Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Меланома кожи 12
1.2 Подходы к лечению меланомы кожи 14
1.2.1 Иммунотерапия метастатической меланомы анти-CTLA4 16
и анти-PD-1/PD-L1 моноклональными антителами 16
1.2.2 Таргетная химиотерапия метастатической меланомы BRAF/MEK ингибиторами 17
1.2.3 Комбинация киназных ингибиторов и иммунотерапии 24
1.3 Раково-тестикулярные антигены 25
1.3.1 Регуляция экспрессии раково-тестикулярных антигенов 29
1.3.2 Предполагаемые функции раково-тестикулярных антигенов 34
1.3.3. Терапевтический потенциал раково-тестикулярных антигенов 37
1.3.4 Прогностическая роль раково-тестикулярных антигенов 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42
2.1 Пациенты 42
2.2 Получение образцов опухоли 45
2.3 Гистологическое исследование 45
2.4 Цитологическое исследование 46
2.5 Оценка экспрессии раково-тестикулярных антигенов
2.5.1 Выделение РНК 47
2.5.2 Реакция обратной транскрипции 49
2.5.3 Полимеразная цепная реакция
2.5.3.1 Выбор генов 49
2.5.3.2 Разработка праймеров 52
2.5.3.3 Условия проведения полимеразной цепной реакции 53
2.5.3.4 Качественный и количественный анализ продуктов полимеразной цепной реакции 53
2.6 Математическая обработка данных 55
ГЛАВА 3. Результаты з
3.1 Клиническая характеристика пациентов 57
3.2 Анализ общей и безрецидивной выживаемости
3.2.1. Прогностическое значение толщины первичной опухоли 64
3.2.2. Прогностическое значение изъязвления первичной опухоли 67
3.2.3. Прогностическое значение стадии по классификации AJCC 2009 69
3.2.4. Прогностическое значение пола 71
3.2.5. Прогностическое значение возраста 72
3.3 Анализ экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов 75
3.3.1 Различия в экспрессии генов раково-тестикулярных антиенов в первичной и метастатической меланоме кожи 76
3.3.2 Гетерогенность экспрессии раково-тестикулярных антигенов 79
3.3.2.1. Гетерогенность первичной меланомы кожи 79
3.3.2.2 Гетерогенность метастатической меланомы кожи 84
3.3.2.3 Гетерогенность экспрессии раково-тестикулярных антигенов в первичной и метастатической меланоме у одного и того же пациента 95
3.4 Однофакторный анализ прогностического значения экспрессии раково тестикулярных антигенов при первичной и диссеминированной меланоме кожи 100
3.4.1 Оценка влияния экспрессии раково-тестикулярных антигенов в первичной меланоме кожи на общую выживаемость 100
3.4.1.1 Оценка влияния экспрессии раково-тестикулярных антигенов на количественном уровне в первичной меланоме кожи на общую выживаемость 109
3.4.1.2 Оценка влияния экспрессии раково-тестикулярных антигенов на качественном уровне в первичной меланоме кожи на общую выживаемость 116
3.4.2 Оценка влияния экспрессии раково-тестикулярных антигенов в первичной меланоме кожи на безрецидивную выживаемость 119
3.4.2.1 Оценка влияния экспрессии раково-тестикулярных антигенов на количественном уровне в первичной меланоме кожи на безрецидивную выживаемость 125
3.4.2.2 Оценка влияния экспрессии раково-тестикулярных антигенов на качественном уровне в первичной меланоме кожи на безрецидивную выживаемость 131
3.4.3 Оценка влияния экспрессии раково-тестикулярных антигенов в метастазах меланомы кожи на общую выживаемость 132
3.4.3.1 Оценка влияния минимального уровня экспрессии раково-тестикулярных антигенов в метастазах меланомы кожи на общую выживаемость 133
3.4.3.2 Оценка влияния максимального уровня экспрессии раково-тестикулярных антигенов в метастазах меланомы кожи на общую выживаемость. Количественный анализ 139
3.4.3.3 Оценка влияния максимального уровня экспрессии раково-тестикулярных антигенов в метастазах меланомы кожи на общую
выживаемость. Качественный анализ 144
3.5 Многофакторный анализ прогностического значения экспрессии раково-тестикулярных антигенов при первичной и диссеминированной меланоме кожи 146
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 148
Выводы 162
Список сокращений 164
Список литературы 168
- Таргетная химиотерапия метастатической меланомы BRAF/MEK ингибиторами
- Оценка экспрессии раково-тестикулярных антигенов
- Прогностическое значение толщины первичной опухоли
- Оценка влияния максимального уровня экспрессии раково-тестикулярных антигенов в метастазах меланомы кожи на общую выживаемость. Количественный анализ
Введение к работе
Актуальность темы и степень ее разработанности
Меланома кожи (МК) – злокачественная опухоль нейроэктодермального
происхождения, формирующаяся из пигментобразующих клеток - меланоцитов. Заболеваемость меланомой кожи неуклонно растет, и не смотря на появление новых методов системного лечения, меланома кожи по-прежнему остаётся смертельным и неизлечимым заболеванием, с самым высоким метастатическим потенциалом среди всех опухолей человека. Прогнозирование течения заболевания определяет тактику выбора адъювантных методов лечения и позволяет понять характер метастазирования. Помимо существующих факторов прогноза, главными из которых являются глубина инвазии первичной опухоли, наличие изъязвления и вовлечение в опухолевый процесс регионарных лимфоузлов, интенсивно изучаются новые прогностические маркеры. В качестве кандидатов на такие маркеры выступают раково-тестикулярные антигены (РТА).
