Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 18
1.1. Перспективы применения онколитических векторов 18
1.1.1. Введение 18
1.1.2. Генная терапия как метод лечения опухолей головного мозга 19
1.1.3. Молекулярные и структурные основы конструирования генно-инженерных векторов 20
1.1.4. Литические вирусные векторы направленного действия: общие принципы 22
1.1.5. Онколитические векторы на основе вирусов животного происхождения 23
1.1.6. Онколитические векторы на основе генома вирусов человека 25
1.2. Онколитические векторы в нейроонкологии 29
1.2.1. Введение 29
1.2.2. Молекулярные основы построения противоопухолевых онколитических векторов, применяемых в нейроонкологии 30
1.2.3. Усиление направленной инфекции онколитических вирусов: связывание с клеточным рецептором и интернализация 31
1.2.4. Транскрипционный контроль аденовирусной инфекции в глиомах 33
1.2.5. Стратегии, повышающие противоопухолевый эффект вектора 37
1.3. Роль сурвивина в диагностике и терапии глиобластомы человека 39
1.3.1.Введение 39
1.3.2. Общая характеристика и механизм действия 41
1.3.3. Регуляция экспрессии белка сурвивина 42
1.3.4. Клиническое значение экспрессии сурвивина для диагностики опухолей головного мозга 43
1.3.5. Терапевтические подходы таргетинга сурвивина 45
ГЛАВА 2.Материалы и методы 48
2.1. Клинический материал 48
2.2. Клеточные линии 48
2.2.1. Перевиваемые клеточные линии 48
2.2.2. Первичные линии клеток пациентов с диагнозом «глиобластома» 49
2.2.3. Типирование клеток глиобластомы
2.3. Химические реагенты 50
2.4. Получение и характеристика аденовирусных векторов
2.4.1. Получение и характеристика аденовирусных векторов, дефектных по репликации 51
2.4.2. Использование онколитических вирусов ONYX015 и 24 51
2.5. Титрование аденовирусных векторов 54
2.5.1. Определение оптической плотности вирусной суспензии 54
2.5.2. Бляшкообразование 55
2.5.3. Определение инфекционного титра методом окраски клеточного монослоя антителами против гексона аденовируса 2.6. Биоинформатический анализ экспрессии генов с использованием баз данных TCGA, Oncomine и Rembrandt 56
2.7. Флуороцитометрический анализ клеточных популяций
2.7.1. Экспрессия клеточных рецепторов 56
2.7.2. Анализ аутофагии 57
2.7.3. Анализ клеточного деления 58
2.7.4. Детекция апоптоза с использованием антител против Аннексина 58
2.7.5. Клеточное разделение с использованием FACS 59
2.8. Количественный ПЦР 59
2.8.1. Количественный ПЦР клеточных и вирусных мРНК 59
2.8.2. Количественный ПЦР клеточных микроРНК 60
2.8.3. Количественный анализ экспрессии генов методом ПЦР в 96-луночном планшете (Array) 61
2.8.4. Количественный анализ экспрессии клеточных микроРНК методом ПЦР в 96-луночном планшете (miFinder Array-микрочип) 61
2.9. Определение экспрессии клеточных и вирусных антигенов с помощью иммунофлуоресценции 62
2.9.1. Клетки глиобластомы 62
2.9.2. Цитологический метод окрашивания клеток, имеющих фрагментацию ДНК 2.10. Определение клеточной цитотоксичности с помощью электронного микроскопа 63
2.11. Ангиогенез: формирование тубул 64
2.12. Анализ экспрессии ангиогенных факторов в клеточных лизатах 64
2.13. Анализ экспрессии клеточных лизатов с помощью вестерн-блоттинга в ПААГ 64
2.14. Определение токсичности реагентов in vitro окраской красителем трипановым синим 65
2.15. Определение клеточной пролиферации и токсичности с помощью МТТ-реагента
2.15.1. Ингибирование пролиферации клеток вирусом 66
2.15.2. Ингибирование пролиферации клеток в присутствии химиопрепаратов
2.16. Детекция поврежденных клеток в реакции клеточной цитотоксичности (LDH) 67
2.17. Детекция поврежденных клеток с помощью окраски кристаллвиолетом 68
2.18. Инфекция клеточных культур in vitro 68
