и семейство Ras 11
Онкобелки Н-, N-, K-Ras 14
Эффекторы Ras 15
Raf и ERK/MAPK каскад 16
РІЗК-сигналинг 17
RalGEF - факторы обмена нуклеотидов Ral 18
Прочие эффекторы Ras 20
Специфическая роль отдельных эффекторов Ras в онкогенезе человека и грызунов 21
2.3. ITa3biRal 23
Регуляция активности белков Ral 25
Участие белков Ral в сортировке везикул 27
Базолатеральная доставка мембранных белков в поляризованных клетках 27
Ral и эндоцитоз 29
Белки Ral и морфология клетки 31
Белки Ral и экспрессия генов 32
Ral белки, пролиферация клеток и канцерогенез 34
2.4. Убиквитинирование как система белковой регуляции 36
Убиквитин и модифицирующие ферменты 37
Типы убиквитинирования 39
Роль убиквитинирования в сигнальных путях и онкогенезе 40
3. Материалы и методы 45
Растворы, среды и реагенты 45
Клеточные линии 45
Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 46
Выделение плазмидной ДНК 46
Электрофорез нуклеиновых кислот 47
Белковый электрофорез и вестерн-блотинг 47
Молекулярное клонирование 47
Получение компетентных клеток E.coli 47
Трансформация Е.coli 48
Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 48
Реакция лигирования ДНК 48
Получение мутантных конструкций 48
Трансфекция плазмидными конструкциями 50
Трансфекция siRNA 50
3.10.Определение метастатической активности...: 50
З.П.ВыделениеШБ-меченых белков 51
4. Результаты 52
Модельная система для детекции убиквитинированных in vivo белков52
Убиквитинирование эндогенного и сверх-экспрессированного RalA..54
Убиквитинирование RalA в различных клеточных линиях 55
Влияние ингибиторов протеасомных и лизосомных протеаз на стабильность и убиквитинирование RalA 55
Влияние ингибитора протеасомной деградации на экспрессию различных форм RalA и RalB 56
Определение возможного типа полиубиквитинирования RalA 57
Стабильность RalA при подавлении клеточной трансляции 58
Роль деубиквитинирующей протеазы USP25 в убиквитинировании RalA 59
НВХ 41,108 - ингибитор деубиквитинирующей протеазы USP7/HAUSP 60
4.10.HET-SR и HET-SR1 - трансформированные линии с различиями в
системе контроля фолдинга и деградации белков 61
4.11.Роль сигналов внутриклеточной локализации в убиквитинировании RalA 61
4.12.Убиквитинирование RalA, мутантного по позициям 134, 143, 191 63
4.13.Убиквитинирование химерных белков RalA/RalB 64
4.14. Убиквитинирование точечных мутантов RalA с различными заменами
лизиновых остатков 66
4.15.Убиквитинирование белков Ral с изменённой активностью 67
4.16.Убиквитинирование эффекторных мутантов RalA и RalB 68
Обсуждение результатов 69
Выводы 72
Список использованной литературы 73
DEPC-H20
DMEM
EDTA
ERAD
FACS
FITC
GAPDH
HET-SR
HGF/SF
IRES
JNK/SAPK
PI(3,4)P2
PI(3,4,5)P3
PI3-K
PLD1
PMSF
RalBPl
SDS-PAGE
SH2-flOMeH
БНЗ-домен
shMDGl
uPAR
VEGF
ZONAB
МАРК
ЭДТА
Используемые сокращения
цито'мегаловирус (cytomegalovirus) вода, обработанная диэтилпирокарбонатом Dulbecco's modified Eagle medium дитиотреитол Этилендиаминтетраацетат
экспериментальная метастатическая активность (experimental metastatic activity) epithelial to mesenchymal transition ER-associated degradation fluorescence-activated cell-sorting киназа фокальных контактов (focal adhesion kinase) fluorescein isothiocyanate
глицеральдегид-фосфат-дегидрогеназа (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) рецепторы ростовых факторов
хомяковые эмбриональные фибробласты (hamster embryonic fibroblast) хомяковые эмбриональные фибробласты, трансформированные штаммом Schmidt-Rupin вируса саркомы Рауса
фактор роста и рассеяния гепатоцитов (hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor) внутренний сайт посадки рибосомы (internal ribosomal entry site) c-jun N-концевые киназы/активируемые стессом протеин киназы фосфотидилинозитол-4,5-бифосфат фосфотидилинозитол-3,4,5-трифосфат фосфатидилинозитол-3-киназа (phosphatidylinositol 3-kinase) протеин-киназа С фосфолипаза С фосфолипаза D1 Фенилметилсульфоксид Ral-связывающий белок (Ral binding protein) Вирус Саркомы Рауса (Rous sarcoma virus) вирус саркомы Рауса (Rous Sarcoma Virus) додецилсульфат натрия (sodium dodecil sulfate)
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS Src-гомологичный домен-2 Src-гомологичный домен-3
Syrian hamster homologue of microvascular differentiation gene 1 спонтанная метастатическая активность (spontaneous metastatic activity) трансформирующий фактор роста (transforming growth factor) фактор некроза опухолей (tumor necrosis factor) рецепторы урокиназного активатора плазминогена
васкулярный эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor) Zo-1 ассоциированный белок, связывающий нуклеиновые кислоты тысяч оснований, тысяч пар оснований
митоген активируемые протеинкиназы (mitogen activated protein kinase) Протеинкиназа В эндоплазматический ретикулум ubiquitin-binding domain ubiquitin-associated domain ubiquitin-interacting motif
Происхождение названий генов и их продуктов
АРС adenomatous polyposis coli
Вах Bcl-2-associated X protein
Bcl-2 B-cell lymphoma-2 protein
Brmsl breast cancer metastasis suppressor 1
CAMs cell adhesion molecules
EGF эпителиальный фактор роста (epidermal growth factor)
EGFR epidermal growth factor receptor
EMMPR1N extracellular matrix metalloproteases inducer
Erdj ER-localized DnaJ homologues