Данная группа антигенов была открыта в начале 90-х годов XX века благодаря
бурному развитию онкоиммунологии, основным постулатом которой стало утверждение об
иммуногенности опухолей [P. Bruggen Van Der 1991]. Помимо строго специфичных
опухолево-ассоциированных антигенов идентифицирована группа относительно
универсальных антигенов, встречающихся на различных типах опухолей. К таким антигенам и относится целое семейство раково-тестикулярных антигенов (РТА), экспрессию которых наблюдают на большинстве злокачественных новообразований. В настоящее время известно более 140 различных РТА, объединенных более чем в 70 семейств [L.G. Almeida 2009]. В норме РТА встречаются только в герминогенных тканях, надежно защищенных от иммунной системы гемато-тестикулярным барьером (РТА экспрессированы и на некоторых нормальных, негерминогенных тканях, однако на очень низком уровне, недостаточном для формирования иммунологического ответа). Появление РТА вне герминогенной зоны может привести к формированию против них иммунного ответа.
Роль РТА как маркеров клинического течения опухолей различной локализации интенсивно изучают в последнее время. В данном разделе онкоиммунологии можно выделить несколько направлений. Во-первых, изучение динамики экспрессии РТА в процессе опухолевого роста, возможно, позволит прояснить механизмы канцерогенеза и формирования естественного противоопухолевого иммунного ответа, а также причины неэффективности последнего. Во-вторых, определение динамики экспрессии РТА может предоставить прогностическую информацию о течении заболевания. По мнению ряда авторов экспрессия РТА на опухоли коррелирует с прогрессированием различных онкологических заболеваний [M. Condomines 2007, A.O. Gure 2005, D. Perez 2008] в том
числе при меланоме кожи [J.S. Goydos 2001, M.L. Prasad 2004, E.F. Velazquez 2007]. Оценка экспрессии РТА при меланоме кожи может способствовать оптимизации тактики лечения, а изучение динамики экспрессии РТА в первичной, рецидивирующей и метастатической МК позволит понять механизмы гетерогенности этой опухоли.
Цель исследования
Определение прогностического значения экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов при первичной и диссеминированной меланоме коже.
Задачи исследования
-
Определить профиль экспрессии 12 ампликонов генов раково-тестикулярных антигенов в образцах первичной и метастатической меланомы кожи.
-
Сравнить профили экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов в образцах первичной и метастатической меланомы кожи.
-
Определить гетерогенность экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов внутри первичной меланомы кожи, среди разных метастазов одного пациента, между первичной меланомой кожи и метастазами меланомы кожи у одного и того же пациента.
-
Определить прогностическое значение (влияние на общую и безрецидивную выживаемость) экспрессии раково-тестикулярных антигенов в образцах первичной меланомы кожи.
-
Определить прогностическое значение (влияние на общую выживаемость) экспрессии раково-тестикулярных антигенов в образцах метастазов меланомы кожи.
Научная новизна
Впервые у пациентов с первичной и метастатической МК методом обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) исследован профиль экспрессии 12 ампликонов РТА. Впервые изучена гетерогенность экспрессии 12 ампликонов РТА в образцах первичной и метастатической МК. У 17 пациентов профиль экспрессии РТА проанализирован как в первичной МК, так и в её метастазах, прослежена динамика его изменения. Впервые проведён анализ прогностического значения экспрессии 12 ампликонов РТА в образцах первичной и метастатической МК.
Теоретическая и практическая значимость
Данные, полученные в настоящем исследовании, позволят оценить прогностическое значение определения экспрессии РТА при меланоме кожи. На основании определения
профиля экспрессии данных антигенов возможно планирование индивидуальных программ иммунотерапии больных меланомой кожи.
