Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
Глава 2. Материала и методы 32
Глава 3. Результаты собственных исследований 46
Глава 4. Выживаемость больных раком яичника 94
Заключение 103
Выводы 114
Список литературы
- Обзор литературы
- Материала и методы
- Результаты собственных исследований
- Выживаемость больных раком яичника
Обзор литературы
Поздняя диагностика РЯ дает возможность ученым планировать новые исследования для понимания механизмов канцерогенеза. К настоящему времени имеется множество клинических и экспериментальных работ, посвященных этиопатогенезу РЯ, одним из ключевых моментов которого является взаимодействие опухолевой ткани с экстрацеллюлярным матриксом (ЭЦМ) .
Значительную часть объема тканей занимает ЭЦМ, который является структурной основной для поддержания жизнеспособности и функционирования клеток через клеточно-межклеточные взаимодействия. Между эпителиальными и соединительными тканями матрикс образует базальную мембрану - тонкую, но жесткую подстилку, играющую важную роль в контролировании клеточного поведения [10; 53; 91].
В настоящее время проводится определение молекулярно биологических тканевых маркеров в опухоли, регулирующих апоптоз, неоангиогенез, пролиферативную активность, компоненты ЭЦМ.
Среди большой группы потенциальных молекулярных прогностических факторов развития и прогрессирования злокачественных опухолей особое место занимает система матриксных металлопротеиназ (ММП), которая состоит, как минимум, из 25 цинк-зависимых эндопептидаз. Название этого семейства говорит само за себя и имеет описательный характер (например, интерстициальная коллагеназа ферментирует коллаген в интерстиции) и порядковый номер. Цифровая номенклатура точно не отражает истинное число белков этого семейства, потому что ММП-4, ММП-5 и ММП-6 были исключены вследствие их дублирования [111].
Белки семейства ММП участвуют в регуляции ЭЦМ при нормальных физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие, репродукция, ремоделирование тканей, а также при патологических состояниях, включая рост и распространение злокачественной опухоли. ММП способны разрушать компоненты межклеточного пространства, включая базальную мембрану, являющуюся специализированной матрицей, состоящей из коллагена IV типа, ламинина, энтактина, протеогликанов и глюкозаминогликанов. Такая мембрана служит барьером между различными тканями. Особенностью инвазивных опухолей является способность нарушать целостность этой мембраны [61].
Еще в начале 80-х годов прошлого столетия L. Liotta и соавт. отметили роль ММП при канцерогенезе, когда они определили место протеолизу, как одному из трех путей развития опухолевой инвазии, и выяснили, что коллагеназа IV типа участвует в процессе инвазии и метастазирования меланомы [88]. В последующем методом гибридизации in situ установлено, что экспрессия ММП в стромальных клетках явление гораздо более распространенное, чем экспрессия в атипичных клетках [77]. Много ММП экспрессируется в клетках соединительной ткани, таких как фибробласты и клетки воспаления. Но есть и исключения из правил. Например, матрилизин экспрессируется в эпителиальном компоненте аденокарцином [111].
Современные технологии способны определить уровни экспрессии отдельных ММП при различных злокачественных новообразованиях. Применяются такие методы как иммуногистохимия, зимография in situ, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, иммуноферментный метод, мультиплексный анализ [70; 139]. Активность ММП регулируется на различных уровнях и зависит от онкогенов, факторов роста, цитокинов и гормонов. Большинство ММП секретируется на поверхности мембран клетки в неактивной форме, как проферменты (зимогены). Их активация требует протеолитического воздействия для освобождения каталитически активного фермента. Этот процесс может быть достигнут при помощи ММП (например, стромелизин-1 может активировать проколлагеназу) и других протеаз (например, активация простромелизина под действием плазмина). Блокирование ферментативной активности – другой механизм регулирования. Так происходит при взаимодействии с физиологическими ингибиторами ММП: циркулирующим общим ингибитором протеаз, альфа-2-макроглобулином, или тканевым ингибитором металлопротеиназ (ТИМП). Такой комплекс ММП с ингибитором не способен связываться с белками межклеточного пространства [79].
Предполагается, что ММП вследствие своей способности разрушать компоненты ЭЦМ могут быть изначально вовлечены в процессы инвазии и метастазирования опухоли [105]. Среди различных механизмов инвазии можно отметить увеличенное давление опухоли на здоровые ткани, повышенную клеточную подвижность, ослабление межклеточных контактов и действие литических ферментов, приводящее к деградации компонентов ЭЦМ. Высказывается мнение, что несовершенство взаимодействия опухолевых клеток способствует их подвижности и, следовательно, благоприятствует процессам инвазии и метастазирования, являющимися одними из главных механизмов диссеминации опухоли [48; 49].