2.19. Тестирование цитотоксического действия реагентов in vivo 69
2.20. Создание систем in vivo для тестирования терапевтических препаратов
2.20.1. Использование внутримозговой модельной системы глиобластомы человека 70
2.20.2. Подкожная модель глиомы человека 71
2.21. Окрашивание тканевых срезов 71
2.21.1. Окрашивание срезов гематоксилин-эозином 71
2.21.2. Иммуногистохимическое окрашивание тканей 72
2.21.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание тканевых срезов 72
2.22. Статистический анализ 73
Глава 3. Результаты исследований 74
3.1. Генная терапия – экспериментальный подход в лечении глиобластомы головного мозга 74 3.1.1. Роль белка фибера аденовируса в вирусной репликации, транскрипции и сборке вирусных вирионов 83
3.1.2. Генетическое клонирование фибера аденовируса человека типа 3 в геном рекомбинантного вектора обеспечивает высокий уровень трансдукции клеток глиобластомы человека 93
3.1.3. Сурвивин – активный компонент резистентности глиобластомы к терапии темозоломидом и ионизирующей радиацией 100
3.2. Онколитический вирус CRAd-S-5/3 демонстрирует высокую избирательную токсичность по отношению к глиобластоме 110
3.2.1.Определение эффективности генно-инженерного препарата CRAd-S-5/3 с использованием внутримозговых моделей глиобластомы человека 123
3.3. Способы усиления терапевтического эффекта онколитического вектора in vitro и in vivo 127
3.3.1. Усиление вирусной репликации 3 CRAd-S-5/3 верапамилом 127
3.3.2. Механизм клеточной смерти, вызываемой онколитическим вирусом CRAd-S-5/3 130
3.3.3. Применение тамоксифена, как индуктора аутофагии 149
3.3.4. Регуляция программируемой клеточной смерти клеточной микроРНК 7d 154
3.3.5. Использование стандартных методов лечения: ионизирующая радиация и темозоломид для усиления активности онколитического вектора 158
3.3.6. Влияние Р53 на цитотоксичность онколитического вируса в комбинации с темозоломидом 162
3.3.7. Роль Hh-GLI сигнальных путей резистентности к онколитическому вектору 165
3.3.8. Использование CRAd-S-5/3 в качестве платформы для доставки генетического материала в клетки глиобластомы, резистентные для темозоломида и ионизирующей радиотерапии 167
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 177
Заключение 191
Выводы 194
Список используемых сокращений и терминов 197
Список использованной литературы 199
- Онколитические векторы на основе вирусов животного происхождения
- Первичные линии клеток пациентов с диагнозом «глиобластома»
- Роль белка фибера аденовируса в вирусной репликации, транскрипции и сборке вирусных вирионов
- Использование CRAd-S-5/3 в качестве платформы для доставки генетического материала в клетки глиобластомы, резистентные для темозоломида и ионизирующей радиотерапии
Онколитические векторы на основе вирусов животного происхождения
Генная терапия представляет собой сравнительно новое направление в лечении опухолей головного мозга с помощью генно-инженерного вектора [53, 54]. Генно-инженерный вектор, использованный в качестве носителя генетической информации, позволяет селективно доставить генетический материал в клетки мишени [18, 55]. Для этого используется механизм вирусной инфекции что стало возможным благодаря клонированию рекомбинантной нуклеиновой кислоты (НК) в состав вирусной частицы. При этом высокий уровень продукции, встроенных в вирусный геном смысловых НК, позволяет получить значительный терапевтический эффект [56, 57]. Однако не только встроенная рекомбинантная нуклеиновая кислота (НК) приводит к увеличению специфичности онколитического вектора. Внесение дополнительных модификаций в структурные белки вирусного капсида, отвечающие за связывание вируса с клеткой, также повышает опухолеспецифичность вектора [15].