Методология и методы исследования
C помощью ОТ-ПЦР в 132 образцах первичной и метастатической МК, полученных от 81 пациента, проанализирована экспрессия 12 ампликонов РТА (MG-A3, BAGE, CTAG1B, GAGE-1-8, GAGE 4-7, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA4, MAGEB1, MAGEC1, MG_A12-236, MG-A2) и 4 контрольных генов (GAPDH, S100B, TYR, MLANA). С помощью описательной статистики в программе Microsoft Excel проанализированы все непрерывные числовые данные. С помощью программы IBM SPSS 24. проведена оценка корреляции между экспрессией 12 ампликонов РТА и общей и безрецидивной выживаемостью пациентов с МК. Достоверность различий оценивали при помощи критериев Хи-квадрат и Вилкоксона. При однофакторном анализе влияния экспрессии генов РТА на общую и безрецидивную выживаемость для определения порогового значения уровня экспрессии каждого из изучаемых генов РТА, при котором в выборке исследуемых пациентов сформировались бы две группы с максимальным отношением рисков (ОР) при обязательном условии соблюдения статистической достоверности (значение p), была разработана и решена классическая двойная задача параметрической оптимизации с двумя целевыми функциями ОР и р, и условиями: для ОР необходимо максимальное значение, для p значение < 0.05.
Степень достоверности результатов и их апробация
Представленные в работе теоретические положения, выводы и методические подходы основаны на глубокой и тщательной проработке значительного ретроспективного и проспективного материала с применением комплекса современных статистических методов, адекватных поставленным задачам. Представленный объем материала и его качество являются достаточными для решения поставленных задач, обеспечивают достоверность результатов исследования, сформулированных выводов.
Полученные результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения хирургического №10 (биотерапии опухолей) НИИ КО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.
Положения, выносимые на защиту
Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов выявлена в 69% образцов первичной и 58% образцов метастатической меланомы кожи.
Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов в образцах первичной и метастатической меланомы кожи характеризуется выраженной гетерогенностью, при этом
наблюдается общая закономерность в уменьшении экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов в образцах метастазов меланомы кожи по сравнению с их экспрессией в образцах первичной меланомы кожи.
Увеличение в образцах первичной меланомы кожи экспрессии ампликонов GAGE-1-8 (на количественном и качественном уровне), MAGE-C1 (на количественном и качественном уровне), MAGE-A12-236 (на количественном уровне), MAGE-A3 (на количественном уровне), а также увеличение суммарной экспрессии всех 12 ампликонов раково-тестикулярных антигенов (на количественном уровне) и увеличение экспрессии общего количества ампликонов раково-тестикулярных антигенов из 12 проанализированных (на качественном уровне) связано с достоверным увеличением общей выживаемости у пациентов с первичной меланомой кожи.
Увеличение в образцах первичной меланомы кожи экспрессии ампликона GAGE-1-8 (на количественном и качественном уровне) и увеличение суммарной экспрессии всех 12 ампликонов раково-тестикулярных антигенов (на количественном уровне) связано с достоверным увеличением безрецидивной выживаемости у пациентов с первичной меланомой кожи.
Уменьшение в образцах первичной меланомы кожи экспрессии ампликонов MAGE-A10, MAGE-A4, MAGE-B1 (на количественном уровне) связано с достоверным увеличением безрецидивной выживаемости у пациентов с первичной меланомой кожи.
Уменьшение экспрессии ампликона MG-A2 в образцах метастазов меланомы кожи на количественном уровне связано с достоверным увеличением общей выживаемости у пациентов с метастатической меланомой кожи.
Увеличение в образцах метастазов меланомы кожи экспрессии ампликонов MAGE-A1 (на количественном уровне), MAGE-B1 (на количественном уровне), MG-A12-236 (на количественном уровне) а также увеличение суммарной экспрессии всех 12 ампликонов раково-тестикулярных антигенов (на количественном уровне) и увеличение экспрессии общего количества ампликонов раково-тестикулярных антигенов из 12 проанализированных (на качественном уровне) связано с достоверным увеличением общей выживаемости у пациентов с метастатической меланомой кожи.
Апробация диссертации
Апробация работы состоялась 16 мая 2017 года на совместной научной конференции отделения хирургического №10 (биотерапии опухолей), отделения хирургического №1 (общей онкологии), отдела патологической анатомии опухолей человека, отделения химиотерапии и комбинированного лечения злокачественных опухолей, лаборатории клинической иммунологии опухолей централизованного клинико-лабораторного отдела
НИИ клинической онкологии, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.
Материалы и основные положения работы доложены на XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием имени А.Ю. Барышникова «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2017) и на научно-практической конференции «Вопросы диагностики и лечения меланомы и опухолей кожи» (Москва, 2017).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 3 статьи, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 статья в зарубежном рецензируемом журнале, индексируемом в базе РИНЦ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 онкология, конкретно пунктам 2,3.
Личный вклад автора
Автор самостоятельно провёл анализ опубликованных отечественных и зарубежных исследований по теме диссертации, сформулировал и определил цели и задачи исследования, спланировать его дизайн. Автор собрал и подготовил для молекулярно-генетического исследования 145 образцов меланомы кожи, проанализировал 5-летнюю выживаемость пациентов, в опухоли которых была изучена экспрессия генов РТА. С помощью современных методов статистической обработки данных автор провёл анализ полученных результатов на качественном и на количественном уровне.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста. Работа содержит список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение и выводы. Указатель литературы включает 8 отечественных и 178 зарубежных источников. Работа дополнена 18 таблицами и проиллюстрирована 44 рисунками.
