Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные аспекты неоадъювантной терапии местно-распространенного рака молочной железы (обзор литературы) 11
1.1 Этапы развития неоадъювантной химиотерапии 13
1.2 Иммуногистохимическая классификация РМЖ 23
1.3 Иммунотерапия в лечении РМЖ 28
Глава 2. Клинический материал, методы лечения и исследования 39
2.1. Клиническая характеристика больных 39
2.2. Методы диагностики и лечения и дополнительные методы обследования 48
2.3. Методы статистической обработки 55
Глава 3. Клиническая оценка результатов неоадъювантного лечения больных раком молочной железы IIB-IIIB стадии 56
Глава 4. Сравнительный анализ некоторых показателей иммунной системы пациенток при проведении неоадъювантной химиотерапии в основной и контрольной группах 79
Глава 5. Морфологические и имуногистохимические изменения под действием рекомбинантного фно-т у больных раком молочной железы IIB-IIIB стадии 87
Глава 6. Изменение адаптационных реакций организма больных раком молочной железы iib-iiib стадии под влиянием неоадъювантной химиотерапии с применением и без применения рекомбинантного фно-т 98
Заключение 107
Выводы 119
Практические рекомендации 121
Список сокращений
- Иммуногистохимическая классификация РМЖ
- Методы диагностики и лечения и дополнительные методы обследования
- Сравнительный анализ некоторых показателей иммунной системы пациенток при проведении неоадъювантной химиотерапии в основной и контрольной группах
- Изменение адаптационных реакций организма больных раком молочной железы iib-iiib стадии под влиянием неоадъювантной химиотерапии с применением и без применения рекомбинантного фно-т
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями женского населения как России, так и большинства других стран мира рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующую позицию. С 2002 по 2012 год заболеваемость РМЖ в Российской Федерации выросла на 21,6% с 60,22 до 76,74 случаев на 100 тыс. населения (Пак Д. Д., Усов Ф. Н., 2012). В последние годы смертность от РМЖ в России лидирует среди причин смерти от злокачественных новообразований (17,3 %) и продолжает увеличиваться (16,5 на 100 тысяч женщин в 2011 году) (Каприн А.Д., 2014). В России 24,3% всех случаев впервые диагностированного РМЖ составляют МР формы, когда выполнение радикальной операции невозможно без предварительного системного лечения, позволяющего уменьшить размеры опухоли (Чиссов В.И., Старинский В.В., 2002; Аксель Е.М., 2014). Женщины с МР РМЖ имеют прогноз хуже, чем пациенты имеющие ранние, операбельные формы заболевания (Собин Л.Х., 2011; Аксель Е.М., 2014). Неоадъювантная ХТ играет важную роль в лечении данной патологии, улучшая результаты хирургического лечения, давая возможность выполнить органосохраняющие операции, а также провести лечение микрометастазов (Chia S. et al., 2008). В настоящее время таксаны и антибиотики антрациклино-вого ряда считаются «Золотым стандартом» в предоперационной терапии РМЖ (Gaui M.F. et al., 2007). Одним из современных направлений развития онкологии является изучение роли цитокиновых препаратов в лечении злокачественных новообразований, в том числе РМЖ (Платинский Л.В., 2008). Рядом исследователей показана возможность усиления противоопухолевой эффективности цитостатиков при проведении комплексной терапии с фактором некроза опухоли- (ФНО-) в результате повышения селективности доставки химиопрепара-тов в опухоль (Сысоева Г.М., 2010). В исследовании на экспериментальных моделях опухолей показано повышение противоопухолевой активности композиционного препарата, содержащего в своем составе ФНО- и производные ге-матопорфирина, по сравнению с составляющими его компонентами. Противо-
4 опухолевый эффект ФНО- в составе композиции достигался введением значительно меньших доз химиопрепарата, что важно с точки зрения снижения его токсичности (Сысоева Г.М., 2010). Проводимые клинико-морфологические исследования показали, что рекомбинантный фактор некроза опухоли-тимозин-1 обладает прямым противоопухолевым действием in vitro и in vivo на различных линиях опухолевых клеток; по спектру цитотоксического и цитостатического действия на опухолевые клетки препарат соответствует ФНО- человека, но имеет в 100 раз меньшую общую токсичность; угнетает ангиогенез в противоположность ФНО-, сохраняя при этом способность повышать проницаемость эндотелия сосудов; запускает процесс апоптоза опухолевых клеток; а также активирует каскад химических реакций коагуляционной системы крови (Шмелв В. А., 2010). Несмотря на явную привлекательность цитокиновых препаратов, роль рекомбинантного ФНО-Т, его эффективность и возможности применения в лечении злокачественных опухолей остается мало изученной. На основании вышеизложенного, с учетом установленного синергизма противоопухолевого действия химиопрепаратов и рекомбинантного фактора некроза опухоли-тимозина- (ФНО-Т), клиническое изучение их совместного применения в нео-адъювантной ХТ местно-распространенного РМЖ представляется актуальным.