ERK внеклеточнорегулируемая протеинкиназа (extracellular regulated kinase)
GFP green fluorescent protein
HDAC histone deacetylase
HSF heat shock factor
HSPGs heparan sulfate proteoglycans
IGF-1 инсулиноподобный фактор роста (insulin-like growth factor)
JNK JUN-activated kinase
KSR kinase suppressor of Ras
МАРК mitogen activated protein kinase
MMP матриксные металлопротеиназы (matrix metalloproteases)
PAI plasminogen activator inhibitor
PDGF фактор роста тромбоцитов (platelet-derived growth factor)
PDI protein disulphide isomerase
PERK/PEK PKR-like endoplasmic reticulum kinase/pancreatic elF2a kinase
Rkip Raf kinase inhibitor protein
SF/HGF scattering factor / hepatocytes growth factor
SSeCKs Src-suppressed С kinase substrate
TGF|3 transforming growth factor 0
Tie tyrosinkinase with Ig- and EGF-homologous domains
TIMP tissue inhibitor of metalloproteases
uPA urokinase plasminogen activator
VDUP1 vitamin D3 upregulated protein 1
Введение к работе
Онкологические заболевания сегодня являются одной из актуальнейших медицинских проблем, а изучение всех аспектов возникновения и развития опухолей имеет большое значение для современной медицинской науки. Процессы канцерогенеза представляют также огромный интерес для молекулярной биологии, поскольку причиной возникновения всех опухолевых заболеваний являются нарушения в сложных механизмах регуляции клеточной жизнедеятельности, а многие из этих механизмов до сих пор не до конца изучены даже в норме.
В опухолевой прогрессии принимают участие не только широко изучаемые онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста, но и гены-модуляторы. Белковые продукты последних не влияют на злокачественную трансформацию клеток, но способствуют росту и распространению опухоли в организме: участвуют в процессах неоангиогенеза, инвазии и метастазирова-ния. К ним можно отнести ряд цитокинов, хемокинов, ростовые факторы и их рецепторы, некоторые гены иммунного ответа, гены контроля активности протеолитических ферментов, везикулярного транспорта, системы белковой деградации и т.п.
Целью данной работы является выявление деталей регуляции Ral-индуцированных сигнальных путей, и в частности, роль убиквити-нирования в этом процессе.
В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:
Определить статус убиквитинирования белков Ral
Оценить уровень убиквитинирования Ral в различных линиях трансформированных клеток
Найти позиции, по которым происходит убиквитинирование
Создать неубиквитинируемые варианты Ral путём точечного мутагенеза найденных позиций
Определить свойства полученных мутантов Ral по сравнению с исходными белками
Выявить роль ранее обнаруженных партнёров в убиквитинировании Ral.
Научная новизна и практическая значимость исследования
В данной работе был впервые продемонстрирован факт убиквитинирования белков RalA и RalB; показано, что данная модификация не является сигналом протеасомной деградации. Убиквитинирование RalA найдено во всех исследованных линиях клеток человека и грызунов и является, таким образом, универсальным для различных типов клеток. В ходе работы создано более 60 новых генных конструктов, которые могут быть использованы при изучении свойств белков RalA и RalB. В том числе, получена панель мутантных форм RalA с разной степенью убиквитинирования; определены участки RalA, наиболее важные для убиквитинирования; показано критическое значение локализации RalA для его убиквитинирования. Оптимизирована методика определения убиквитинирования белков in vivo, которая позволяет уменьшить количество требуемого для исследования материала и сократить время исследования.
Работа носит в первую очередь теоретический характер, однако полученные данные могут быть использованы при дальнейшем изучении участия белков Ral в процессах опухолевой трансформации и прогрессии, а также разработке противоопухолевых агентов, влияющих на убиквитинирование данных белков.
Апробация работы
- Диссертация апробирована и рекомендована к защите 27 сентября 2007
года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных
и вирусных онкогенов, вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных
вирусов, молекулярной биологии вирусов, биохимии опухолей, методов
скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина
РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях «Journees
de l'Ecole doctorale de cancerologie» в 2006 и 2007 гг. (Роскофф,
Франция), «Vleme Colloque Petites Proteines G». (Муан-Сарту, Франция).
По материалам диссертации опубликовано 2 научные статьи и 5 тезисов докладов.
2. Обзор литературы
Процессы канцерогенеза носят комплексный характер и затрагивают многие аспекты жизнедеятельности клетки и организма. В основе этого процесса лежит накопление клетками различных генетических изменений, искажающих нормальные пути проведения сигнала и приводящие к неопластической трансформации. Малигнизация клеток происходит в результате накопления в их геноме нарушений, приводящих к неконтролируемой пролиферации клеток, их иммортализации и приобретению способности к инвазии и метастазированию. Несмотря на то, что получено множество данных о молекулярных изменениях, происходящих при трансформации клеток, картина остается неполной и многие аспекты требуют дальнейшего изучения.