Терапия сильно васкуолиризованной опухоли, такой как глиобластома, представляется тяжелым испытанием. Золотыми стандартами в лечении этого заболевания являются хирургическая резекция, ионизирующая радиация и применение темозоломида (TMZ, темодал) (Рис. 2). В дополнение к этому используется бевацизумаб, что как было недавно показано, существенно пролонгирует выживаемость пациентов [58], но не спасает от возникновения рецидива глиобластомы.
Согласно литературе, драйверами, вызывающими повторное появление опухоли, являются, например, активация mTOR [59, 60], и MMP2 [58]. Интересно, что активация mTOR индуцирует клеточную аутофагию- механизм, отвечающий за выживаемость опухоли [61], и иммунный ответ [62]. Недавние публикации показывают, что стволовые клетки глиобластомы резистентны к химио [63] и радиотерапии [64]. В связи с этим можно предположить, что направленная инфекция стволовых клеток глиобластомы аденовирусным вектором может увеличить эффективность терапии.
Одним из ключевых факторов, обеспечивающих целевое действие на опухолевые клетки, является экспрессия клеточных рецепторов на поверхности глиомных клеток. Чем больше первичного рецептора представлено на поверхности клетки, тем эффективнее вирусная инфекция. Нами и другими исследователями было показано, что клетки глиом высоко экспрессируют IL13alpha2 [56], CD46 [65], Syndecan-1 [66], CD80/86 [67], интегрин альфа 3/5 [68], NESTIN [69], но не экспрессируют Коксаки-аденовирусный рецептор (CAR). В последнем случае используются генно-инженерные возможности, позволяющие менять специфичность узнавания вирусом поверхностного рецептора. Новые подходы предусматривают клонирование рецептор-связывающих участков в состав вирусного белка, отвечающего за распознавание клетки вирусом (фибера аденовируса, гликопротеидов герпесвируса или вируса бешенства) или путем замены рецептор-связывающей области поверхностного белка на гомологичную, но принадлежащую другому вирусному серотипу [55, 70, 71].
В литературе также описаны случаи таргетинга поверхностных молекул (онко-рецепторов) глиом HER2, UPAR, FGFR, EGFR с использованием модифицированных векторов на основе геномов аттенуированного вируса бешенства [73-77], а также вируса Сендай [78] и аденовируса [79-81]. В вышеуказанных случаях было отмечено, что поскольку в непатологических условиях вирус Сендай не инфицирует клетки, богатые рецепторами, такие как HER2, UPAR и др., таргетинг нового рецептора позволяет перенаправить вирусные частицы на альтернативный рецептор с высоким уровнем экспрессии на поверхности опухолевой клетки.
Другим важным направлением в модификации вирусного генома является клонирование опухолеспецифического промотора в его состав [8]. Нежелательная токсичность, вызванная недостаточной аттенуацией вирусной частицы, существенно снижает эффективность применения генно-инженерных вакцин как in vitrо, так и in vivо [55, 82]. При этом направленная доставка терапевтических генов в опухолевые клетки является необходимым условием преодоления нежелательной токсичности. Экспрессия терапевтических или вирусных генов под контролем ткане- или опухолеспецифического промотора снижает их токсичность для здоровых клеток при вирусной инфекции, а также повышает таргетинг вирусных генов в перерождающихся клетках и тканях [83]. Некоторые геномы вирусов, как например, геном аденовируса человека и животных, кодируют белки, отвечающие за аккумуляцию клеток в «S»-фазе клеточного цикла, и предотвращают возникновение апоптоза, как механизма антивирусной защиты. Клонирование промотора в состав аденовирусного генома, и управляющего транскрипцией ранних генов, позволяет существенно увеличить вирусную цитотоксичность. Прототипом для промотора являются гены, обеспечивающие высокий уровень транскрипции в клетках-мишенях и снижение или отсутствие таковой в клетках здоровой ткани. Для специфической экспрессии терапевтических генов в клетки опухолей головного мозга применяют следующие промоторы генов: сурвивин [83, 84], теломераза (Telomerase) [85, 86], тирозиназа (Tyrosinasе) [87], мидкайн (MK) [88], нестин (Nestin) [89], мусаши (Musashi) [90] и CXCR4 [57, 91].