Цель исследования
Улучшение результатов лечения больных раком молочной железы IIB-IIIB стадии при помощи неоадъювантной химиотерапии в комбинации с пери-туморальным применением рекомбинантного белка фактора некроза опухоли-тимозина-1.
Задачи исследования
-
Разработать методику неоадъювантной химиоиммунотерапии с применением рекомбинантного ФНО-Т у больных РМЖ IIB-IIIB стадии.
-
Изучить непосредственные клинические результаты, характер и выраженность побочных токсических реакций неоадъювантной химиоиммунотера-пии с применением рекомбинантного ФНО-Т у больных РМЖ и в контрольной группе.
-
Оценить эффективность химиоиммунотерапии с применением рекомби-нантного ФНО-Т в зависимости от молекулярных подтипов РМЖ.
-
Изучить патоморфологические изменения в опухоли и перитуморальной ткани под влиянием неоадъювантной химиоиммунотерапии с применением и без применения рекомбинантного ФНО-Т.
-
Изучить влияние интратуморального введения ФНО-Т на изменения клеточного состава Т- и В-лимфоцитов.
-
Оценить адаптационные реакции организма больных РМЖ IIB-IIIB стадии под влиянием неоадъювантной химиоиммунотерапии с применением и без применения рекомбинантного ФНО-Т.
-
Оценить общую и безрецидивную выживаемость больных РМЖ IIB-IIIB стадии после комплексного лечения по результатам трехлетних наблюдений.
Научная новизна работы
В диссертационной работе впервые:
-
Разработана и применена в клинике методика неоадъювантной химиоим-мунотерапии РМЖ IIB-IIIB стадии с перитуморальным применением отечественного рекомбинантного ФНО-Т, позволяющая повысить объективный эффект, в том числе за счет увеличения частоты полной регрессии по сравнению с контролем.
-
Выявлено, что предложенный метод перитуморального применения ре-комбинантного ФНО-Т оказывает иммунокорригирующее действие за счет протекторного влияния на В-клеточное звено иммунной системы и способствует сохранности содержания CD3+CD8+ клеток на уровне, статистически достоверно превышающем контроль.
-
Выявлено, что перитуморальное введение рекомбинантного ФНО-Т в комбинации с неоадъювантной химиотерапией позволяет достигнуть лечебного патоморфоза III - IV степени.
-
Выявлено, что проводимая химиоиммунотерапия с рекомбинантным ФНО-Т снижает число микрососудов в опухоли по сравнению с исходными показателями.
-
Выявлено, что перитуморальное применение рекомбинантного ФНО-Т способствует улучшению результатов 3-летней безрецидивной выживаемости по сравнению со стандартной неоадъювантной ХТ при РМЖ IIB-IIIB стадии.
-
Выявлено, что предложенный метод перитуморального применения ре-комбинантного ФНО-Т способствует статистически значимому уменьшению реакций стресса в группе с применением ХТ в режиме FAC по сравнению с исходными данными
Практическая значимость работы
Использование неоадъювантной ХТ с перитуморальным введением ре-
комбинантного фактора некроза опухоли-тимозина-1 способствует улучше
нию 3-летней безрецидивной выживаемости больных РМЖ IIB-IIIB стадии.
Метод обладает умеренной токсичностью, не сложен в исполнении, что позво
ляет широко использовать его в специализированных онкологических учре
ждениях.
Применение данной методики перитуморального введения рекомбинант-
ного ФНО-Т показало эффективность при лечении различных молекулярных
подтипов РМЖ, в том числе и наиболее агрессивно протекающем - тройном
негативном.
Внедрение в практику
Данные, полученные в результате исследования используются в работе отделения противоопухолевой лекарственной терапии №1 ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России.
Основное положение, выносимое на защиту
При раке молочной железы IIB-IIIB стадии целесообразно использование рекомбинантного ФНО-Т перитуморально, что способствует улучшению результатов лечения за счет увеличения объективного эффекта, в частности увеличения частоты полной клинико-рентгенологической регрессии по сравнению с контролем, увеличения показателей 3-летней безрецидивной выживаемости, протекторного влияния на CD3+8+ и В-клеточное звено иммунной системы,
7 увеличения числа выявления лечебного патоморфоза III-IV степени, уменьшения микрососудистой сети в опухоли, значимого снижения уровня стрессовых реакций.
Апробация работы
Апробация работы состоялась 24 марта 2016 года на заседании Ученого Совета ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России.
Соответствие диссертации паспорту специальности
Основные научные положения и выводы, описанные в диссертационной работе, соответствуют паспорту специальности 14.01.12 онкология.