Имеются сведения о прямой корреляции между уровнем ММП и распространенностью опухолевого процесса. При злокачественных новообразованиях может быть определен более широкий спектр ММП, чем при доброкачественных [111]. Например, при раке толстой кишки экспрессируется матрилизин, стромелизин-1, стромелизин-3, желатиназа А и интерстициальная коллагеназа, а при доброкачественных полипах толстой кишки обнаруживается только матрилизин [65; 147]. Таким образом, с ростом агрессивности опухоли увеличиваются не только уровни отдельных ММП, но и появляются новые представители этой группы.
Материала и методы
Автор лично принимал участие в выполнении оперативного вмешательства у больных новообразованиями яичника, включенных в исследование.
Только хирургическое лечение проведено всем 14 больным ДОЯ, 6 (85,7%) больным ПОЯ и только 3 (6,8%) больным РЯ. Комбинированное лечение (операция и послеоперационная химиотерапия) проведено одной больной ПОЯ и 40 (90,9%) больным РЯ. Только лекарственное лечение получила одна больная РЯ.
Лапароскопический доступ использован у 4 (28,6%) больных ДОЯ, и только у 2 больных, страдающих РЯ (таблица 6).
При ДОЯ одностороннее удаление придатков матки выполнено у 4 (28,6%) больных, и по 3 операции (21,4%) в объеме удаления придатков матки и экстирпации матки с придатками. Основным видом оперативного вмешательства у больных РЯ была экстирпация матки с придатками, удаление большого сальника — у 26 (59,1%) пациенток. Таблица 6 — Распределение больных опухолями яичника в зависимости от оперативного доступа.
Размер остаточной опухоли после операции был менее 2 см у одной больной ПОЯ, у 6 (85,7%) пациенток операция выполнена без остаточной опухоли. Полная циторедуктивная операция произведена у 22 (50%) пациентки РЯ, у 15 (34,1%) — размер остаточной опухоли составил менее 1 см, у 2 — менее 2 см и у 5 (11,4%) — более 5 см.
Интраоперационные осложнения были редкими — у 3 из 65 (4,6%): у одной больной ДОЯ — ранение толстой кишки и у двух больной РЯ — ранение мочевого пузыря,
Ранние послеоперационные осложнения обнаружены у 6 (9,2%) пациенток, из них по одной больной ПОЯ и РЯ — серома передней брюшной стенки, у 4 больных РЯ (9,1%) — тромбоз глубоких вен нижних конечностей.
Послеоперационное лекарственное лечение использовано у 39 (88,6%) больных РЯ, которое чаще назначали в виде комбинации химиотерапевтических препаратов: у 28 из них применяли сочетание Паклитаксела и Карбоплатина, реже — Доцетаксел и Карбоплатин, Иринотекан и Цисплатин и другие схемы. Количество курсов колебалось от 2 до 8 с медианой 6 курсов. 2.4. Биохимические исследования.
Содержание ММП-7, ИФР-I, ИФР-II и VEGF определяли в ткани опухолей яичника и сыворотке крови больных новообразованиями яичника (таблица 7), а также у 84 практически здоровых женщин, которые составили группу контроля. Забор биологического материала у больных новообразованиями яичника выполнялся во всех случаях лично автором. Таблица 7 — Количество больных новообразованиями яичника, которым определено содержание исследуемых белков. Исследуемый показатель Количество больных Сыворотка крови Ткань опухоли
Исследование белков в сыворотке крови производилось дважды: до операции и через 1-2 недели после операции. Забор сыворотки осуществлялся по стандартной методике. Сыворотку крови разливали по 300-400 мкл в 3-4 пластиковые пробирки и хранили при -70С до проведения анализа.
Кусочки тканей новообразований яичника, полученных во время операции, доставляли на льду по 200-500 мг в лабораторию и хранили при -70С до начала обработки. Перед гомогенизацией ткань тщательно очищали от участков жира и некроза, взвешивали, а затем измельчали ножницами и растирали в жидком азоте.
Для проведения иммуноферментного анализа гомогенаты лизировали в соотношении 1:3 в буфере следующего состава: 20 мМ Трис-НСl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1% Тритон X-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ -глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мкг/мл леупептина. Полученные лизаты центрифугировали в течение 30 мин со скоростью 20000 об/мин, 4С (центрифуга Optima TLX, Beckman, США). Надосадочную жидкость (ядерно-цитоплазматический экстракт) разделяли на аликвоты по 300 - 400 мкл и хранили при -70С до проведения иммуноферментного анализа.