Первичные линии клеток пациентов с диагнозом «глиобластома»
Теоретически аденовирусная частица содержит в себе порядка 87% белка и 13% ДНК. Концентрация вирионов измеряется спектрофотометрически при длине волны 260 нм в присутствии 0.1% раствора SDS, разделяющего белки и ДНК. В кювету спектрофотометра загружается 500 микролитров 0.1% SDS и снимаются показатели негативного контроля при 260 и 320 нм. Затем измеряются десятичные разведения вируса в объеме 500 микролитров, приготовленном на 0.1% растворе SDS последовательно при оптических плотностях 260 и 320 нм. При этом оптическая плотность раствора аденовируса должна находиться в пределах 0.1-1.0 оптических единиц. Концентрацию вирусных частиц определяли как среднее значение между двумя повторами по формуле: (оп (260)- оп (320) Х разведение Х 1.1X10(12) вирусных частиц, где оп – оптическая плотность при длине волны 260 и 320 нм. 2.5.2. Бляшкообразование
Титрование рекомбинантных аденовекторов было произведено с использованием метода, описанного раннее [20, 298] и модифицированного нами. Клетки глиобластомы человека были выращены в 48-луночном планшете в концентрации 50 000 клеток на лунку. На следующий день клетки были инфицированы аденовирусами в дозе 10 инфекционных доз на клетку. Спустя двадцать четыре часа, клетки были трипсинизированы, промыты PBS и ресуспендированы в 100 мкл бессывороточной среды. После трехкратного размораживания или оттаивания клеточный лизат был центрифугирован, и 20 мкл было добавлено к 180 мкл бессывороточной среды, находящейся в каждой лунке (разведение минус 1). Вдальнейшем, серийные разведения шагом 1/10 и объемом 20 мкл были доведены до разведения минус 12 включительно. В течение 10 дней вирус инфицировал монослой НЕК293 и вирусный титр был определен на основе количества бляшек в соответствующем разведении, умноженном на 0.02 (Quantum Biotechnology, Карлсбад, Калифорния, США).
Способности рекомбинантного вируса выделять вирионы были проанализированы, с использованием набора «Adeno-XTM Rapid Titer» (#pt3651-2, Clontech, США). Клетки линии НЕК293 были выращены в 24-луночных планшетах в концентрации 25,000 клеток на лунку. Серийные разведения рекомбинантного вируса, полученного после разрушения клеточных лизатов, были использованы для получения разведений, начиная с 10(-2). Пятьдесять микролитров вирусной суспензии были добавлены к каждой лунке, содержащей клетки для последующей инкубации в течение 48 часов. В назначенное время клетки были зафиксированы 100% метанолом, промыты PBS, после чего 1:1000 разведение первичных мышиных антител, узнающих гексон аденовируса серотипа 5, было добавлено в составе PBS. После 1-часовой инкубации клеток с антителами против гексона при температуре 37С монослой клеток был трехкратно промыт и вновь проинкубирован с вторичными пероксидаза-конъюгированными антителами, выращенными в крысе (разведение 1:500, приготовлено на PBS, содержащем 1% БСА). После одного часа инкубации клетки были промыты PBS и субстрат DAB был добавлен в разведении 1:10 к каждой лунке. Десять минут спустя DAB был заменен на PBS, после чего число коричневых позитивных клеток было подсчитано в монослое при увеличении микроскопа по формуле, предложенной компанией-производителем.