Результаты работы соответствуют пункту 6 области исследования (внедрение в клиническую практику достижений фармакологии в области создания и использования цитостатиков, гормонов, биологически активных препаратов).
Публикации
Материалы исследования опубликованы в 9 печатных работах, из них 3 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования РФ для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. По результатам исследования сделано 2 устных доклада: на Мультидисциплинар-ном форуме Российского общества онкомаммологов по диагностике и лечению РМЖ в Северо-Кавказском и Южном Федеральном округе 10.04.2015г, г. Сочи и на XII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» 31.03.2015г, г. Москва. Представлено 4 по-стерных доклада: I Ежегодный конгресс РООМ, 4-6 сентября 2014г, Сочи; ESMO Symposium on Immuno-Oncology 2014 (Женева, Швейцария); San Antonio Breast Cancer Symposium, 8-12 декабря 2015г (Сан-Антонио, США); 2016 ASCO Annual Meeting, 3-7 июня 2016г (Чикаго, США).
Объем и структура диссертации
Иммуногистохимическая классификация РМЖ
Первые исследования по применению химиопрепаратов (циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил) при онкологических заболеваниях относятся еще к первой половине 20 века (Krumbhaar EB, Krumbhaar HD., 1919; Farber S, 1948; Farber S., 1949; Goodman LS, et al., 1984). Изначально они применялись для лечения опухолей кроветворной и лимфоидной тканей. Достигнутые успехи в терапии гемобластозов при применении комбинаций из указанных цитостатиков обратили внимание на возможность использования химиопрепаратов у больных с распространенными злокачественными опухолями и, в частности, рака молочной железы (Дешкина Т.И., 2014). Проводимые в начале шестидесятых годов 20 века исследования режима CMF (циклофосфан, 5-фторурацил, метотрексат) имели обнадеживающие результаты: достижение объективных ответов и контроль над болезнью имели место более чем в 60% случаев (Greenspan E.M. et al., 1963; Canellos G.P. et al., 1974; Russell J.A. et al., 1977). И несмотря на то, что полученный эффект был весьма непродолжительным, полные ремиссии достигались редко, данные исследования при отсутствии других более результативных способов лечения данной категории больных носили весьма воодушевляющий характер.
В настоящее время перечень препаратов применяемых при лечении РМЖ расширился. Антибиотики антрациклинового ряда были впервые синтезированы в 1958 г (Pinkel D., 1959) и уже более 40 лет занимают прочные позиции в терапии солидных опухолей. Химиопрепараты вызывают клеточную гибель путем запуска одного из двух основных механизмов. Доксорубицин встраивается между двумя рядом расположенными нуклеотидами, вследствие чего нарушается синтез ДНК и транскрипция. Помимо этого, доксорубицин связывает и ингибирует топоизомеразу II-, которая является ключевым ферментом в синтезе ДНК (Переводчикова Н.И., 2013).
С 90-х годов 20-го века прогресс в терапии РМЖ связан с началом применения таксанов – группы цитостатиков, основное действие которых направлено на микротрубочки веретена деления, состоящих из глобулярного белка тубулина (Rao S. et al., 1994; Diaz J.F., Andreu JM., 1993). Связываясь со свободным тубулином, таксаны способны повышать скорость и степень его полимеризации, стимулировать сборку микротрубочек, стабилизировать сформировавшиеся микротрубочки, препятствуя деполимеризации тубулина и разрушению микротрубочек, вызывать индукцию р53 независимого апоптоза, нарушая функцию клетки в фазе митоза и интерфазе. Чрезмерное образование микротрубочек и их стабилизация ингибируют динамическую реорганизацию сети микротрубочек, что приводит к ингибированию клеточного цикла в G2 и М-фазах вследствие нарушения процесса формирования митотического веретена. Вследствие нарушения микротубулярной сети становится невозможной передача трансмембранных сигналов и внутриклеточный транспорт (Manfredi J.J., Horwitz S.B., 1984; Jordon M.A. et al., 1996; Schiff P.B. et. Al., 1995).
Паклитаксел был синтезирован первым из данной группы цитостатиков. В 1971 году был выделен из экстракта коры тихоокеанского тиса (Taxus braevifolia) в рамках программы поиска новых химиопрепаратов (Rowinsky Е.К., 1997). Вторым цитостатиком таксанового ряда является доцетаксел. Он имеет полусинтетическое происхождение, создан в 1986 году из своего предшественника 10-DAB, который был экстрагирован из игл европейского тиса (Taxus baccata) (Bissery M.C., et al., 1995).
Необходимость начинать лечение местно-распространенного РМЖ с химиотерапии продемонстрировали исследования, проведенные группой ученых в 1993 году (Fisher B., 1995). Авторы сравнивали эффективность двух последовательностей в проведении химиотерапии и лучевой терапии у 390 больных местно-распространенным РМЖ. Половина пациенток получали 4 курса ХТ по схеме CAF, затем местное лечение; другая половина – первым этапом местное лечение, затем химиотерапию. Четырехлетняя выживаемость больных первой группы составила 89%, второй – 80% (р=0,046). Данные исследования положили начало развитию неоадъювантной химиотерапии в лечении РМЖ.