Таргетная химиотерапия метастатической меланомы BRAF/MEK ингибиторами
Идея комбинации ингибиторов MAPK сигнального пути и иммунотерапии основана на том, что ингибиторы BRAF и MEK увеличивают антигенные свойства МК, вызывая повышение в опухоли меланосомальных опухолеассоциированных антигенов (ОАА). Это было показано как для ингибиторов MEK [95], такидляингибиторов BRAF [26]. Добавление Вемурафениба в культуру клеток меланомы кожи позитивной по мутации BRAFV600E вызывало увеличение распознавания клеток МК опухолеспецифичными лимфоцитами (TIL). Это происходило благодаря тому, что вемурафениб активировал в опухоли экспрессию не только опухолеассоциированных антигенов (ОАА): MLANA, RAB38, PRAME, MUM1, PRAME, BIRC5 и RAB38, но и генов, участвующих в презентации этих антигенов в контексте MHCI класса: HLA-G, PDIA3, HLA-F, PSME1, HLA-E, CREB1, LGMN, TAPBP, HSP90AA1, HSP90AA2, CALR, CANX, HSPA2, B2M, CREB1 [50]. Гибель опухолевых клеток, опосредованная ингибиторами BRAF и MEKтакже может приводить к высвобождению опухолевых антигенов, увеличивая презентацию ОАА цитотоксическим Т лимфоцитам.
Помимо своего потенциально полезного иммуностимулирующего эффекта ингибиторы MAPK могут блокировать BRAF и CRAF киназыдикого типа в активированных лимфоцитах [124]. Хорошо известно, что MAPK сигнальный путь является критическим звеном внутриклеточной передачи сигнала при лимфоцитарном ответе на встречу с антигеном или при стимуляции лимфоцита цитокином. Эффекты вемурафениба на иммуноциты изучали Comin-Anduix и соавторы [37]. В своём исследовании они сокультивировали периферические мононуклеары крови с клетками МК позитивными по мутации BRAFV600E, добавляя в культуральную среду различные концентрации вемурафениба. Влияниевемурафениба на антиген-специфическую Т-клеточную функцию анализировали по специфического высвобождению цитокинов и методом цитотоксической активности. Авторы показали, что вемурафениб не блокирует клеточный цикл, не вызывает апоптоз и не нарушает фосфорилирование сигнальных молекул в лимфоцитах. Функциональный анализ специфического
распознавания антигена показал сохранение Т-клеточной функции [37]. В другом исследовании Boni и соавт. показали, что эффект BRAF и MEK ингибиторов на активность лимфоцитов различается [26]. На клеточных линиях МК они показали, что подавление MAPK сигнального пути BRAF или MEK ингибиторами приводит к увеличению уровня экспрессии меланоцитарных дифференцировочных антигенов. Это вызывает улучшение распознавания опухолевых клеток антиген-специфичными Т-лимфоцитами. При этом MEK ингибиторы нарушают функции Т-лимфоцитов, тогда как BRAFингибиторы таким действие на иммуноциты не обладают.
Таким образом, BRAF/MEK ингибиторы могут стать эффективным звеном мультимодального подхода к лечению диссеминированной МК основанном на комбинации цитостатической и иммуномодулирующей терапии и этот подходуже активно изучают в клинических исследованиях.
В начале 90-х годов XX века ThierryBoonи соавт. сообщили о первой успешной попытке клонирования человеческого противоопухолевого антигена, названного MAGE-1 (Melanoma Antigen-1), который индуцировал у пациентов с меланомой аутологический Т-лимфоцитарный ответ [165]. В последующих работах было установлено, что MAGE-1 (названный позже MAGE-A1) экспрессируется в злокачественных опухолях различного происхождения, но не в нормальных тканях, за исключением яичек и плаценты [Ошибка! Неизвестный аргумент ключа., bookmark231].Открытие MAGE-A1 сталовозможноблагодаряметодуклонированияТ-клеточногоэпитопа [165].Этотметод, позволилидентифицироватьидругиеопухолевыеантигены, такиекак MAGE-A2, MAGE-A3, BAGE и GAGE-1 [24, 43, 35, 59]. Вскоре после открытия ОАА методом клонирования Т-клеточного эпитопа Pfreundschuh и соавт. разработали серологический метод, основанный на иммуноскрининге экспрессии библиотек опухолевой кДНК не с помощью Т-клеток, ас помощью антител пациентов [138]. Этатехнология, названа ясерологическим анализом библиотек экспрессии кДНК (SEREX) позволила обнаружить несколько новых иммуногенных ОАА сограниченной экспрессией в тканях яичеки различных типах злокачественных опухолей, среди которых были выявлены антигенсиновиальнойсаркомы synovialsarcoma/Xbreakpoint 2 (SSX-2) [164] и высокои ммуногенный опухолевый антиген New Yorkoesophagealsquamouscellcarcinoma 1 (NY-ESO-1) [34]. Помимо уже описанных выше иммунологических методов, для выявления новых опухолевых антигенов, которые экспрессированы либо в тканях яичек, либо в злокачественных опухолях использовали анализ экспрессии генов путем сравнения всей совокупности опухолевой мРНК с мРНК из нормальной ткани или ткани тестикул. Таким образом, были выявлены сотни новых опухолевых антигенов. Для обобщения растущего списка этих генов, экспрессированных в различных злокачественных опухолях, но не в нормальных тканях за исключением яичек и плаценты, Old и Chen предложили новый термин – раковый тестикулярный антиген (РТА) [34, 119]. Насегодняшнийденьнеменее 70 семействРТАсболеечем 140 отдельным и антигенами были идентифицированы и каталогизированы в базе данных, созданной Ludwing Institute for Cancer Research [11].