Определение проводили с помощью стандартных наборов для прямого иммуноферментного анализа (таблица 8) в соответствии с инструкциями производителей.
Измерения проводили на автоматическом анализаторе для микропланшет BEP 2000 при 450 нм с коррекцией при 540 нм, используя двух - и четырехпараметрические методы построения кривых для обработки данных. Концентрацию исследованных показателей в тканях выражали в расчете на 1 мг общего белка, определенного по методу Лоури. 2.5. Статистический анализ
Выбор статистических оценок содержания биохимических показателей, определенных в сыворотке крови и ткани опухоли, осуществляли после сравнения их распределением по методу Колмогорова-Смирнова с распределением Гаусса. В большинстве случаев распределение исследованных показателей достоверно отличалось от нормального и применяли непараметрические методы сравнения несвязанных признаков (Kruskal-Wallis Anova & Median test при количестве сравниваемых групп более двух и Mann-Whitney при сопоставлении двух групп). Различия считали значимыми при р 0,05.
При анализе взаимосвязей между различными показателями применяли тест корреляции рангов Спирмена, указывали коэффициент корреляции (rs) и его достоверность.
При сравнении частот строили таблицы сопряженности признаков. Для расчета р использовали точный критерий Фишера (при небольших объемах групп) и непараметрический критерий у\-2..
Для определения диагностических характеристик показателей рассчитывали кривые ROC и 95% доверительные интервалы содержания маркеров в группах.
Выживаемость рассчитывали точным методом Kaplan-Meier, сравнения кривых осуществляли методом Log-Rank.
Все вычисления проводили на персональном компьютере с помощью математических пакетов «Statistica 7.0» (StatSoft Inc) и SPSS. Ряд таблиц, диаграмм и графических рисунков выполнены в программе Microsoft Office Word 2007 и Microsoft Office Excel 2007.
Результаты собственных исследований
Противоречивые данные получены при анализе содержания ИФР-I в сыворотке крови в зависимости от объема асцита. Так, в группе больных с объемом асцита более 500 мл медиана ИФР-I превышала таковую в группе больных без асцита (187 и 142 нг/мл, соответственно), наименьшие уровни ИФР-I зарегистрированы при объеме асцита менее 500мл (медиана 97,1 нг/мл). Значения ИФР-I также были выше у 5 больных с метастазами в лимфатических узлах, чем у пациенток без таковых (медианы 140 и 109 нг/мл, соответственно). Выявлено достоверное снижение уровней ИФР-I сыворотки крови при Са-125 более 100 Ед/мл (р=0,005) и при значениях НЕ-4 более 150 Ед/мл (р=0,04; рисунок 22).
Таким образом, при анализе содержания ИФР-I в сыворотке крови и ткани опухоли больных новообразованиями яичника, отметим, что: 1. Установлена отчетливая тенденция (р=0,053) к меньшим значениям сывороточного ИФР-I у больных РЯ (медиана 114 нг/мл) по сравнению с контролем (медиана 144 нг/мл) и меньшая по сравнению с больными ДОЯ и ПОЯ (медианы 144 и 150 нг/мл, соответственно). 2. Нижний 95% ДИ сывороточного ИФР-I в контроле составил 87 нг/мл. Частота значений ИФР-I ниже порогового уровня составила 7,1% у больных ДОЯ, 20% у больных ПОЯ и 26,5% у больных РЯ. 3. Содержание ИФР-I в ткани опухоли больных РЯ было достоверно ниже, чем у больных ДОЯ (медианы 0,9 и 4,5 нг/мг белка). Медиана показателя ИФР-I в ткани больных ПОЯ составила 6,5 нг/мг белка. 4. Уровень ИФР-I в сыворотке крови больных РЯ был значимо ниже в группе больных с наличием жалоб и сопутствующих заболеваний (медианы 96,5 и 100 нг/мл, соответственно), и недостоверно ниже у пациенток в менопаузе и при наличии сопутствующих заболеваний (медианы 103 и 106 нг/мл, соответственно). 5. Установлена тенденция к снижению уровней сывороточного ИФР-I при увеличении стадии заболевания при РЯ. Частота значений показателя ниже порогового уровня при I-II стадиях составила 11,1%, при III-IV стадиях – 29%. 6. Установлена слабая тенденция к снижению уровней сывороточного ИФР-I при умеренной (медиана 100 нг/мл) и низкой (медиана 102 нг/мл) степени по сравнению с высокой (медиана 170 нг/мл) степенью дифференцировки опухоли. 7. Обнаружены меньшие значения сывороточного ИФР-I при серозном РЯ по сравнению с муцинозной аденокарциномой (медианы 109 и 195 нг/мл, соответственно). 8. Выявлены низкие значения ИФР-I в сыворотке крови двух больных РЯ с прорастанием опухолью петель тонкой кишки (99,1 и 101 нг/мл, соответственно). 9. При двустороннем поражении яичников, при размерах опухоли более 10 см, при опухолевой диссеминации по брюшине, при множественных метастазах в брюшной полости наблюдали меньшие значения содержания сывороточного ИФР-I. 10. Медиана сывороточного ИФР-I достоверно снижалась в 2 раза при значениях Са-125 от 100 и более Ед/л, медиана ИФР-I достоверно снижалась более чем в 2 раза при HE-4 более 150 Ед/л. 11. Связь уровней ИФР-I в ткани опухоли больных РЯ со стадией и другими факторами не установлена. 3.3. Содержание ИФР-II у больных опухолями яичника.