Зависимость выживаемости пациентов с опухолями головного мозга различной степени злокачественности от уровня экспрессии сурвивина, MMP14, CD46, САR, и DSG2 была изучена, с использованием баз данных TCGA (Геномный проект по исследованию опухолей, США, cancergenome.nih.gov), Oncomine (Университет штата Мичиган, США) и Rembrandt (Repository of Molecular Brain Neoplasia Data, Национальный Институт Рака, США, http://rembrandt.nci.nih.gov).
Клеточный монослой был промыт PBS, и трипсинизированные клетки были ресуспендированы в PBS, содержащем 1% бычью сыворотку и 0,1% азида натрия, в концентрации 1х10(5) клеток на мл. Одинаковое количество клеток было проинкубировано с 1 мкг/мл антител, узнающих: рецептор CAR (клон RmcB, любезно предоставленный д-р. Joanne Douglas (Центр Генной Терапии, Университет Алабамы в г. Бирмингем, США), CD46 (ab175096, Abcam, Cambridge, MA, США), Syndecan1/CD138 (NB100-64980, Novus Bio), Perlecan (NB600-583, Novus Bio), intregrin b3(MAB1920, Chemicon-Millipore, Billerica, MA, США), b5(AB1926, Chemicon-Millipore, Billerica, MA, США), av(MAB1876, Chemicon-Millipore, Billerica, MA, США), DSG2 (#5180, Epitomics-Abcam) человека или изотопический контроль (Santa Cruz Biotechnology). Инкубация проводилась в течение 1 часа при температуре +4С Затем не связавшиеся антитела были отмыты путем трехкратного промывания клеток PBS. Далее, к клеткам был добавлен 1 мкг/мл вторичных антител, конъюгированных с FITC (антимышиный конъюгат, #554001, BD Bioscience- Pharmingen, Сан-Диего, США) или ALEXA 586 в PBS, содержащий 1% БСА. Спустя один час клетки были промыты излишним количеством PBS и проанализированы в проточной цитофлуориметрии, с использованием оборудования FACsARIA II (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, США). Процент клеток, экспрессирующих поверхностные рецепторы, был найден путем определения популяции клеток, не содержащих таргетный белок (негативный контроль) против популяции клеток, расположенных вне этой области. Соответствующее среднее значение интенсивности флуоресценции (mean to mean ratio) было определено для каждого образца против соответствующего негативного контроля. Для определения FITC- негативной популяции клеток в каждом образце клетки были проинкубированы с PBS, содержащим 1% бычьей сыворотки и только вторичными антителами.
Роль белка фибера аденовируса в вирусной репликации, транскрипции и сборке вирусных вирионов
Активности короткого и длинного промотора гена сурвивина в обеспечении специфичности и токсичности онколитического вектора. А) Микрофотографии клеточной линии U87, выросшей подкожно и получившей внутриопухолевую инъекцию вектора CRAdWT-S-L-RGD или CRAdWT-S-S-RGD в дозе 100 инфекционных единиц на клетку. p 0.05, тест Манна-Уитни; Б и В) Сравнительная токсичность онколитических вирусов, имеющих 345 (короткий вариант) и 1200 (длинный вариант) пар нуклеотидов промотора гена сурвивина человека. 100, 10 и 1 инфекционных частиц были использованы для инфекции клеток глиобластомы человека U87, U251, A172 и #10. Через 10 дней после инфекции дефектным по репликации (E1def), S-L (длинная версия промотора гена сурвивина человека), S-S (короткая версия) и CRAdWT-RGD онколитическими вирусами клетки окрашены по методике, описанной в Материалах и методах; Б) Сравнительный анализ пролиферации самореплицирующихся вирусов CRAd-S-S-RGD и CRAd-S-L-RGD проведен с использованием метода встраивания тимидиновой метки в активно пролиферирующиеся клетки [343]. Реакция проведена через 3 дня после инфекции. Результаты проверены в 10 повторах, среднее значение ± стандартное отклонение использованы для построения диаграммы. Ось ординат – уровень тимидина, встроенного в клетки. Ось абсцисс – онколитические вирусы. Разница между CRAd-S-S-RGD и CRAd-S-L-RGD и p 0.05 (Тест Манна-Уитни) для ГБМ1 и ГБМ2; В) Определение вирусной токсичности тестом с кристаллвиолетом на 10 день после инфекции клеток вирусами в различной концентрации.