РТА можно разделить на те, которые закодированы в Х хромосоме – Х РТА, и те, которые в ней не закодированы [151]. Установлено, чтооколо 10% геновнаХхромосомепринадлежатсемействуХ-РТА. При этом Х-РТА составляют более половины всех РТА и часто образуют мультигенные семейства, организованные в хорошо различимые кластеры на Х хромосоме, где различные члены этого семейства расположены в виде комплексов прямых и инвертированных повторов. В качестве примера можно привести Xp11 регион, который содержит все гены семейства SSX и суперсемейства GAGE/PAGE/XAGE, а также Xq24-q28 регион, который несет самую высокую плотность РТА генов, включая MAGE-A, MAGE-C и NY-ESO-1 [151]. РТА гены которых не локализованы на Х-хромосоме – не Х-РТА, распределены по всему геному и в основном представлены генами в одной копии [151](см. Табл.1.3).
Оценка экспрессии раково-тестикулярных антигенов
Подбор последовательности нуклеотидов праймеров осуществлялся с помощью программы Oli99 (Техноген, Россия, Москва). Сами праймеры были синтезированы по заказу фирмой “Синтол” (Россия, Москва). Последовательность мРНК была получена из баз данных UniGene [105]и AceView[75]. Гомологичность нуклеотидных последовательностей, полученных ампликонов последовательностям геномной и мРНК определяли с помощью программы BLAST [76].Экспрессию гена GAPDH определяли с помощью готовых праймеров из набора G3PDH 0.45 kb Control Amplimer Set (CLONTECH, Mountain View, USA). 2.5.3.3 Условия проведения полимеразной цепной реакции
ПЦР проводили в программируемом термостате фирмы Hybaid (Waltham, USA). кДНК (1/100 часть от объёма реакции обратной транскрипции) амплифицировали с 0,5мкМ ген-специфических олигонуклеотидов и 2,0 ед. ДНК-полимеразы Thermus Aquaticus (БиоМастер, Москва, Россия). Амплификацию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 0,01М Трис-HCl (pH 8,5 при 25C), 0,05 M KCl, 0,002 M MgCl2, 10 мкг/мл желатина, 200 мкМ каждого dNTP, 200 мкг/мл антител "TaqStart" (CLONTECH, Mountain View, USA). Для всех образцов ПЦР проводили по схеме: 94оС - 30 c, 60оС – 60 c, 72оС – 1 мин – 35 циклов. 72оС – 7 мин.
Результаты ПЦР анализировали с помощью электрофореза 5 мкл реакционной смеси в 1,5% агарозном геле в ТАЕ буфере с добавлением 0,002% бромистого этидия. Продукт ПЦР выявляли с помощью флуоресценции в УФ-свете. Наличие экспрессии гена GAPDH (“ген домашнего хозяйства”) использовали в качестве положительного контроля ОТ-ПЦР. Маркёром длины ПЦР продукта являлся реактив GeneRuler 1kb DNA Ladder (Fermentas, Glen Burnie, USA). Специфичность выявляемого сигнала подтверждали отсутствием продукта амплификации ожидаемого размера в параллельных пробах, в которых на этапе обратной транскрипции не добавляли фермент обратную транскриптазу M-MLV. На рисунке 2.4 показан пример фотографии электрофореза ПЦР-продукта. A B
Пример фотографии электрофореза ПЦР-продукта в двух образцах первичной меланомы (А и B). На рисунке цифрами обозначены следующие ампликоны: 14BAGE, 15CTAG1B, 16GAGE-2D,2E, 17GAGE-4-6, 18MAGEA1, 19MAGEA10, 20MAGEA4, 21MAGEB1, 22MAGEC1, 23MG_A12-236, 24MG-A2, 25MG-A3, 26MLANA, 29TYR, 31GAPDH, 34S100B. М- маркёр длины.