При определении содержания ИФР-II в сыворотке крови больных опухолями яичника не обнаружено статистически значимых различий во всех группах больных опухолями яичника, слабые различия выявлены у больных РЯ и группе контроля (таблица 25; рисунок 23). Пороговое значение маркера определить не удалось из-за совпадения распределений показателя у больных РЯ и в группе контроля. Таким образом, можно высказаться, что маркер не обладает выраженной диагностической ценностью. ДОЯ 1 798±357 292-1675 682 620-973 ПОЯ 2 653±285 244-960 638 498-940 РЯ 3 631±275 315-1780 610 460-770 Значения ИФР-II в сыворотке крови определены у 5 больных РЯ после операции (таблица 26; рисунок 24). Значения ИФР-II после лечения повысились у 3 (6о%) больных РЯ, у 2 снизились, то есть нами не обнаружено различий с исходными значениями ИФР-II (р=0,5), однако медиана увеличилась с 507 до 771 нг/мл. Содержание ИФР-II в сыворотке крови и ткани опухоли больных РЯ в зависимости от анамнестических и клинических особенностей.
При сопоставлении значений ИФР-II, определенных в сыворотке крови и ткани опухоли больных РЯ, с возрастом, наличием сопутствующих заболеваний, менструальным статусом связи не установлено (таблица 28). Отмечалась склонность к уменьшению значения сывороточного ИФР-II у пациенток с наличием жалоб.
Исследовав связь уровней ИФР-II в сыворотке крови и ткани опухоли со стадией РЯ, обнаружено наличие тенденции к снижению уровней сывороточного ИФР-II при увеличении стадии РЯ и отсутствие связи содержания ИФР-II в ткани опухоли (таблица 29; рисунок 25). Таблица 28 — Содержание ИФР-II в сыворотке крови и ткани опухоли больных РЯ с учетом некоторых характеристик.
Сыворотка крови N ИФР-ІІ, нг/мл р Медиана; квартили 7 759; 678-926 0,16 5 458; 442-597 11 623; 506-778 При изучении ИФР-II в сыворотке крови и ткани опухоли больных РЯ не было зарегистрировано связи с гистологическим вариантом опухоли (таблица 31).
Заметно более низкие уровни сывороточного ИФР-II обнаружены у больных с большими размерами опухоли, при множественных метастазах в брюшной полости, при обнаружении опухолевых клеток в смывах из брюшной полости (таблица 32), достоверно меньшие уровни показателя обнаружены при объемах асцитической жидкости более 500 мл (рисунок 26).
Выживаемость больных раком яичника
В значительной части исследований, освещенных в литературе, охватывается изучение либо сывороточных, либо только тканевых уровней представителей одного семейства опухолевых маркеров, не учитывая возможность их взаимного влияния. Хочется отметить, что определение уровней ММП-7, ИФР-I, ИФР-II и VEGF в более ранних работах выполнено полуколичественными иммуногистохимическими методами.
Для врача онколога-гинеколога является важным определение клинической значимости экспрессии указанных биохимических показателей при определении тактики лечения объемных новообразований яичника, что и послужило причиной для проведения нами исследования.
Настоящая работа посвящена определению прогностического значения экспрессии ММП-7, ИФР-I и ИФР-II, VEGF в опухолевой ткани и сыворотке крови у больных со злокачественными новообразованиями яичника. В нашем исследовании получены данные, позволяющие установить диагностическую и прогностическую роль изучаемых белков у больных раком яичника.