Неоадъювантная химиотерапия РМЖ – это использование системной химиотерапии до хирургического вмешательства. Для предоперационного лечения подходят три группы: 1) пациентки с местно-распространенными опухолями, признанными первично неоперабельными; 2) больные с крупными опухолями (Т2-3), которые нуждаются в мастэктомии, но желают сохранить молочную железу; 3) женщины, участвующие в клинических испытаниях (Hudis C., Modi S., 2007).
Неоадъювантная химиотерапия рака молочной железы стала широко внедряться с 80-х годов 20 века. Экспертами Всемирной организации здравоохранения был принят термин «неоадъювантная химиотерапия». Приставку «нео» интерпретируют как «до того» или «ради чего-то» (Stephens F.O., 1989). Неоадъювантную химиотерапию стали внедрять в клиническую практику с ее использования при исходно неоперабельном, местно-распространенном РМЖ (Azambuja E. et al., 2004), где ей отводилось особое значение. Целесообразность предоперационной ХТ определяется следующими преимуществами (Слонимская Е.М. и соавт., 2009): - раннее начало воздействия на микрометастазы; - улучшение условий хирургического вмешательства; - уменьшение массы первичной опухоли; - возможность in vivo определения индивидуальной чувствительности опухоли к проводимой терапии; - на основании выраженности терапевтического патоморфоза планирование адъювантной терапии; - в процессе химиотерапии исследование системы «первичная опухоль -макроорганизм». Предоперационную химиотерапию рассматривают с одной стороны как модель для изучения проводимой терапии, с другой стороны для изучения биологии первичного рака молочной железы (Fisher В., 1995).
Под влиянием лекарственной терапии в чувствительной к ней опухоли возникают морфологические изменения (патоморфоз). Одним из самых важных критериев оценки эффективности неоадъювантной терапии является послеоперационное гистологическое исследование характера и степени патоморфоза опухоли. Патоморфоз опухоли под действием неоадъювантной терапии является одним из показателей доказательности ее адекватности. Оценка патоморфоза опухоли в зарубежной литературе проводится по различным критериям, которые необходимо учитывать (Франк Т.А. и др., 2014). Этому вопросу на протяжении многих лет были посвящены исследования отечественных ученых (Непомнящая Е.М, 2004).
Существует более 8 систем для оценки степени ответа на терапию. Некоторые исследователи сравнивают карциномы до и после лечения, другие подсчитывают размер остаточной опухоли. В России широко используют оценку лечебного патоморфоза по Г.А. Лавниковой (Lakhani S.R.et al, 2012). В классификации выделяют 4 степени патоморфоза:
Методы диагностики и лечения и дополнительные методы обследования
Статистически значимых различий в зависимости от распространенности заболевания среди пациентов сравниваемых групп не выявлено: IIB стадия РМЖ наблюдалась с частотой 30% и 30,7% пациенток в основной и контрольной группе соответственно; больные РМЖ IIIА стадии были сопоставимы – по 23% в каждой группе; чаще остальных отмечались больные раком молочной железы IIIВ стадии как в основной группе, так и в группе контроля (46,7% и 46,2% соответственно) (рисунок 8).
Морфологическое исследование биоптатов рака молочной железы, полученных при трепан-биопсии опухолей, определяло их принадлежность к тому или иному гистологическому типу РМЖ согласно гистопатологической классификации ВОЗ (4-я редакция от 2012г) и иммуногистохимическому типу в соответствии с молекулярно-биологической классификацией РМЖ принятой на конференции в Сан Галене в 2011 г.
Также, в рамках нашего исследования был проанализирован состав обеих групп в зависимости от гистологического подтипа опухоли. Потом что до открытия молекулярно-генетических подтипов рака молочной железы и создания иммуногистохимической классификации, принадлежность опухоли к тому или иному гистологическому подтипу являлась важным фактором прогноза и в определенной степени влияло на тактику лечения. Как видно рисунка 9 гистологически в основной и контрольной группах в большинстве случаев (76,7% и 78,8% соответственно, р 0,05) был выявлен инфильтрирующий протоковый рак (инфильтрирующая неспецифическая карцинома – согласно последней классификации ВОЗ, Lakhani S.R., 2012); остальные гистологические формы встречались гораздо реже.