Фотографии гелей после электрофореза с флуоресцирующимим ПЦР продуктами оцифровывали и анализировали с помощью программы ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA). Количественное определение уровня экспрессии генов осуществлялось путём анализа оцифрованных изображений электрофореграмм продукта ПЦР. Каждой полосе свечения ПЦР продукта в геле в зависимости от её интенсивности присваивали цифровое значение в безразмерных единицах, которое и считали количественным выражением уровня экспрессии анализируемых генов. Нормирование уровня экспрессии остальных анализируемых генов в каждом образце проводили по уровню экспрессии гена GAPDH в данном образце. Количественное значение экспрессии рассчитывали в процентах от уровня экспрессии гена GAPDH. Для исключения ошибки связанной с некорректным численным (количественным) определения уровня экспрессии выбранных генов, анализ корреляции экспрессии проанализированных генов проводили на не только на количественном, но и на качественном уровне. В качественном анализе, подтверждением экспрессии изучаемого гена являлось любое минимальное, но отличное от нуля значение. 2.6 Математическая обработка данных
Все клинические данные включенных в исследование пациентов, количественные и качественные значения экспрессии изучаемых генов были внесены в общую электронную таблицу, созданную в программе Microsoft Excel. В созданной электронной таблице, с помощью встроенных в программу Microsoft Excel стандартных инструментов описательной статистики были проанализированы все непрерывные числовые данные, включая медиану, среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение и доверительные интервалы. Помимо Microsoft Excel оценку влияния экспрессии генов РТА на прогноз заболевания проводили с помощьюдругой программы IBM SPSS 24, путем расчета лог-рангового критерия и функции Каплан-Майера. Достоверность различий оценивали при помощи критериев Хи-квадрат и Вилкоксона. Различия считали достоверными при уровне значимости р 0,05.
При анализе влияния экспрессии генов РТА на общую и безрецидивную выживаемость перед нами встала задача определения такого порогового значения уровня экспрессии каждого из изучаемых генов РТА, при котором в выборке исследуемых пациентов сформировались бы две группы с максимальным отношением рисков (ОР) при обязательном условии соблюдения статистической достоверности (значение p). Решением стала разработка классической двойной задачи параметрической оптимизации с двумя целевыми функциями ОР и р, и условиями: для ОР необходимо максимальное значение, для p значение 0.05. Переменной (аргументом) выступало искомое значение уровня экспрессии изучаемого гена РТА в диапазоне от 0-100 % от уровня экспрессии гена GAPDH в данном образце. Эту задачу решали путём детерминированного метода поиска решения, а именно путём перебора всех возможных вариантов порогового значения экспрессии каждого из изучаемых генов. Для этого посредством программного комплекса PyCharm (JetBrains, USA) была написана программа в среде разработки Python с использованием библиотек стандартных функций Pandas, Numpy, Scipy, Matplotlib [179]. Примеры расчетов разработанной программы представлены на рис. 2.5. Данный метод мы применяли при
Прогностическое значение толщины первичной опухоли
Различия между экспрессией ампликонов РТА в образцах первичной и метастатической МК было достоверным (p=0.001). При сравнении результатов на качественном уровне для всех 12 ампликонов РТА выявлено достоверное снижение их экспрессии в образцах метастазов меланомы в сравнении с образцами первичной опухоли. Среднее значение уменьшения уровня экспрессии ампликона РТА в образцах метастазов МК в сравнении с образцами первичной МК составило – 32% (95%ДИ 23-41%).
Среди всех 132 образцов МК (первичной и метастатической) у нескольких пациентов были взяты несколько образцов первичной и/или метастатической опухоли (см. рис. 2.1). Для таких образцов мы оценили гетерогенность экспрессии ампликонов РТА как внутри первичной опухоли, так и между образцами метастазов одного и того же пациента. Кроме того, если такие образцы были доступны, мы изучили различие в экспрессии ампликонов РТА в первичной и метастатической меланоме у одного и того же пациента. Перед нами также стояла задача какое значение уровня экспрессии РТА выбрать в тех случаях, когда от пациента получено несколько образцов первичной и метастатической МК.
Внутриопухолевая гетерогенность первичной МК была проанализирована у 5 пациентов. У каждого из этих пациентов было доступно по два образца первичной МК: один был взят из центрального узлового компонента первичной МК, второй образец был взят из периферии первичной опухоли (см. рис. 2.2).