Как представлено на Рис. 20 часть А (слева), внутриопухолевая инъекция онколитического вируса, содержащего промотор S-S, вызвала существенное снижение роста покожной модели глиобластомы человека U87 (справа, p 0.05). Сходные с этим различия в нарушении клеточной пролиферации мы наблюдали при инфекции первичных линий клеток глиобластомы ГБМ1 и ГБМ2 (Рис. 20 часть Б). По встраиванию тимидиновой метки в активно пролиферирующие клетки опухоли, нами было отмечено, что вектор S-S ингибировал рост этих клеток на 30-40% больше, чем онколитический вирус с длинной версией промотора (Рис. 20 часть В). Далее полученные рекомбинантные вирусы были протестированы на перевиваемых клетках глиобластомы. По окрашиванию кристаллвиолетом клеток, инфицированных аденовирусами, векторы S-S и S-L показывали сходную онколитическую активность в дозе 100 (U87 и U118) и 10 (A172) ИЕ/клетку. В то же время мы детектировали существенное (10x- кратное) увеличение цитотоксической активности для вектора S-S в клетках глиомы человека линий #10 и U251 по отношению к вирусу с более длинным вариантом промотора сурвивина. Таким образом, можно предположить, что клонирование короткого варианта промотора гена сурвивина может увеличить активность 5/3-модифицированного вектора в клетках глиобластомы, особенно резистентных к терапии темодалом и ионизирующей радиацией.
Для оценки способности промотора гена сурвивина контролировать экспрессию генов, в частности ген люциферазы, мы клонировали короткую версию промотора гена сурвивина человека в состав генома, дефектного по репликации аденовируса (Рис. 21А). Оказалось, что из трех тестируемых промоторов в клетках глиомы человека наиболее активен промотор гена сурвивина, но при этом его активность была ниже, чем у главного позднего промотора цитомегаловируса человека (CMV) (Рис. 21 части Б и В). Интересно, что этот промотор не является опухолеспецифичным по отношению к глиобластоме, но обеспечивает высокий уровень трансдукции многих клеточных линий [344-347]. По данным, представленным на Рис. 21В, промотор гена сурвивина обеспечивает высокий уровень трансдукции первичных клеток пациентов с диагнозом «мультиформная глиобластома» (10-800 раз больше активности главного позднего промотора CMV). Следовательно, среди трех рассмотренных промоторов именно промотор гена сурвивина продемонстрировал одинаково высокую активность экспрессии люциферазы, тем самым, предполагая, что его клонирование позволит увеличить специфичность, и активность онколитического вектора по отношению к глиобластоме человека. Так как клетки глиобластомы высоко экспрессируют CD46, мы предположили, что одновременный таргетинг CD46 и транскрипционный контроль над экспрессией вирусных белков области Е1А коротким вариантом промотора гена сурвивина человека приведет к высокой специфичности онколитического вектора.
На этом этапе, мы изучали возможность вектора CRAd-S-5/3, содержащего модификацию 5/3 в белке фибера (Рис. 22), демонстрировать принципиальные различия в вирусной токсичности и вирусной репликации в сравнении с рекомбинантными вирусами, имеющими дикий тип белка фибера, в дополнение к модификациям в С-концевом сегменте (CRAd-S-pK7), или петлях кноба (CRAd-S-RGD). В качестве контроля были использованы рекомбинантный CRAd-S-WT, содержащий дикий тип белка фибера, и промотор гена сурвивина человека.