Границей разделения больных на люминальный А и В подтипы служил индекс пролиферативной активности Ki67 с пороговым значением 14%. Основной массив пациенток приходился на люминальный В подтип (HER2 +/-) среди больных как основной, так и контрольной группы (53,3% и 57,7% соответственно). Отмечается незначительное преобладание больных HER2-гиперэксперссирующим типом РМЖ в основной группе (26,6%) по сравнению с контролем (23,1%) (р 0,05). Пациентки с люминальным А типом опухоли были включены в исследование в связи с высокой степенью распространения РМЖ (IIIA, IIIB стадии).
Как видно из рисунка 10, сравниваемые группы равноценны по иммуногистохимическим вариантам опухолей. В основной группе число больных с кардиальной патологией (ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, кардиосклероз, аритмии) составило 30,0%. Болезни желудочно-кишечного тракта (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, желчнокаменная болезнь и хронический панкреатит) встречались в 23,3% случаев. Мочекаменная болезнь и пиелонефрит в стадии ремиссии были выявлены при сборе анамнеза у 10,0% больных. Сахарный диабет 2 типа наблюдался у 6,7% больных. В 13,3% случаев выявлено сочетанное поражение нескольких органов или систем. В контрольной группе сопутствующая патология регистрировалась в виде выше указанных заболеваний сердечнососудистой системы – 32,7% больных, патологии желудочно-кишечного тракта – 21,1% пациенток, мочекаменная болезнь и пиелонефрит - 9,6% больных, сахарный диабет 2 типа – 5,8% женщин. Сочетание двух или трех сопутствующих заболеваний зарегистрировано у 15,4% пациенток (Рисунок 11).
Данные рисунка 11 свидетельствуют о преобладании кардиальной патологии у пациентов как основной, так и контрольной групп, что можно объяснить высокой частотой встречаемости данной патологии у людей в возрасте старше 40 лет (а таковых в нашем исследовании было подавляющее большинство). Сахарный диабет 2 типа у больных включенных в исследование имел субкомпенсированный или компенсированный характер, уровень гликемии корригировался приемом пероральных антидиабетических лекарственных препаратов и диетой, не требуя перевода на инсулин. Заболевания органов желудочно-кишечного тракта у всех больных за время проводимого лечения были в состоянии стойкой ремиссии. Таким образом, пациентки из обеих групп по спектру сопутствующей патологии существенно не различались. Выявленные заболевания не препятствовали проведению запланированного объема лечения.
Подводя итог этого раздела, можно сделать вывод о том, что исследуемые группы больных хорошо сбалансированы и сопоставимы по всем основным показателям, что позволило нам их сравнивать.
Перед началом лечения и после его завершения пациенткам выполнялся комплекс обследований, указанный раннее. После диагностических процедур больным, включенным в исследование, в сроки от 2 до 4 недель начиналось проведение неоадъювантной химиотерапии. Площадь поверхности тела больных рассчитывалась по формуле:
Площадь поверхности тела (м2) = Рост (см) х масса тела (кг)/3600 Распределение больных в подгруппы осуществлялось слепым методом по принципу рандомизации. Дизайн исследования представлен на рисунке 12.
Неоадъювантная химиотерапия в изучаемых группах больных проводилась в двух режимах: FAC (доксорубицин 50мг/м2 в 1 день; 5-фторурацил 500мг/м2 в 1 день; циклофосфамид 500мг/м2 в 1 день); либо PA (доксорубицин 50мг/м2 в 1 день; паклитаксел 175мг/м2 в течение 3 часов в 1 день на фоне пре- и постмедикации дексаметазоном и антигистаминным препаратом). Также, для профилактики тошноты и рвоты применяли антиэметическую терапию. Все химиопрепараты вводили на 0,9% физиологическом растворе внутривенно капельно согласно стандарту. Интервал между курсами составлял 21-23 дня.
В зависимости от режима проводимой НАХТ все клинические наблюдения, включенные в работу, разделены на 2 группы: основную и контрольную. Распределение больных по группам осуществляли по принципу рандомизации. Больные основной группы дополнительно получали рекомбинантный -фактор некроза опухолей-тимозин- 1. Состав препарата на один флакон: 100000 ЕД. Препарат по внешнему виду представляет собой пористую массу белого цвета во флаконе, гигроскопичен. Содержимое флакона перед применением растворяют в 1 мл воды для инъекций.
Группа основная - 30 пациенток, каждой из которых было проведено от 2 до 4 курсов системной неоадъювантной антрациклинсодержащей химиоиммунотерапии: у 13 (43,3%) больных применялся режим FAC, а у 17 (56,6%) больных - режим РА в комбинации с перитуморальным введением рекомбинантного ФНО-Т. В первый день каждого курса НАХТ пациенткам основной группы вводили перитуморально по 200 000 МЕ иммунопрепарата. Затем спустя 30 минут начинали внутривенную инфузию химиопрепаратов. Далее, на протяжении еще 4 дней рекомбинантный ФНО-Т вводили перитуморально 1 раз в сутки каждый день.