Во всех пяти случаях, у каждого пациента мы наблюдали различия в уровнях экспрессии каждого из ампликонов РТА во всех образцах, полученных из центрального узлового компонента его первичной опухоли и плоского периферического компонента его первичной МК как на количественном уровне и качественном уровне. На рисунке 3.8 представлены результаты сравнения экспрессии ампликонов РТА в образцах, полученных из центра и периферии МК у одного из 5 пациентов. Данные по экспрессии ампликонов в парных образцах первичной МК всех 5 пациентов представлены в таблице 3.5. (А)— общий вид удаленной первичной меланомы пациента U0103. Стрелками отмечены 1 – центральный участок опухоли. 2 – периферический участок опухоли. (Б) Уровень экспрессии ампликонов РТА в центральном и периферическом компоненте первичной МК данного пациента. Как видно по таблице 3.5 и результатам пациента U0103, представленным на рисунке 3.8 у всех пациентов уровень экспрессии ампликонов РТА в образцах из центра и периферии первичной опухоли отличался, при этом уровень экспрессии ампликонов РТА в центре опухоли была выше. Принимая во внимание выраженную гетерогенность экспрессии ампликонов РТА между центром и периферией первичной МК, а также необходимость получения данных об экспрессии РТА для оценки их прогностического значения только по одному образцу от отдельного пациента, мы приняли решение, что при анализе парных образцов первичной МК (в тех случаях, когда доступны два образца - из центра опухоли и из её периферии) учитывать только результаты экспрессии ампликонов РТА в центральном, максимальном по толщине, компоненте первичной МК. В поддержку этой идеи выступает и тот факт, что для оценки прогноза при МК учитывают наибольшую глубину инвазии опухоли в толщу кожи, то есть её центральную часть. Таблица 3.5— Гетерогенность экспрессии РТА внутри первичной МК на количественном уровне и качественном уровне у 5 пациентов. н.д. – недостоверно. № образца и локализация Достоверность различий, P
Среди образцов опухоли, полученных от пациентов с метастатической меланомой было 42 образца метастазов, полученных от 18 пациентов. При сравнении экспрессии ампликонов РТА в этих образцах нами была выявлена существенная гетерогенность в уровнях экспрессии ампликонов РТА как на качественном, так и на количественном уровне. На рисунке 3.9 представлены фрагменты удалённых метастазов меланомы и уровни экспрессии ампликонов РТА в этих образцах. В таблицах 3.6. и 3.7 представлены данные по экспрессии ампликонов РТА в разных образцах метастазов, полученных от одних и тех же пациентов на количественном (в % относительно уровня экспрессии GAPDH) и качественном (любой, отличный от нуля уровень экспрессии ампликона) уровнях.
Оценка влияния максимального уровня экспрессии раково-тестикулярных антигенов в метастазах меланомы кожи на общую выживаемость. Количественный анализ
В данной работе мы попытались изучить могут ли антигенные свойства первичной и метастатической МК оказывать влияние на прогноз заболевания. Одними из самых изученных антигенов меланомы являются РТА. Данная группа антигенов начиная с их открытия в начале 90-х годов XX века T.Boon и соавт. активно изучалась как invitro, так и в клинических исследованиях в качестве универсальных опухолевых антигенов для создания противоопухолевых вакцин. РТА достаточно иммуногенны и вызывают формирования как клеточного, так и гуморального иммунного ответа у пациентов с МК. Однако в крупных клинических исследованиях по применению РТА в качестве противоопухолевых вакцин для меланомы как в адъювантном, так и в лечебном режиме клиническая эффективность данного подхода доказана не была. При этом применение другого метода иммунотерапии мМК – анти CTLA4 и анти-PD-1/PD-L1 моноклональных антител продемонстрировало яркий клинический результат, хотя следует отметить, что и эта терапия, приблизительно у 30-70% пациентов с мМК не обладает никакой клинической эффективностью.
Увидев такой диссонанс между эффективностью двух иммунологических подходов к терапии мМК у нас возникла идея детального изучения антигенных свойств опухоли, а именно экспрессии в опухоли РТА, как возможного предиктора эффективности проводимой иммунотерапии. Наша основная гипотеза состоит в том, что отсутствие экспрессии РТА на поверхности МК является одной из причин неэффективности проводимой иммунотерапии.
По данным проведённого нами поиска среди опубликованных
исследований, у пациентов, получающих терапию анти CTLA4 и анти-PD-1/PD-L1 моноклональными антителами по поводу мМК не были изучены антигенные профили ни первичной, ни метастатической опухоли, т.