Активность короткого минимального промотора гена сурвивина в составе дефектного по репликации аденовирусного вектора. А) Особенности строения 5 конца области Е1 рекомбинантных аденовирусов. Промоторы генов сурвивина, СXCR4 и MK были клонированы в С-концевую часть для обеспечения транскрипционного контроля экспрессии гена люциферазы в процессе инфекции; Б) и В) Эффективность экспрессии люциферазы под контролем промотора гена сурвивина, CXCR4 или MK. 100 инфекционных частиц каждого вектора использовали для инфекции одинакового количества клеток, и спустя 48 часов после инфекции, определяли уровень люциферазной активности в каждом образце по методике, описанной в Материалах и методах. Среднее значение ± стандартное отклонение было использовано для построения диаграммы. Результаты теста были нормализованы к активности промотора цитомегаловируса человека (CMV). Ось ординат – активность аденовируса с сурвивиновым промотором в процентах от активности аденовируса с CMV-промотором. Ось абсцисс – исследованные клеточные линии.
Структура рекомбинантных самореплицирующихся векторов, имеющих промотор гена сурвивина для контроля экспрессии продуктов транскрипции аденовируса. Чувствительный к радиации транскрипционный участок промотора гена сурвивина (S-S) человека управляет экспрессией ранних генов области Е1А. Кноб-участки белка фибера аденовируса человека 5 серотипа содержащие полилизиновые (ККККККК), RGD повторы, а также кноб-домена серотипа 3 были амплифицированы и клонированы методом гомологичной рекомбинации в ДНК рекомбинантного вируса путем замены соответствующего участка белка фибера серотипа 5. Полученные векторы получили название CRAd-S-pK7, CRAd-S-RGD, CRAd-S-5/3. ITR – инвертированные терминальные повторы, Pa – сигнал полиаденилирования.
Использование CRAd-S-5/3 в качестве платформы для доставки генетического материала в клетки глиобластомы, резистентные для темозоломида и ионизирующей радиотерапии
Основной проблемой при создании эффективного лекарства против глиобластомы человека является агрессивная природа мультиформной глиобластомы, за счет неконтролируемой пролиферации клеток. Текущие «золотые стандарты» в лечении глиобластомы являются эффективными в краткосрочной перспективе, но до полного выздоровления пациентов не происходит. На молекулярном уровне ингибирование клеточной пролиферации сопровождается активацией клеточной выживаемости аутофагией [286, 441, 442] или усилением ангиогенеза [443-445], тем самым опухоль находит возможности «убежать от терапии». Таким образом, существующие методы лечения способны продлить жизнь пациентов с глиобластомой, но не полностью удалить опухоль из организма [446-449]. В связи с этим лекарство будущего должно не только эффективно ингибировать рост глиобластомы, но и разрушать неопластические клетки головного мозга, тем самым повышая эффективность существующих монотерапий.
Специфичность и эффективность репликации в клетках глиом без повреждения здоровых клеток головного мозга привлекает внимание к CRAd как потенциальному терапевтическому противоопухолевому агенту. Однако применение немодифицированного CRAd не всегда оказывает желательный эффект. Гетерогенность глиобластомы и длинный репликативный цикл аденовируса от начала инфекции до момента выделения вирусных частиц могут быть главными проблемами, ограничивающими применение онколитического вектора в нейроонкологии. Таким образом, повышение эффективности трансдукции клеток-мишеней аденовирусным вектором, путем узнавания рецептора, локализованного на поверхности глиобластомы различного происхождения, является одной из задач вирусной генной терапии. С другой стороны, присутствие в опухоли клеток с разными сигнальными путями, регулирующими поведение клеток, и их резистентность к терапии, заставляет искать эффективный подход для экспериментальной инфекции агрессивных неопластических клеток.