Группа контроля - 52 больных, которым в предоперационном периоде проводилось от 2 до 6 курсов стандартной системной НАХТ без рекомбинантного ФНО-Т; из них у 21 (40,4%) больных в режиме FAC, у 31 (59,6%) больных -системная химиотерапия в режиме РА.
Сравнительный анализ некоторых показателей иммунной системы пациенток при проведении неоадъювантной химиотерапии в основной и контрольной группах
Как известно, патоморфоз опухоли под действием цитостатической терапии является важнейшим показателем ее эффективности. Помимо достижения непосредственного результата у больных с полным патоморфологическим эффектом статистически выше показатели 5-ти и 10-ти летней общей и безпрогрессивной выживаемости (Семиглазов В.Ф., 2012). Под действием рекомбинантного фактора некроза опухоли-тимозин-1 были обнаружены выраженные морфологические изменения в опухоли согласно классификации ВОЗ 2008 года (ответная реакция организма на проводимое лечение, достигающая IV степени – полный регресс опухоли), что соответствует аналогичной степени патоморфоза у отечественных авторов. Иногда в препаратах имели место лишь единичные комплексы дистрофически измененных раковых клеток. В основной группе больных с применением комбинации цитостатиков с иммунным препаратом отмечалось статистически достоверное увеличение числа лечебного патоморфоза III-IV степени, по сравнению с контрольной группой: 10 (33,2%) и 9 (17,34%) случаев соответственно (p 0,05), что представлено на рисунке 30.
Большое внимание в последние годы уделяется проблеме неоангиогенеза в злокачественных опухолях. Не вызывает сомнения то, что опухоль не может расти и развиваться без образования в ней разветвленной сети капилляров, которые обеспечивают снабжение клеток питательными веществами и кислородом (Гапеенко Е.В., 2011).
Еще в 60-е – 70-е годы 20-го века работами J. Folkman были заложены основные представления о роли неоангиогенеза в прогрессии опухолей и развитии метастазов. Неоангиогенез в опухолях в настоящее время общепризнан, как один из наиболее значимых факторов опухолевой прогрессии, а усилия фармакотерапии сосредоточены на разработке совершенствования препаратов– блокаторов роста сосудистого эндотелия. Особое значение в определении биологического поведения и прогноза опухоли имеет степень ее васкуляризации. Данный показатель до настоящего времени не получил статуса лечебно 90 диагностического стандарта, несмотря на то, что имеются данные при раке молочной железы (Новикова И.А., 2006; McDonnell C.O., 2006).
В нашей работе для оценки ангиогенеза в опухоли был использован индекс внутриопухолевой микрососудистой плотности (intratumor microvessel density -MVD), который определяется стандартным иммуногистохимическим методом с применением эндотелиальных антигенов и позволяет количественно оценить процесс ангиогенеза в опухоли. В рамках проведенного исследования нами были изучены маркеры ангиогенеза и сосудистой пролиферации: VEGF, EGFR, CD31, CD34 в первичных раковых опухолях молочной железы (трепан-биоптаты) и в опухолях, удаленных после неоадъювантной химиотерапии с применением рекомбинантного фактора некроза опухоли-тимозин-1. При анализе полученных данных (CD31, CD34) было выявлено достоверное снижение индекса внутриопухолевой микрососудистой плотности в операционном материале по сравнению с исходными значениями в трепан-биоптатах (таблица 9).
Внутриопухолевая микрососудистая плотность в трепан-биоптатах и в операционном материале больных основной и контрольной групп на фоне проводимой терапии Группы больных CD31 CD34 Основная группа (трепан-биопсия), n=10 5,9±0,34 6,88±1,07 Основная группа (операционный материал), n=10 2,24±0,35 2,75±0,72 Контрольная группа (трепан-биопсия), n=10 6,54±0,89 5,81±0,52 Контрольная группа (операционный материал), n=10 4,1±0,59 3,88±0,41 Пр и меч ан и е : - различия достоверны по отношению к исходному уровню (р 0,05)
У больных под действием проводимой химиотерапии в сочетании с рекомбинантным фактором некроза опухоли-тимозин-1 плотность сосудов микроциркуляторного русла в поле зрения для CD31 снижалась с 5,9±0,34 в трепан-биоптатах до 2,24±0,35 в операционном материале (p 0,05); для CD34: 6,88±1,07 и 2,75±0,72, соответственно (p 0,05). В контрольной группе микрососудистая плотность составляла для CD31: 6,54±0,89 в трепан-биоптатах и 4,1±0,59 в операционном материале (p 0,05); для CD34: 5,81±0,52 в трепан-биоптатах и 3,88±0,41 в операционном материале (p 0,05). Антиангиогенный эффект был более выражен при применении комбинации цитостатиков с рекомбинантным фактором некроза опухоли-тимозин-1.