е. корреляцию между экспрессией РТА в опухоли и клиническим ответом на иммунотерапию не проводили. Лишь в одном клиническом исследовании[161] по адъювантному применению ипилимумаба у пациентов с IIIB и IIIC стадиями МК после хирургического лечения на фоне терапии наблюдалось увеличение популяции цитотоксических CD4+ и CD8+ лимфоцитов специфичных РТА NYESO-1 (в нашей работе его экспрессию определяли по ампликону CTAG1B). Данное наблюдение может служить косвенным свидетельством участия РТА в противоопухолевом иммунном ответе, индуцируемом анти-CTLA4 мАТ. Поскольку в проведенных нами ранее исследованиях [4] по изучению экспрессии РТА в клеточных культурах МК и небольшом количестве опухолевых образцов полученных от пациентов была показана выраженная разнородность экспрессии РТА в образцах МК от разных пациентов, то в данной работе мы решили оценить какое клиническое значение имеет экспрессия генов РТА в первичной и метастатической МК. Мы предположили, что поскольку МК является чрезвычайно иммуногенной опухолью, возможно её антигенный профиль является независимым прогностическим фактором. Сразу отметим, что ни один из пациентов, у которых в данной работе была проанализирована экспрессия генов РТА в первичной или метастатической МК не получал системной терапии анти-CTLA4 и анти-PD-1/PD-L1 моноклональными антителами, поэтому оценить корреляцию между экспрессией РТА в образцах опухоли и частотой ответа на иммунотерапию ингибиторами иммунологического надзора мы не можем. Это станет предметом наших последующих исследований, и данная работа является обоснованием для их проведения. Целью данной работы было оценить прогностическое значение экспрессии РТА в первичной и диссеминированной МК. Характеристика пациентов
В работе мы проанализировали 132 образца первичной (n=58) и метастатической (n=74) МК от 81 пациента (59 с первичной и 49 с метастатической МК) в которых оценили экспрессию 12 ампликоновРТА (MG-A3, BAGE, CTAG1B, GAGE-1-8, GAGE 4-7, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA4, MAGEB1, MAGEC1, MG_A12-236, MG-A2). В нашей работе у 17 пациентов для анализа экспрессии ампликонов РТА были доступны как образцы первичной МК, так и её метастазов. У 5 пациентов для анализа экспрессии ампликонов РТА было доступно по два образца первичной МК (её центральный и периферический 150 фрагмент). У 18 пациентов нам удалось проанализировать экспрессию ампликонов РТА в двух и более образцах метастазов. Средний возраст всех (n=81) пациентов на момент постановки диагноза МК составлял 51,1 год (95% ДИ 47,9-54,4 года), что ещё раз доказывает факт о том, что меланома поражает людей трудоспособного возраста. Обращает внимание тот факт, что средняя толщина первичной МК всех 81 пациента составляла 7,8 мм (95% ДИ 6,4-9,1 мм), а среди клинических стадий по классификации AJCC 2009 на момент постановки диагноза МК преобладали IIB (12.3%), IIC (30,9%) и IIIC (27,2%), что свидетельствует об изначально неблагоприятном прогнозе всех пациентов, у которых в образцах первичной и метастатической МК мы определяли экспрессию ампликонов РТА. Кроме того, такая средняя толщина первичной опухоли, говорит об отсутствие как таковой, ранней диагностики МК у изучаемых нами пациентов.
Поскольку в данной работе мы изучали роль экспрессии ампликонов РТА в качестве независимого фактора прогноза рецидива заболевания и жизни пациентов при первичной и метастатической МК, нам было необходимо понять какое значение на ОВ и БРВ в изучаемой нами выборке пациентов оказывают уже известные прогностические факторы (толщина первичной опухоли в мм по Бреслоу, изъязвление первичной опухоли и клиническая стадия по AJCC на момент постановки диагноза). Кроме того, мы проанализировали влияние на прогноз демографических показателей: пола и возраста пациентов на момент постановки диагноза, которые не оказывают существенного влияния на прогноз течения МК.
Как мы и ожидали, в нашей выборке пациентов выявлена корреляция между толщиной первичной опухоли по Бреслоу (3,5 или 3,5 мм) и общей выживаемостью пациентов (p=0.035), а также с безрецидивной (p=0.057, достоверность низкая) выживаемостью пациентов.
Нам не удалось выявить статистически достоверной корреляции между изъязвлением первичной опухоли как с общей (p=0.7), так и с безрецидивной (p=0.8) выживаемостью пациентов. Вероятно, это обусловлено преобладанием запущенных форм первичной МК и небольшим числом пациентов, не имевших изъязвление первичной опухоли.
Мы выявили корреляцию между клинической стадией заболевания на момент выявления первичной МК по AJCC 2009 (IIили II) и общей (p 0.001) и безрецидивной (p=0.02) выживаемостью.
Как и следовало ожидать, ни пол, ни возраст на момент постановки диагноза не влияли на общую и безрецидивную выживаемость пациентов с МК.
Таким образом, мы проверили в нашей выборке пациентов влияние на общую и безрецидивную выживаемость хорошо изученных морфологических, клинических и демографических факторов. Выявленные корреляции позволяют нам считать, что отобранные пациенты, в образцах первичной и метастатической МК которых мы изучали прогностическое значение экспрессии РТА являются репрезентативной выборкой от общей популяции пациентов с МК.
Одним из ограничений нашего исследования стало то, что при анализе прогностического значения экспрессии ампликонов РТА в образцах первичной и метастатической МК в соответствующие группы первичной и метастатической МК мы включали пациентов с разными клиническими стадиями заболевания, что могло повлиять на прогноз. Преодолеть такое влияние на прогноз помог бы анализ прогностического значения экспрессии РТА в образцах первичной или метастатической МК только у пациентов с одной стадией заболевания, например отдельно для I, II A, IIB, IIC, IIIA, IIIB, IIIC и IV клиническими стадиями заболевания по классификации AJCC 2009. Это не было сделано нами по причине небольшого количества пациентов с ранней МК в нашей выборке. Такой анализ будет проведён нами в последующих исследованиях по оценке прогностического влияния РТА при МК на большей выборке пациентов с ранними стадиями данного заболевания, когда прогноз МК относительно благоприятный.