В исследование включено 65 больных эпителиальными новообразованиями яичника: 44 больных раком, 7 пациенток с пограничными и 14 с доброкачественными опухолями, — а также 84 практически здоровые женщины, которые составили группу контроля. Больные проходили обследование и лечение в ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина в период с марта 2013 по май 2015 года. Содержание всех исследуемых белков (ММП-7, ИФР-I и ИФР-II, VEGF) в сыворотке крови до операции было определено у 51 больной; в ткани опухоли яичника уровень ММП-7 и ИФР-II был определен у 38 больных, а содержание ИФР-I и VEGF исследовано у 42 и 40 больных, соответственно.
В результате проведенного исследования и осуществления статистического анализа полученных результатов последовательно решены поставленные в работе задачи исследования. Выполненный анализ сывороточных концентраций позволил установить, что уровни ММП-7 в сыворотке крови больных раком яичника достоверно выше, чем в группе контроля и у больных пограничными и доброкачественными опухолями яичника. Аналогичные выводы получены при анализе сывороточных уровней VEGF . Такие результаты согласуются с работами, в которых указывается потенциальная роль указанных белков в выявлении больных раком яичника [12; 19; 41; 64; 86; 160].
В настоящем исследовании установлена слабая тенденция к меньшим значениям ИФР-I и ИФР-II в сыворотке крови больных карциномой яичника по сравнению с группой контроля. Значимых различий содержания ИФР-I и ИФР-II между группами больных новообразованиями яичника не выявлено. Полученные нами данные не подтверждают высказываемого в литературе предположения, согласно которому исходные показатели ИФР-I выше у больных раком яичника [6]. Однако, наши результаты исследования дают основание высказаться в пользу предположения о том, что взаимосвязи между сывороточным уровнем ИФР и риском развития рака яичника нет. Такое заключение приводится рядом зарубежных авторов [71; 143].
Анализ взаимосвязи содержания маркеров в сыворотке крови больных злокачественными новообразованиями яичника с основными показателями распространенности опухоли показал, что уровни ММП-7 и VEGF недостоверно повышались при увеличении стадии рака яичника. При учете отдельных показателей распространенности опухолевого процесса выяснилось, что при двустороннем поражении яичников наблюдались высокие уровни ММП-7 и VEGF в сыворотке крови. При диссеминации по брюшине и больших объемах асцита зарегистрировано несколько большее содержание только ММП-7. Хочется отметить, что истинно высокие значения VEGF в сыворотке крови выявлены у двух больных карциномой яичника (медианы 1328 и 2599 пг/мл) с распространением опухолевого процесса на тонкую кишку. При изучении публикаций зарубежных авторов такой закономерности для ММП-7 выявлено не было [19; 160], тогда как уровень VEGF положительно коррелировал со стадией заболевания, большей распространенностью опухолевого процесса в брюшной полости и метастатическим поражением лимфатических узлов [41; 86]. Интересно, что по данным нашего исследования наибольшие уровни показателя ММП-7 (37,7 нг/мл) выявлены у больных I стадии рака яичника.
В тоже время, для ИФР-I и ИФР-II обнаружена противоположная закономерность — установлена тенденция к снижению сывороточных уровней ИФР-I и ИФР-II при увеличении стадии заболевания у больных злокачественными новообразованиями яичника. При размерах опухоли более 10 см, множественных метастазах в брюшной полости, при определении атипичных клеток в смывах из брюшной полости наблюдались несколько меньшие значения содержания сывороточного ИФР-I и ИФР-II. Однако по результатам проведенных ранее исследований авторы заявляют, что уровень ИФР-I положительно коррелирует с распространенностью опухолевого процесса [6].
Противоречивые данные нами получены при анализе содержания ИФР-I в сыворотке крови в зависимости от объема асцита: у больных с объемом асцита более 500 мл и без него медиана ИФР-I превышала таковую в группе больных с объемом асцита менее 500 мл. Достоверно большие значения ИФР-II были выявлены при меньших объемах асцита. Уровень ИФР-I также был выше у больных с метастазами в лимфатических узлах, чем у пациенток без таковых. Выявлены низкие значения ИФР-I в сыворотке крови двух больных раком яичника с прорастанием опухоли петель тонкой кишки (99,1 и 101 нг/мл, соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего детального изучения компонентов системы ИФР на большем количестве больных раком яичника.