При морфологическом исследовании образцов тканей больных основной группы в трепан-биоптатах по сравнению с операционным материалом процент VEGF, EGFR был выше. Изменение VEGF, EGFR представлено в таблице 10 и на рисунках 31 и 32.
При морфологическом исследовании в биоптатах рака молочной железы была выявлена лимфоцитарная инфильтрация различной степени выраженности, от незначительной до более выраженной. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к субпопуляциям Т-лимфоцитов: Т-хелперам (CD4, CD3) и Т-цитотоксическими (CD8) лимфоцитами, а также В-лимфоцитами CD20, что дало возможность оценить состав иммунокомпетентных клеток, входящих в лимфоцитарный инфильтрат.
Результаты ИГХ-исследования выявили ряд общих черт для опухолей сравниваемых групп.
В биоптатах опухолей без лечения было отмечено преобладание среди иммунокомпетентных клеток, присутствующих в опухоли CD4 лимфоцитов над CD8 и CD3 клетками. В-лимфоциты были обнаружены в виде единичных клеток и немногочисленных скоплений. CD4+ и CD3+ лимфоциты определялись в виде скоплений. Инфильтрация CD8+ лимфоцитами опухолевой ткани представлена одиночно расположенными клетками.
При исследовании операционного материала у больных основной группы с выявленной второй степенью патоморфоза отмечалось в лимфоидном инфильтрате преобладание CD8+ клеток, а уровень CD4+ лимфоцитов существенно не менялся. Что свидетельствует о достаточно высоком уровне локального иммунного ответа на опухоль.
У больных основной групп с 3-4 степень патоморфоза опухоли под действием ХТ и рекомбинантного фактора некроза опухоли-тимозин-1, введенного перитуморально, лимфоцитарная инфильтрация была плохо выражена, почти отсутствовала. Лишь в единичных наблюдениях можно было видеть лимфоциты (рисунок 35).
Изменение адаптационных реакций организма больных раком молочной железы iib-iiib стадии под влиянием неоадъювантной химиотерапии с применением и без применения рекомбинантного фно-т
То есть, концентрация ФНО-альфа в материале (кровь, опухоль и перитуморальная зона), взятом для исследования спустя 2-3 недели после последнего введения исследуемого препарата может свидетельствовать лишь о последствиях его применения. Столь непродолжительное время пребывания препарата в организме определило частоту его введения, 5 дней подряд, для поддержания требуемой концентрации ФНО-Т в организме. А перитуморальное его применение обеспечивает минимальные потери препарата в периоде всасывания и направлено на создание максимальной концентрации иммунного препарата в зоне опухоли.
Выявленная тенденция к снижению уровня ФНО-альфа может косвенно свидетельствовать о том, что создаваемая искусственно высокая концентрация ФНО-Т вокруг опухоли, по принципу обратной связи может в какой-то степени подавлять синтез эндогенного ФНО-альфа.
С другой стороны, более высокое содержание ФНО-альфа в группе контроля может быть результатом воспалительного процесса в перитуморальной зоне, возникающем в ответ на опухоль. Как следствие, увеличивается инфильтрация перитуморальной зоны лимфоцитами, макрофагами и эозинофилами, и повышается синтез эндогенного ФНО-альфа. По результатам оценки содержания маркера СА 15-3 отмечено, что применение рекомбинантного ФНО-Т в сочетании с цитостатиками способствует снижению уровня специфичного для рака молочной железы маркера СА 15-3 в крови (с 26,03±3,24 ед/мл до 16,96±2,58 ед/мл, p 0,05). Эта же зависимость присутствует как при применении режима РА + ФНО-Т (с 25,22±4,73 ед/мл до 20,34±1,73 ед/мл, p 0,05), так и при использовании комбинации FAC + ФНО-Т (с 27,23±2,82 ед/мл до 20,34±1,73 ед/мл, p 0,05). Изменение уровня РЭА в контрольной группе было статистически не значимо.
Была проанализирована динамика гистологических и иммуногистохимических изменений в опухоли больных сравниваемых групп. В основной группе больных с применением комбинации цитостатиков с иммунным препаратом отмечалось статистически достоверное увеличение числа наблюдений лечебного патоморфоза III-IV степени, по сравнению с контрольной группой: 33,2% и 17,34% случаев соответственно (p 0,05).
При морфологическом исследовании образцов тканей больных основной группы в трепан-биоптатах по сравнению с операционным материалом процент выявления положительной экспрессии VEGF, EGFR был выше. Установлено, что у больных под действием проводимой химиотерапии в сочетании с рекомбинантным ФНО-Т микроциркуляторная плотность в поле зрения для CD31+ снижалась с 5,9±0,34 в трепан-биоптатах до 2,24±0,35 в операционном материале (p 0.05); для CD34+: 6,88±1,07 и 2,75±0,72 соответственно (p 0.05). В контрольной группе микрососудистая плотность составляла для CD31+: 9,54±0,89 в трепан-биоптатах и 5,1±0,59 в операционном материале (p 0.05); для CD34+: 8,2±0,52 в трепан-биоптатах и 4,08±0,41 в операционном материале (p 0.05). Антиангиогенный эффект был более выражен при применении комбинации цитостатиков с рекомбинантным ФНО-Т.