Направленная инфекция клеток глиобластомы аденовирусным вектором зависит от присутствия целого ряда условий, одно из которых – наличие первичного рецептора на поверхности клеток-мишеней. В результате проведенных исследований мы обнаружили, что клетки глиобластомы экспрессируют первичный рецептор CAR для аденовируса человека типа 5, но его уровень варьируется в зависимости от линии опухолевых клеток. Как оказалось, что первичные линии клеток экспрессируют меньше CAR, чем перевиваемые линии глиобластомы человека. Эти данные нашли подтверждение в работе Fuxe с соавт., которые показали, что первичные клетки менее чувствительны к инфекции аденовирусом типа 5 по причине сниженной экспрессии первичного рецептора CAR [157]. Другие исследования, проведенные Houri с соавт. показали, что клетки со сниженной экспрессией CAR являются более инвазивными, что связано с активностью фермента шеддазы (sheddase), удаляющего CAR с поверхности первичных клеток [450] протеолизом. Эти данные косвенно подтверждают наши результаты и свидетельствуют о том, что эффективная инфекция глиобластомы аденовирусным вектором должна использовать альтернативный рецептор.
На сегодняшний день работы в области создания самореплицирующегося вектора ведутся в нескольких направлениях. Первое- это использование генетических механизмов опухолевой прогрессии для создания вирусного вектора, активного в большинстве глиом за счет повышения активности специфичных клеточных сигнальных путей. В этом случае происходит инфекция и здоровых клеток, но вирусная токсичность подавляется на стадии транскрипции. Яркими представителями этого являются аденовирусные вектора ONYX015 и 24. Вторым вариантом является использование промотора и/или клонирование модификации в белок фибера, что позволяет не только перенацелить вирусную частицу на альтернативный рецептор, но и обеспечить высокую селективность продукции 179 вирусных генов в опухолевых клетках. К этой группе принадлежит большинство известных векторов, используемых в онкологии. Исходя из анализа иммунного ответа, возникающего при вирусной репликации векторов [216], наиболее предпочтительным является использование транскрипционных и трансдукционных модификаций [220]. Так, по данным литературы, внутримозговая-внутриопухолевая инъекция CRAd-S-pK7 вызывает меньшую продукцию гамма-интерферона и сниженную продукцию вируснейтрализующих антител. Соответственно, последняя стратегия выглядит привлекательнее с точки зрения подавления иммунного ответа
Для создания вирусного самореплицирующегося вектора необходимо использовать системы клонирования рецептор-связывающего участка в состав белка фибера, а также клонирования промоторной области гена, чей транскрипт активен преимущественно в опухолевых клетках. Такие системы уже давно созданы пионерами в области генной терапии: Von Seggren со соавт. [313], Dmitriev с соавт. и Kransykh с соавт. [312, 451-453]. Одним из преимуществ использования вышеназванных систем является применение пакующей линии клеток на основе HEK293, экспрессирующей белок гена фибера аденовируса человека 5 серотипа, и тем самым увеличивающей интенсивность вирусной амплификации. Несмотря на широкое применение таких компетентных клеток, оставалось непонятным, как белок фибер влияет на вирусный цикл. Чтобы ответить на этот вопрос, мы создали компетентные клетки, экспрессирующие дикий или мутантные формы белка фибера серотипа 5. Эти белки имели отличную от дикого белка фибера клеточную локализацию вследствие делеции сигнала ядерного транспорта или сигнала упаковки в капсомер. На снимках, полученных при помощи иммунофлуоресценции, видно, что в то время, как белок фибера с делетированным сигналом ядерного транспорта локализуется в цитоплазме, фибер с делецией в сигнале упаковки в пентон находится и в цитоплазме, и ядре. Изменение в локализации имеет значение для вирусного цикла аденовируса, выращенного на клетках с мутантным или диким белком фибера. Оказалось, что выращивание вируса в клетках, содержащих дефектный по локализации белок фибера, сопровождается нарушением процесса упаковки вирусных частиц, выделения дочерних частиц. Это еще раз подчеркивает значимость экспрессии белка фибера в ядрах инфицированных клеток. Важность экспрессии белка фибера для наращивания дефектных по препликации рекомбинантных аденовирусов была отмечена в нескольких научных публикациях [292, 313, 454] наших коллег.