В биоптатах опухолей без лечения было отмечено преобладание среди иммунокомпетентных клеток, присутствующих в опухоли CD4+ лимфоцитов над CD8+ и CD3+ клетками. В-лимфоциты были обнаружены в виде единичных клеток и немногочисленных скоплений. CD4+ и CD3+ лимфоциты определялись в виде скоплений. Инфильтрация CD8+ лимфоцитами опухолевой ткани представлена одиночно расположенными клетками.
При исследовании операционного материала у больных основной группы с выявленной второй степенью патоморфоза отмечалось в лимфоидном инфильтрате преобладание CD8+ клеток, а уровень CD4+ лимфоцитов существенно не менялся. Что свидетельствует о достаточно высоком уровне локального иммунного ответа на опухоль.
У больных основной групп с 3-4 степень патоморфоза опухоли под действием ХТ и рекомбинантного ФНО-Т, введенного перитуморально, лимфоцитарная инфильтрация была плохо выражена, почти отсутствовала. Лишь в единичных наблюдениях можно было видеть лимфоциты. В наблюдениях с сохраненной опухолевой тканью определялась лимфоцитарная инфильтрация различной степени выраженности.
У больных основной группы с 3-4 степенью патоморфоза опухоли под действием ХТ и рекомбинантного ФНО-Т, введенного перитуморально, лимфоцитарная инфильтрация была плохо выражена, почти отсутствовала.
Анализ адаптационных реакций по итогам 2-го курса НАХТ в группе с применением режима FAC + рекомбинантный ФНО-Т показал статистически значимое уменьшение стрессорных реакций (почти в 3 раза с 20% до 7,7%, p 0.05). В 1,5 раза снизилась частота развития реакции тренировки по сравнению с исходными показателями. Доля реакций спокойной активации преобладала в структуре антистрессорных реакций и достигла 46,1%, что в 1,5 раза больше, чем до лечения (p 0.05). При этом уровень реакций повышенной активации снизился почти в 1,5 раза в динамике по сравнению с первым курсом неоадъювантной ХТ. Реакция переактивации не выявлялась, что свидетельствует о стабилизации высокого уровня защитно-компенсаторных механизмов и создании условий для поддержания противоопухолевого эффекта.
Коэффициент соотношения АС/С в группе с применением комбинации режима FAC и рекомбинантного ФНО-Т увеличился в 3,6 раза, что статистически значимо (p 0.05) по сравнению с исходными данными (3,5). В то же время в группе с применением комбинации режима РА с исследуемым препаратом была отмечена позитивная тенденция к увеличению коэффициента соотношения АС/С в 1,4 раза от 2,4 после 1-го курса НАХТ до 3,3 после 2-го курса неоадъювантной химиотерапии.
Для оценки эффективности неоадъюванетной терапии больных РМЖ IIB-IIIB стадии были проанализированы кривые безрецидивной выживаемости, рассчитанные методом Kaplan-Meier. Различия между группами определялись методом Log-rank test. Медиана наблюдения в основной группе составила 35,6 ± 1,2 месяцев, в группе сравнения – 34,1 ± 1,1 месяцев. Была выявлена отчетливая тенденция к увеличению показателей 3-летней безрецидивной выживаемости на 20%, которая в группе НАХТ с рекомбинантным ФНО-Т достигла 83% по сравнению с контрольной группой, где она равняется 63%. Log-rank test p = 0,0477. В общей выживаемости существенных отличий между группами выявлено не было.
Таким образом, можно констатировать факт, что применение НАХТ с рекомбинантным ФНО-Т позитивно влияет на безрецидивную выживаемость пациентов с РМЖ, и позволяет считать целесообразным применение разработанной нами методики.
На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что вновь разработанная и впервые примененная в клинике в лечении больных раком молочной железы IIB-IIIB стадии методика с перитуморальным введением отечественного рекомбинантного фактора некроза опухоли-тимозина--1 обладает хорошей переносимостью, позволяет увеличить эффективность терапии больных раком молочной железы IIB-IIIB стадии, снизить частоту и степень выраженности системных побочных реакций, сократить сроки предоперационной терапии, а также оказывает иммунопротекторное действие на В-клеточное звено иммунной системы больных и достоверно повышает уровень CD3+CD8+ клеток. Увеличение объективного ответа опухоли на лечение и показателей безрецидивной выживаемости в основной группе по сравнению с контролем коррелирует со снижением уровня специфичного для рака молочной железы маркера СА 15-3 в крови.